酞菁染料偶联物的制造方法及稳定偶联物与流程

酞菁染料偶联物的制造方法及稳定偶联物
1.本技术要求2015年8月18日提交的、名称为“酞菁染料－大分子偶联物的制造方法及稳定偶联物”的美国临时专利申请第62/206,774号的优先权，通过引用将其全部内容纳入本文。
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技术领域
4.在一些方面，本发明涉及一种含有酞菁染料的偶联物的制造方法，该方法包括制备或制造偶联物、配制偶联物、将偶联物包装起来用于储存的一个或多个步骤。在一些方面，所述制造方法可产生稳定偶联物。在一些方面，本发明还涉及稳定的酞菁染料偶联物、含有所述稳定偶联物的组合物和制品、以及将它们给予光免疫疗法的对象的方法。在一些实施方式中，所述酞菁染料偶联物与抗体之类的靶向性分子偶联，该靶向性分子例如通过与细胞表面蛋白结合来将偶联物靶向至细胞或病原体。


背景技术：

5.多种疗法可用来治疗癌症之类的疾病。例如，光免疫疗法(pit)是使用与抗体或其它靶向性分子偶联的光敏剂来靶向细胞表面受体之类的细胞表面靶分子、从而实现特定细胞的靶向杀伤的方法。在一些情况下，pit可选择性地靶向肿瘤细胞之类的疾病细胞，从而选择性地杀伤这些细胞而不伤及健康细胞。需要改良策略来改良用于该方法的酞菁染料偶联物，例如在用于pit时使光降解最小化或避免光降解并改善偶联物的活性。本发明提供满足这些要求的方法和偶联物。


技术实现要素：

6.在一些实施方式中，提供酞菁染料偶联物的制造方法。在一些实施方式中，所述方法包括在制造含有与所述靶向性分子连接、如共价结合的酞菁染料的偶联物的条件下，将诸如大分子的靶向性分子与酞菁染料接触，在一些情况下，所述酞菁染料含有反应性化学基团。在一些实施方式中，所述方法包括在药学上可接受的缓冲液中配制所述偶联物。在一些实施方式中，在制备所述偶联物之前、之时和/或之后，所述染料和偶联物所暴露的光仅具有约400纳米(nm)～约650纳米(nm)范围内的波长。在一些实施方式中，在制备所述偶联物之前、之时和/或之后，如在所述接触步骤和/或配制步骤中，所述染料和偶联物所暴露的光仅具有小于500勒克斯的强度。
7.在一些实施方式中，所述方法包括将靶向性分子与酞菁染料以染料比靶向性分子为约1:1～1000:1的摩尔比接触。在一些实施方式中，所述染料在制造含有与所述靶向性分子的连接基团共价连接的酞菁染料的偶联物的条件下包含反应性化学基团。在一些实施方
式中，所述方法包括在药学上可接受的缓冲液中将所述偶联物配制成约0.01毫克/毫升(mg/ml)～1000.0毫克/毫升(mg/ml)的浓度。在一些实施方式中，在制备所述偶联物之前、之时和/或之后，如在所述接触步骤和/或配制步骤中，所述染料和偶联物所暴露的光仅具有小于500勒克斯的强度。
8.在一些实施方式中，所述偶联物配制成约0.01mg/ml～约200.0mg/ml或约0.5mg/ml～约10.0mg/ml的浓度。在一些实施方式中，所述偶联物配制成约0.5mg/ml～约5.0mg/ml的浓度。
9.在一些实施方式中，在所述接触步骤之前，在所述染料所暴露的光仅具有约400nm～约650nm范围内的波长的条件下，将所述酞菁染料溶解于溶剂。在一些实施方式中，所述染料在溶解于溶剂之时或之后所暴露的光仅具有小于500勒克斯的强度。在一些实施方式中，所述染料以约0.1mg/ml～约100mg/ml范围内的浓度溶解于溶剂。在一些实施方式中，所述染料以约1mg/ml～约50mg/ml的浓度溶解于溶剂。在一些实施方式中，所述酞菁染料在溶剂中的浓度为约10mg/ml。在一些实施方式中，所述溶剂是二甲亚砜(dmso)或dmf和水基溶剂。
10.在一些实施方式中，所述配制步骤包括浓缩所述偶联物。
11.在一些实施方式中，所述接触步骤进行至少5分钟、至少15分钟、至少30分钟、至少60分钟、至少90分钟、至少120分钟、至少240分钟、至少360分钟、至少24小时、至少72小时或至少120小时。在一些实施方式中，所述接触步骤进行5分钟～150小时、5分钟～100小时、5分钟～48小时、5分钟～24小时、5分钟～6小时、5分钟～2小时、5分钟～90分钟、5分钟～60分钟、5分钟～30分钟、30分钟～150小时、30分钟～100小时、30分钟～48小时、30分钟～24小时、30分钟～6小时、30分钟～2小时、30分钟～90分钟、30分钟～60分钟、60分钟～150小时、60分钟～100小时、60分钟～48小时、60分钟～24小时、60分钟～6小时、60分钟～2小时、60分钟～90分钟、90分钟～150小时、90分钟～100小时、90分钟～48小时、90分钟～24小时、90分钟～6小时、90分钟～2小时、2小时～150小时、2小时～100小时、2小时～48小时、2小时～24小时、2小时～6小时、6小时～150小时、6小时～100小时、6小时～48小时、6小时～24小时、24小时～150小时、24小时～100小时、24小时～48小时、48小时～150小时、48小时～100小时或100小时～150小时。在一些实施方式中，所述接触步骤在约4℃～约37℃的温度下进行。在一些实施方式中，所述接触步骤在约25℃
±
2.0℃、25℃
±
1.0℃或25℃
±
0.3℃的温度下进行。
12.在一些实施方式中，所述酞菁染料与所述靶向性分子共价或非共价连接。在一些实施方式中，所述酞菁染料含有反应性化学基团，且通过将所述酞菁染料与靶向性分子接触，制得的偶联物含有与所述靶向性分子的连接基团共价结合的酞菁染料。
13.在一些实施方式中，所述方法还包括将所述偶联物骤冷来除去未偶联的染料。在一些实施方式中，所述偶联物在所述骤冷步骤中所暴露的光仅具有约400nm～约650nm范围内的波长。在一些实施方式中，所述偶联物在所述骤冷步骤中所暴露的光仅具有小于500勒克斯的强度。
14.在一些实施方式中，所述配制步骤包括超滤、渗滤或透析。在一些实施方式中，所述方法还包括所述偶联物的无菌过滤。
15.在一些实施方式中，所述方法包括将所述偶联物包装在例如一个或多个避光容器
内。在一些实施方式中，所述偶联物在所述包装步骤中所暴露的光仅具有约400nm～约650nm范围内的波长。在一些实施方式中，所述染料和偶联物在所述包装步骤中所暴露的光仅具有小于500勒克斯的强度。
16.在一些实施方式中，所述方法包括将酞菁染料以约0.1～100mg/ml的浓度溶解于溶剂，在一些情况下，所述酞菁染料含有反应性化学基团。在一些实施方式中，所述方法还包括在制造含有与靶向性分子连接、如共价结合的酞菁染料的偶联物的条件下，将所述靶向性分子与酞菁染料以染料比靶向性分子为1:1～1000:1的摩尔比接触。在一些实施方式中，所述方法还包括在药学上可接受的缓冲液中将所述偶联物配制成约0.01～1000.0mg/ml的浓度。在一些实施方式中，所述方法还包括将所述偶联物包装在一个或多个避光容器内。在一些实施方式中，在所述方法的例如溶解、接触、配制和包装步骤之前、之时和/或之后，所述染料和偶联物所暴露的光仅具有约400nm～约650nm范围内的波长，或者所述染料和偶联物所暴露的光仅具有小于500勒克斯的强度。
17.在一些实施方式中，提供酞菁染料－靶向性分子偶联物的制造方法，其包括：a)将酞菁染料以约0.1～100mg/ml的浓度溶解于溶剂；b)在制造含有与靶向性分子连接的酞菁染料的偶联物的条件下，将所述靶向性分子与所述酞菁染料以染料比靶向性分子为1:1～1000:1的摩尔比接触；c)在药学上可接受的缓冲液中将所述偶联物配制成约0.01～约200.0mg/ml的浓度；以及d)将所述偶联物包装在一个或多个避光容器内；其中，在a)～d)的各步骤中：所述染料和偶联物所暴露的光仅具有约400nm～约650nm范围内的波长，或者所述染料和偶联物所暴露的光仅具有小于500勒克斯的强度。
18.在以上任一些实施方式中，所述酞菁染料与所述靶向性分子共价或非共价连接。在以上任一些实施方式中，所述酞菁染料包含反应性化学基团，且通过将所述酞菁染料与靶向性分子接触，制得的偶联物含有与所述靶向性分子的连接基团共价结合的酞菁染料。
19.在一些实施方式中，在所提供的方法的步骤中，所述染料和偶联物在任何光下的总暴露量不超过5000勒克斯小时、不超过2500勒克斯小时、不超过1000勒克斯小时、不超过500勒克斯小时、不超过250勒克斯小时、不超过100勒克斯小时或不超过80勒克斯小时。在一些实施方式中，在所提供的方法的包装步骤中，所述偶联物在任何光下的总暴露量不超过5000勒克斯小时、不超过2500勒克斯小时、不超过1000勒克斯小时、不超过500勒克斯小时、不超过250勒克斯小时、不超过100勒克斯小时或不超过80勒克斯小时。
20.在一些实施方式中，所述染料的最大吸收波长为约600nm～约850nm。在一些实施方式中，所述染料的最大吸收波长为约650nm～约850nm。在一些实施方式中，所述染料的最大吸收波长为约680nm～约850nm。
21.在一些实施方式中，所述酞菁染料含有下式的化合物：
22.其中：
23.l是接头；
24.q是用于将染料与靶向性分子连接的反应性基团；
25.r2、r3、r7和r8各自独立地选自任选取代的烷基和任选取代的芳基；
26.r4、r5、r6、r9、r
10
和r
11
各自独立地选自氢、任选取代的烷基、任选取代的烷酰基、任选取代的烷氧基羰基、任选取代的烷基氨基甲酰基和螯合配体，其中，r4、r5、r6、r9、r
10
和r
11
中的至少一个包含水溶性基团；
27.r
12
、r
13
、r
14
、r
15
、r
16
、r
17
、r
18
、r
19
、r
20
、r
21
、r
22
和r
23
各自独立地选自氢、卤素、任选取代的烷硫基、任选取代的烷基氨基和任选取代的烷氧基；并且
28.x2和x3各自独立地是c1～c
10
亚烷基，任选地被杂原子隔开。
29.在一些实施方式中，所述酞菁染料包含下式的化合物：
30.31.其中：
32.x1和x4各自独立地是c1～c
10
亚烷基，任选地被杂原子隔开；
33.r2、r3、r7和r8各自独立地选自任选取代的烷基和任选取代的芳基；
34.r4、r5、r6、r9、r
10
和r
11
各自独立地选自氢、任选取代的烷基、任选取代的烷酰基、任选取代的烷氧基羰基、任选取代的烷基氨基甲酰基和螯合配体，其中，r4、r5、r6、r9、r
10
和r
11
中的至少一个包含水溶性基团；并且
35.r
16
、r
17
、r
18
和r
19
各自独立地选自氢、卤素、任选取代的烷硫基、任选取代的烷基氨基和任选取代的烷氧基。
36.在一些实施方式中，所述反应性基团选自胺反应性化学基团、巯基反应性化学基团、活化酯、酰基卤、烷基卤、酸酐、羧酸、碳二亚胺、碳酸酯、氨基甲酸酯、卤代乙酰胺、异氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、nhs酯、亚磷酰胺、铂络合物、磺酸酯和硫氰酸酯。在一些实施方式中，所述反应性化学基团是选自马来酰亚胺、卤代乙酰基和吡啶基二硫化物的巯基反应性化学基团。在一些实施方式中，所述酞菁染料与所述靶向性分子的赖氨酸残基共价结合。在一些实施方式中，所述反应性基团是胺反应性化学基团。在一些实施方式中，所述反应性化学基团是作为胺反应性化学基团的n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)酯。
37.在一些实施方式中，所述酞菁染料是irdye 700dx-nhs(ir700-nhs)。
38.在一些实施方式中，所述靶向性分子直接或间接地与抗原或蛋白质结合。例如，在一些实施方式中，所述靶向性分子是与第一结合性分子结合的第二结合性分子，所述第一结合性分子能够与所述抗原或蛋白质结合。在一些实施方式中，所述靶向性分子是第二抗体。
39.在一些实施方式中，所述靶向性分子与细胞或病原体表面上的细胞表面靶分子结合，所述细胞或病原体例如是干细胞、增殖性细胞、癌细胞、增生中的细胞、肿瘤细胞、炎性细胞、神经元、病原体或被病原体感染的细胞。在一些实施方式中，所述病原体选自病毒、细菌、真菌、生物膜或其它原核细胞系统。在一些实施方式中，所述细胞是癌细胞、肿瘤细胞、炎性细胞或神经元。在一些实施方式中，所述细胞存在于与疾病或病症有关的损害的微环境中。在一些实施方式中，所述损害是肿瘤，且所述细胞是癌细胞或肿瘤细胞。在一些实施方式中，所述细胞是癌症干细胞或循环肿瘤细胞。
40.在以上一些实施方式中，所述炎性细胞是白细胞，如中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞或单核细胞。在一些实施方式中，所述靶向性分子是神经元，如外周神经系统神经元或中枢神经系统神经元。在一些实施方式中，所述神经元是伤害感受器，如伤害感受器、机械性伤害感受器、化学性伤害感受器或多形性伤害感受器。在一些实施方式中，所述靶向性分子与病原体、如病毒、细菌、真菌、生物膜或其它原核细胞系统结合。在一些实施方式消肿，所述病原体是革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌。
41.在一些实施方式中，所述细胞表面靶分子包括抗原、多肽、脂质或碳水化合物、或者它们的组合。
42.在一些实施方式中，所述细胞表面靶分子选自细胞膜磷脂、原核肽聚糖、细菌细胞包膜蛋白、病毒衣壳蛋白、acthr、内皮细胞anxa-1、氨肽酶n、抗-il-6r、α-4-整联蛋白、α-5-β-3-整联蛋白、α-5-β-5-整联蛋白、甲胎蛋白(afp)、anpa、anpb、apa、apn、app、1ar、2ar、at1、b1、b2、bage1、bage2、b-细胞受体bb1、bb2、bb4、降钙素受体、癌抗原125(ca 125)、
cck1、cck2、cd5、cd10、cd11a、cd13、cd14、cd19、cd20、cd22、cd25、cd30、cd33、cd38、cd45、cd52、cd56、cd68、cd90、cd133、cd7、cd15、cd34、cd44、cd206、cd271、cea(癌胚抗原)、cgrp、趋化因子受体、细胞表面膜联蛋白-1、细胞表面网蛋白-1、cripto-1、crlr、cxcr2、cxcr4、dcc、dll3、e2糖蛋白、egfr、egfrviii、emr1、内皮唾液酸蛋白、ep2、ep4、epcam、epha2、et受体、纤连蛋白、纤连蛋白ed-b、fgfr、卷曲受体(frizzled receptors)、gage1、gage2、gage3、gage4、gage5、gage6、glp-1受体、a族(视紫红质样)的g-蛋白偶联受体、b组(分泌素受体样)的g-蛋白偶联受体、c族(代谢型谷氨酸盐受体样)的g-蛋白偶联受体、gd2、gp100、gp120、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、血凝素、硫酸肝素、her1、her2、her3、her4、hmfg、hpv 16/18和e6/e7抗原、htert、白细胞介素受体(如il-2r、il11-r、il-13r)、itgam、激肽释放酶-9、lewis y、lh受体、lhrh-r、lpa1、mac-1、mage 1、mage 2、mage 3、mage 4、mart1、mc1r、间皮素、muc1、muc16、neu(细胞表面核仁素)、脑啡肽酶、神经菌毛素-1、神经菌毛素-2、ng2、nk1、nk2、nk3、nmb-r、notch-1、ny-eso-1、ot-r、突变型p53、p97黑色素瘤抗原、ntr2、ntr3、p32(p32/gc1q-r/habp1)、p75、pac1、par1、补缀(patched)(ptch)、pdgfr、pdfg受体、pdt、蛋白酶剪切胶原iv、蛋白水解酶3、抑制素、蛋白酪氨酸激酶7、psa、psma、嘌呤能p2x家族(如p2x1-5)、突变型ras、ramp1、ramp2、ramp3补缀、ret受体、丛蛋白、平滑(smoothened)、sst1、sst2a、sst2b、sst3、sst4、sst5、p物质、tems、t细胞cd3受体、tag72、tgfbr1、tgfbr2、tie-1、tie-2、trk-a、trk-b、trk-c、tr1、trpa、trpc、trpv、trpm、trpml、trpp(如trpv1-6、trpa1、trpc1-7、trpm1-8、trpp1-5、trpml1-3)、tsh受体、vegf受体(vegfr1或flt-1、vegfr2或flk-1/kdr、及vegf-3或flt-4)、电压门控离子通道、vpac1、vpac2、维尔姆斯瘤1、y1、y2、y4和y5。
43.在一些实施方式中，所述细胞表面靶分子选自her1/egfr、her2/erbb2、cd20、cd25(il-2rα受体)、cd33、cd52、cd133、cd206、cea、ceacam1、ceacam3、ceacam5、ceacam6、癌抗原125(ca125)、甲胎蛋白(afp)、lewis y、tag72、caprin-1、间皮素、pdgf受体、pd-1、pd-l1、ctla-4、il-2受体、血管内皮生长因子(vegf)、cd30、epcam、epha2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、gpa33、粘蛋白、caix、psma、叶酸盐结合蛋白、神经节苷脂(如gd2、gd3、gm1和gm2)、vegf受体(vegfr)、vegfr2、vegf-a、整联蛋白αvβ3、整联蛋白α5β1、erbb3、met、igf1r、epha3、trailr1、trailr2、rankl、fap、生腱蛋白、afp、bcr复合物、cd3、cd18、cd44、ctla-4、gp72、hla-dr 10β、hla-dr抗原、ige、muc-1、nuc242、pem抗原、金属蛋白酶、蝶素(ephrin)受体、蝶素配体、hgf受体、cxcr4、cxcr4、铃蟾肽受体、sk-1抗原、bcr-abl、ret、met、trkb、tie2、alk、ros、eml4-alk、ros1、brafv600e、src、c-kit、pdgfr、mtor、tsc1、tsc2、btk、kit、brca、cdk 4/6、jak1、jak2、braf、flt-3、mek1、mek2和smo。在一些实施方式中，所述细胞表面靶分子是her1/egfr、her2、pd-l1、cd25、epcam、epha2、cd206、cd20、cd44、cd133、间皮素、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3或癌胚抗原(cea)。
44.在一些实施方式中，所述靶向性分子的至少一部分是蛋白质、糖蛋白、抗体、抗体片段、抗原、抗原结合片段、肽、多肽、组织归巢肽、小分子、聚合物合成分子、聚合物纳米颗粒、脂质体、酶底物、激素、神经递质、细胞代谢物、病毒颗粒、病毒衣壳、病毒纳米颗粒、细菌颗粒、标记物、细胞、半抗原、亲和素、链霉亲和素、单体链霉亲和素、生物素、碳水化合物、寡糖、多糖、核酸、脱氧核酸、dna片段、rna片段、适体、核苷酸三磷酸、无环鸟苷终止子三磷酸或pna、或它们的组合。
45.在一些实施方式中，所述靶向性分子是组织特异性归巢肽。在一些实施方式中，所
述归巢肽具有seq id no：1～52中任一项所列的氨基酸序列。
46.在一些实施方式中，所述靶向性分子是rgd多肽、irgd多肽、lyp-1多肽、cripto-1结合多肽、促生长素抑制素受体结合多肽、抑制素结合多肽、ngr多肽、ingr多肽或可激活细胞穿透肽(acpp)，该可激活细胞穿透肽由聚阳离子细胞穿透肽(cpp)通过可切割接头与中和性聚阴离子连接而构成。
47.在一些实施方式中，所述acpp包括结构：a-x1-b-，其中，b是约5～约20个碱性氨基酸残基的肽部分，适合于细胞摄取；a是约2～约20个酸性氨基酸残基的肽部分，当其与b部分连接时能有效地抑制或防止b部分的细胞摄取；x1是约2～约100个原子的可切割接头；并且有一个或多个l-y连接在肽部分b的c-末端。
48.在一些实施方式中，所述靶向性分子选自促肾上腺皮质激素(acth)、血管紧张素ii、心房钠尿因子(anf)、铃蟾肽、缓激肽、脑源性神经营养因子(bdnf)、骨形态发生蛋白2(bmp-2)、骨形态发生蛋白6(bmp-6)、骨形态发生蛋白7(bmp-7)、降钙素、心肌营养素1(bmp-2)、cd22、cd40、胆囊收缩素(cck)、睫状节神经细胞营养因子(cntf)、ccl1-ccl28、cxcl1-cxcl17、xcl1、xcl2、cx3cl1、cripto 1结合肽、血管内皮细胞生长因子(vegf)、表皮生长因子(egf)、内皮素1、内皮素1/3、fas配体、成纤维细胞生长因子1(fgf-1)、成纤维细胞生长因子2(fgf-2)、成纤维细胞生长因子4(fgf-4)、成纤维细胞生长因子5(fgf-5)、成纤维细胞生长因子6(fgf-6)、成纤维细胞生长因子7(fgf-7)、成纤维细胞生长因子10(fgf-10)、flt-3、胃泌素、胃泌素释放肽(grp)、粒细胞集落刺激因子(g-csf)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、胰高血糖素样肽(glp-1)、肝细胞生长因子(hgf)、α干扰素(ifn-a)、β干扰素(ifn-b)、γ干扰素(ifng)、胰岛素样生长因子1(igf-1)、胰岛素样生长因子2(igf-2)、白细胞介素1(il-1)、白细胞介素2(il-2)、白细胞介素3(il-3)、白细胞介素4(il-4)、白细胞介素5(il-5)、白细胞介素6(il-6)、白细胞介素7(il-7)、白细胞介素8(il-8)、白细胞介素9(il-9)、白细胞介素10(il-10)、白细胞介素11(il-11)、白细胞介素12(il-12)、白细胞介素13(il-13)、白细胞介素15(il-15)、白细胞介素17(il-17)、白细胞介素19(il-19)、黄体生成素(lh)、黄体生成素释放激素(lhrh)、巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)、单核细胞趋化蛋白1(mcp-1)、巨噬细胞炎性蛋白3a(mip-3a)、巨噬细胞炎性蛋白3b(mip-3b)、神经生长因子(ngf)、神经介素b、神经营养因子3(nt-3)、神经营养因子4(nt-4)、神经降压素、神经肽y、催产素、垂体腺苷酸环化酶激活肽(pacap)、血小板衍生生长因子aa(pdgf-aa)、血小板衍生生长因子ab(pdgf-ab)、血小板衍生生长因子bb(pdgf-bb)、血小板衍生生长因子cc(pdgf-cc)、血小板衍生生长因子dd(pdgf-dd)、导蛋白-1(ntn1)、导蛋白-2(ntn2)、导蛋白-4(ntn4)、导蛋白-g1(ntng1)和导蛋白-g2(ntng2)、蝶素a1(efna1)、蝶素a2(efna2)、蝶素a3(efna3)、蝶素a4(efna4)、蝶素a5(efna5)、脑信号蛋白3a(sema3a)、脑信号蛋白3b(sema3b)、脑信号蛋白3c(sema3c)、脑信号蛋白3d(sema3d)、脑信号蛋白3f(sema3f)、脑信号蛋白3g(sema3g)、脑信号蛋白4a(sema4a)、脑信号蛋白4b(sema4b)、脑信号蛋白4c(sema4c)、脑信号蛋白4d(sema4d)、脑信号蛋白4f(sema4f)、脑信号蛋白4g(sema4g)、脑信号蛋白5a(sema5a)、脑信号蛋白5b(sema5b)、脑信号蛋白6a(sema6a)、脑信号蛋白6b(sema6b)、脑信号蛋白6d(sema6d)、脑信号蛋白7a(sema7a)、slit1、slit2、slit3、slit和ntrk样家族成员1(slitrk1)、slit和ntrk样家族成员2(slitrk2)、slit和ntrk样家族成员3(slitrk3)、slit和ntrk样家族成员4(slitrk4)、slit和ntrk样家族成员5(slitrk5)、slit
和ntrk样家族成员6(slitrk6)、前列腺素e2(pge2)、rantes、促生长素抑制素-14、促生长素抑制素-28、干细胞因子(scf)、基质细胞衍生因子1(sdf-1)、p物质、促甲状腺激素(tsh)、转化生长因子α(tgf-α)、转化生长因子β(tgf-b)、肿瘤坏死因子α(tnf-α)、凝血酶、血管活性肠肽(vip)、wntl、wnt2、wnt2b/13、wnt3、wnt3a、wnt4、wnt5a、wnt5b、wnt6、wnt7a、wnt7b、wnt7c、wnt8、wnt8a、wnt8b、wnt8c、wntl0a、wntl0b、wnt11、wnt14、wnt15或wnt16、音猬因子(sonic hedgehog)、沙漠刺猬因子(desert hedgehog)和印度刺猬因子(indian hedgehog)。
49.在一些实施方式中，所述靶向性分子是抗体或抗体片段。
50.在一些实施方式中，所述抗体是西妥昔单抗、帕尼单抗、扎卢木单抗、尼妥珠单抗、曲妥珠单抗、ado-曲妥珠单抗美坦新、托西莫单抗曲妥珠单抗美坦新、托西莫单抗利妥昔单抗(rituxan、mabthera)、替伊莫单抗(zevalin)、达珠单抗(zenapax)、吉姆单抗(mylotarg)、阿仑单抗、cea-扫描fab片段、oc125单克隆抗体、ab75705、b72.3、贝伐单抗阿法替尼、阿西替尼、博舒替尼、卡博替尼、色瑞替尼、克唑替尼、达拉非尼、达沙替尼、埃罗替尼、依维莫司、依鲁替尼、伊马替尼、拉帕替尼、乐伐替尼、尼洛替尼、奥拉帕尼、帕博西尼、帕唑帕尼、帕妥珠单抗、雷莫芦单抗、瑞格非尼、鲁索替尼、索拉非尼、舒尼替尼、坦西莫司、曲美替尼、凡德他尼、维罗非尼、维莫德吉、巴利昔单抗、伊匹单抗、纳武单抗、派姆单抗、mpdl3280a、皮地利珠单抗(pidilizumab)(ct-011)、amp-224、msb001078c或medi4736，或者是其抗原结合片段。在一些实施方式中，所述抗体与细胞表面靶分子、如her1/egfr、her2、pd-l1、cd25、epcam、epha2、cd206、cd20、cd44、cd133、间皮素、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3或癌胚抗原(cea)结合。在一些实施方式中，所述抗体是西妥昔单抗、帕尼单抗、曲妥珠单抗、bms-935559、medi4736、mpdl3280a或msb0010718c，或者是其抗原结合片段。
51.在一些实施方式中，所述染料－靶向性分子偶联物是西妥昔单抗-ir700、帕尼单抗-ir700、曲妥珠单抗-ir700、bms-935559-ir700、medi4736-ir700、mpdl3280a-ir700或msb0010718c-ir700。
52.在一些实施方式中，所述靶向性分子与所述酞菁染料以染料比靶向性分子为1:1～100:1或1:1～10:1的摩尔比接触。在一些实施方式中，染料比靶向性分子的摩尔比至少为约4:1或至少为约10:1。在一些实施方式中，所述偶联物相对于每一个靶向性分子包含约1～约1000个酞菁染料分子、约1～约10个酞菁染料分子或约2～约5个酞菁染料分子。
53.在一些实施方式中，所述偶联物在例如药学上可接受的缓冲液中配制成约1.0～约5.0mg/ml的浓度。在一些实施方式中，所述药学上可接受的缓冲液是磷酸盐缓冲盐水。在一些实施方式中，所述药学上可接受的缓冲液具有约ph 6.0～约ph 8.0的ph。在一些实施方式中，所述偶联物在多于3个月的时间内稳定，多于90％的所述偶联物作为主要单体成分存在。在一些实施方式中，如果所述偶联物与储存前的偶联物相比在多于3个月的时间内保持大于约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高的效价、活性或纯度，则所述偶联物在这段时间内是稳定的。在一些实施方式中，如果多于90％的所述偶联物作为主要单体成分存在，则所述偶联物是稳定的。在一些实施方式中，所述药学上可接受的缓冲液具有约ph 6.8～约ph 7.4的ph。
54.在一些实施方式中，所述染料和偶联物所暴露的光仅具有约425nm～约575nm范围内的波长。在一些实施方式中，所述染料和偶联物所暴露的光仅具有小于200勒克斯的强
度。
55.在一些实施方式中，包含所述偶联物的所述容器确保具有约250nm～约800nm、约250nm～约450nm、约400nm～约800nm、约450nm～约650nm或约600nm～约720nm的波长的光不透过。在一些实施方式中，容器确保光不透过，使得所述容器的透光率百分数小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％或小于5％。在一些实施方式中，所述容器是绿色、蓝色、琥珀色、半透明、不透明、或包在不透明的箔中。在一些实施方式中，所述容器是绿色、蓝色、琥珀色、半透明、不透明、或用具有小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％或小于5％的透光率的材料覆盖。在本发明提供的方法的一些实施方式中，所述容器选自药瓶、管子、注射器、包、袋子和盒子。
56.在一些实施方式中，所述避光容器是第一避光容器，且所述方法还包括将所述第一避光容器包装在第二避光容器内。在一些实施方式中，所述第二容器确保具有约250nm～约800nm、约250nm～约450nm、约400nm～约800nm、约450nm～约650nm或约600nm～约720nm的波长的光不透过。在一些实施方式中，所述第二容器确保光不透过，使得透光率百分数小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％或小于5％。在一些实施方式中，所述第二容器是绿色、蓝色、琥珀色、半透明、不透明、或用具有小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％或小于5％的透光率的材料覆盖。在一些实施方式中，所述第二容器选自药瓶、管子、注射器、包、袋子和盒子。
57.在一些实施方式中，本发明提供的方法还包括将所述第二容器包装在第三避光容器内。在一些实施方式中，所述第三容器确保具有约250nm～约800nm、约250nm～约450nm、约400nm～约800nm、约450nm～约650nm或约600nm～约720nm的波长的光不透过。在一些实施方式中，所述第三容器确保光不透过，使得透光率百分数小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％或小于5％。在一些实施方式中，所述第三容器是绿色、蓝色、琥珀色、半透明、不透明、或用具有小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％或小于5％的透光率的材料覆盖。在一些实施方式中，所述第三容器选自药瓶、管子、注射器、包、袋子和盒子。
58.在一些实施方式中，通过所述方法制造的偶联物的量多于约1克、多于约2克、多于约3克、多于约4克、多于约5克或多于约10克。在一些实施方式中，所述偶联物用药品生产质量管理规范(gmp)制造。
59.在一些实施方式中，提供通过本文所述的方法制造、配制或包装的偶联物。在一些实施方式中，所述偶联物在多于3个月的时间内稳定，例如多于90％的所述偶联物作为主要单体成分存在。
60.在一些实施方式中，提供含有与靶向性分子连接的酞菁染料的稳定偶联物。在一些实施方式中，所述稳定偶联物在多于3个月的时间内稳定，例如多于90％的所述偶联物作为主要单体成分存在。
61.在一些实施方式中，如果所述偶联物与储存前的偶联物相比在多于3个月的时间内保持大于约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高的效价、活性或纯度，则所述偶联物在这段时间内是稳定的。在一些实施方式中，如果多于90％的所述偶联物或稳定偶联物作为主要单体成分存在，则所述偶联物是稳定的。在一些实施方式中，如果多于95％的所述偶联物或稳定偶联物作为主要单体成分存在，则所述偶联物是稳定的。在一些实施方
式中，所述偶联物或稳定偶联物在多于6个月或多于12个月的时间内稳定。在一些实施方式中，所述偶联物或稳定偶联物在低于30℃的温度下稳定。
62.在一些实施方式中，所述酞菁染料包含在含有下式的化合物的稳定偶联物中：
63.其中：
64.l是接头；
65.q是用于将染料与靶向性分子连接的反应性基团；
66.r2、r3、r7和r8各自独立地选自任选取代的烷基和任选取代的芳基；
67.r4、r5、r6、r9、r
10
和r
11
各自独立地选自氢、任选取代的烷基、任选取代的烷酰基、任选取代的烷氧基羰基、任选取代的烷基氨基甲酰基和螯合配体，其中，r4、r5、r6、r9、r
10
和r
11
中的至少一个包含水溶性基团；
68.r
12
、r
13
、r
14
、r
15
、r
16
、r
17
、r
18
、r
19
、r
20
、r
21
、r
22
和r
23
各自独立地选自氢、卤素、任选取代的烷硫基、任选取代的烷基氨基和任选取代的烷氧基；并且
69.x2和x3各自独立地是c1～c
10
亚烷基，任选地被杂原子隔开。
70.在一些实施方式中，所述含有酞菁染料的稳定偶联物包含下式的化合物：
β-3-整联蛋白、α-5-β-5-整联蛋白、甲胎蛋白(afp)、anpa、anpb、apa、apn、app、1ar、2ar、at1、b1、b2、bage1、bage2、b-细胞受体bb1、bb2、bb4、降钙素受体、癌抗原125(ca 125)、cck1、cck2、cd5、cd10、cd11a、cd13、cd14、cd19、cd20、cd22、cd25、cd30、cd33、cd38、cd45、cd52、cd56、cd68、cd90、cd133、cd7、cd15、cd34、cd44、cd206、cd271、cea(癌胚抗原)、cgrp、趋化因子受体、细胞表面膜联蛋白-1、细胞表面网蛋白-1、cripto-1、crlr、cxcr2、cxcr4、dcc、dll3、e2糖蛋白、egfr、egfrviii、emr1、内皮唾液酸蛋白、ep2、ep4、epcam、epha2、et受体、纤连蛋白、纤连蛋白ed-b、fgfr、卷曲受体(frizzled receptors)、gage1、gage2、gage3、gage4、gage5、gage6、glp-1受体、a族(视紫红质样)的g-蛋白偶联受体、b组(分泌素受体样)的g-蛋白偶联受体、c族(代谢型谷氨酸盐受体样)的g-蛋白偶联受体、gd2、gp100、gp120、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、血凝素、硫酸肝素、her1、her2、her3、her4、hmfg、hpv 16/18和e6/e7抗原、htert、白细胞介素受体(如il-2r、il11-r、il-13r)itgam、激肽释放酶-9、lewis y、lh受体、lhrh-r、lpa1、mac-1、mage 1、mage 2、mage 3、mage 4、mart1、mc1r、间皮素、muc1、muc16、neu(细胞表面核仁素)、脑啡肽酶、神经菌毛素-1、神经菌毛素-2、ng2、nk1、nk2、nk3、nmb-r、notch-1、ny-eso-1、ot-r、突变型p53、p97黑色素瘤抗原、ntr2、ntr3、p32(p32/gc1q-r/habp1)、p75、pac1、par1、补缀(patched)(ptch)、pdgfr、pdfg受体、pdt、蛋白酶剪切胶原iv、蛋白水解酶3、抑制素、蛋白酪氨酸激酶7、psa、psma、嘌呤能p2x家族(如p2x1-5)、突变型ras、ramp1、ramp2、ramp3补缀、ret受体、丛蛋白、平滑(smoothened)、sst1、sst2a、sst2b、sst3、sst4、sst5、p物质、tems、t细胞cd3受体、tag72、tgfbr1、tgfbr2、tie-1、tie-2、trk-a、trk-b、trk-c、tr1、trpa、trpc、trpv、trpm、trpml、trpp(如trpv1-6、trpa1、trpc1-7、trpm1-8、trpp1-5、trpml1-3)、tsh受体、vegf受体(vegfr1或flt-1、vegfr2或flk-1/kdr、及vegf-3或flt-4)、电压门控离子通道、vpac1、vpac2、维尔姆斯瘤1、y1、y2、y4和y5。
82.在一些实施方式中，所述细胞表面靶分子选自her1/egfr、her2/erbb2、cd20、cd25(il-2rα受体)、cd33、cd52、cd133、cd206、cea、ceacam1、ceacam3、ceacam5、ceacam6、癌抗原125(ca125)、甲胎蛋白(afp)、lewis y、tag72、caprin-1、间皮素、pdgf受体、pd-1、pd-l1、ctla-4、il-2受体、血管内皮生长因子(vegf)、cd30、epcam、epha2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、gpa33、粘蛋白、caix、psma、叶酸盐结合蛋白、神经节苷脂(如gd2、gd3、gm1和gm2)、vegf受体(vegfr)、vegfr2、vegf-a、整联蛋白αvβ3、整联蛋白α5β1、erbb3、met、igf1r、epha3、trailr1、trailr2、rankl、fap、生腱蛋白、afp、bcr复合物、cd3、cd18、cd44、ctla-4、gp72、hla-dr 10β、hla-dr抗原、ige、muc-1、nuc242、pem抗原、金属蛋白酶、蝶素(ephrin)受体、蝶素配体、hgf受体、cxcr4、cxcr4、铃蟾肽受体、sk-1抗原、bcr-abl、ret、met、trkb、tie2、alk、ros、eml4-alk、ros1、brafv600e、src、c-kit、pdgfr、mtor、tsc1、tsc2、btk、kit、brca、cdk 4/6、jak1、jak2、braf、flt-3、mek1、mek2和smo。在一些实施方式中，所述细胞表面靶分子是her1/egfr、her2、pd-l1、cd25、epcam、epha2、cd206、cd20、cd44、cd133、间皮素、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3或癌胚抗原(cea)。
83.在一些实施方式中，所述靶向性分子的至少一部分是蛋白质、糖蛋白、抗体、抗体片段、抗原、抗原结合片段、肽、多肽、组织归巢肽、小分子、聚合物合成分子、聚合物纳米颗粒、脂质体、酶底物、激素、神经递质、细胞代谢物、病毒颗粒、病毒衣壳、病毒纳米颗粒、细菌颗粒、标记物、细胞、半抗原、亲和素、链霉亲和素、单体链霉亲和素、生物素、碳水化合物、寡糖、多糖、核酸、脱氧核酸、dna片段、rna片段、适体、核苷酸三磷酸、无环鸟苷终止子三磷酸
或pna、或它们的组合。
84.在一些实施方式中，所述靶向性分子是组织特异性归巢肽。在一些实施方式中，所述归巢肽具有seq id no：1～52中任一项所列的氨基酸序列。
85.在一些实施方式中，所述靶向性分子是rgd多肽、irgd多肽、lyp-1多肽、cripto-1结合多肽、促生长素抑制素受体结合多肽、抑制素结合多肽、ngr多肽、ingr多肽或可激活细胞穿透肽(acpp)，该可激活细胞穿透肽由聚阳离子细胞穿透肽(cpp)通过可切割接头与中和性聚阴离子连接而构成。
86.在一些实施方式中，所述acpp包括结构：a-x1-b-，其中，b是约5～约20个碱性氨基酸残基的肽部分，适合于细胞摄取；a是约2～约20个酸性氨基酸残基的肽部分，当与b部分连接时能有效地抑制或防止b部分的细胞摄取；x1是约2～约100个原子的可切割接头；并且有一个或多个l-y连接在肽部分b的c-末端。
87.在一些实施方式中，所述靶向性分子选自促肾上腺皮质激素(acth)、血管紧张素ii、心房钠尿因子(anf)、铃蟾肽、缓激肽、脑源性神经营养因子(bdnf)、骨形态发生蛋白2(bmp-2)、骨形态发生蛋白6(bmp-6)、骨形态发生蛋白7(bmp-7)、降钙素、心肌营养素1(bmp-2)、cd22、cd40、胆囊收缩素(cck)、睫状节神经细胞营养因子(cntf)、ccl1-ccl28、cxcl1-cxcl17、xcl1、xcl2、cx3cl1、cripto 1结合肽、血管内皮细胞生长因子(vegf)、表皮生长因子(egf)、内皮素1、内皮素1/3、fas配体、成纤维细胞生长因子1(fgf-1)、成纤维细胞生长因子2(fgf-2)、成纤维细胞生长因子4(fgf-4)、成纤维细胞生长因子5(fgf-5)、成纤维细胞生长因子6(fgf-6)、成纤维细胞生长因子7(fgf-7)、成纤维细胞生长因子10(fgf-10)、flt-3、胃泌素、胃泌素释放肽(grp)、粒细胞集落刺激因子(g-csf)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、胰高血糖素样肽(glp-1)、肝细胞生长因子(hgf)、α干扰素(ifn-a)、β干扰素(ifn-b)、γ干扰素(ifng)、胰岛素样生长因子1(igf-1)、胰岛素样生长因子2(igf-2)、白细胞介素1(il-1)、白细胞介素2(il-2)、白细胞介素3(il-3)、白细胞介素4(il-4)、白细胞介素5(il-5)、白细胞介素6(il-6)、白细胞介素7(il-7)、白细胞介素8(il-8)、白细胞介素9(il-9)、白细胞介素10(il-10)、白细胞介素11(il-11)、白细胞介素12(il-12)、白细胞介素13(il-13)、白细胞介素15(il-15)、白细胞介素17(il-17)、白细胞介素19(il-19)、黄体生成素(lh)、黄体生成素释放激素(lhrh)、巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)、单核细胞趋化蛋白1(mcp-1)、巨噬细胞炎性蛋白3a(mip-3a)、巨噬细胞炎性蛋白3b(mip-3b)、神经生长因子(ngf)、神经介素b、神经营养因子3(nt-3)、神经营养因子4(nt-4)、神经降压素、神经肽y、催产素、垂体腺苷酸环化酶激活肽(pacap)、血小板衍生生长因子aa(pdgf-aa)、血小板衍生生长因子ab(pdgf-ab)、血小板衍生生长因子bb(pdgf-bb)、血小板衍生生长因子cc(pdgf-cc)、血小板衍生生长因子dd(pdgf-dd)、导蛋白-1(ntn1)、导蛋白-2(ntn2)、导蛋白-4(ntn4)、导蛋白-g1(ntng1)和导蛋白-g2(ntng2)、蝶素a1(efna1)、蝶素a2(efna2)、蝶素a3(efna3)、蝶素a4(efna4)、蝶素a5(efna5)、脑信号蛋白3a(sema3a)、脑信号蛋白3b(sema3b)、脑信号蛋白3c(sema3c)、脑信号蛋白3d(sema3d)、脑信号蛋白3f(sema3f)、脑信号蛋白3g(sema3g)、脑信号蛋白4a(sema4a)、脑信号蛋白4b(sema4b)、脑信号蛋白4c(sema4c)、脑信号蛋白4d(sema4d)、脑信号蛋白4f(sema4f)、脑信号蛋白4g(sema4g)、脑信号蛋白5a(sema5a)、脑信号蛋白5b(sema5b)、脑信号蛋白6a(sema6a)、脑信号蛋白6b(sema6b)、脑信号蛋白6d(sema6d)、脑信号蛋白7a(sema7a)、slit1、slit2、slit3、slit和
ntrk样家族成员1(slitrk1)、slit和ntrk样家族成员2(slitrk2)、slit和ntrk样家族成员3(slitrk3)、slit和ntrk样家族成员4(slitrk4)、slit和ntrk样家族成员5(slitrk5)、slit和ntrk样家族成员6(slitrk6)、前列腺素e2(pge2)、rantes、促生长素抑制素-14、促生长素抑制素-28、干细胞因子(scf)、基质细胞衍生因子1(sdf-1)、p物质、促甲状腺激素(tsh)、转化生长因子α(tgf-α)、转化生长因子β(tgf-b)、肿瘤坏死因子α(tnf-α)、凝血酶、血管活性肠肽(vip)、wntl、wnt2、wnt2b/13、wnt3、wnt3a、wnt4、wnt5a、wnt5b、wnt6、wnt7a、wnt7b、wnt7c、wnt8、wnt8a、wnt8b、wnt8c、wntl0a、wntl0b、wnt11、wnt14、wnt15或wnt16、音猬因子(sonic hedgehog)、沙漠刺猬因子(desert hedgehog)和印度刺猬因子(indian hedgehog)。
88.在一些实施方式中，所述靶向性分子是抗体或抗体片段。
89.在一些实施方式中，所述抗体是西妥昔单抗、帕尼单抗、扎卢木单抗、尼妥珠单抗、曲妥珠单抗、ado-曲妥珠单抗美坦新、托西莫单抗曲妥珠单抗美坦新、托西莫单抗利妥昔单抗(rituxan、mabthera)、替伊莫单抗(zevalin)、达珠单抗(zenapax)、吉姆单抗(mylotarg)、阿仑单抗、cea-扫描fab片段、oc125单克隆抗体、ab75705、b72.3、贝伐单抗阿法替尼、阿西替尼、博舒替尼、卡博替尼、色瑞替尼、克唑替尼、达拉非尼、达沙替尼、埃罗替尼、依维莫司、依鲁替尼、伊马替尼、拉帕替尼、乐伐替尼、尼洛替尼、奥拉帕尼、帕博西尼、帕唑帕尼、帕妥珠单抗、雷莫芦单抗、瑞格非尼、鲁索替尼、索拉非尼、舒尼替尼、坦西莫司、曲美替尼、凡德他尼、维罗非尼、维莫德吉、巴利昔单抗、伊匹单抗、纳武单抗、派姆单抗、兰罗利珠单抗(lambrolizumab)、mpdl3280a、皮地利珠单抗(pidilizumab)(ct-011)、msb001078c、bms-935559或medi4736、amp-224，或者是其抗原结合片段。在一些实施方式中，所述抗体与细胞表面靶分子、如her1/egfr、her2、pd-l1、cd25、epcam、epha2、cd206、cd20、cd44、cd133、间皮素、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3或癌胚抗原(cea)结合。在一些实施方式中，所述抗体是西妥昔单抗、帕尼单抗、曲妥珠单抗、bms-935559、medi4736、mpdl3280a或msb0010718c，或者是其抗原结合片段。
90.在一些实施方式中，所述稳定的染料－靶向性分子偶联物是西妥昔单抗-ir700、帕尼单抗-ir700、曲妥珠单抗-ir700、bms-935559-ir700、medi4736-ir700、mpdl3280a-ir700或msb0010718c-ir700。
91.在一些实施方式中，所述稳定偶联物相对于每一个靶向性分子包含约1～约1000个酞菁染料分子、约1～约10个酞菁染料分子或约2～约5个酞菁染料分子。
92.在一些实施方式中，提供含有所述偶联物或稳定偶联物的组合物。
93.在一些实施方式中，提供含有所述偶联物或稳定偶联物和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
94.在一些实施方式中，所述组合物在磷酸盐缓冲盐水中配制。在一些实施方式中，组合物具有高于6.0的ph。
95.在一些实施方式中，提供含有与靶向性分子连接的酞菁染料和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。在以上一些实施方式中，所述组合物具有高于6.0的ph，且所述组合物中的偶联物在多于3个月的时间内稳定，例如多于90％的所述偶联物作为主要单体成分存在。在以上一些实施方式中，如果所述组合物中的偶联物与储存前的偶联物相比在多于3个月的时间内保持大于约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高的效价、活性或纯
度，则所述偶联物在这段时间内是稳定的。在以上一些实施方式中，如果多于90％的所述偶联物作为主要单体成分存在，则所述组合物中的偶联物是稳定的。在一些实施方式中，所述组合物的ph高于6.0，或者为约ph6.0～约8.0，包括端值。
96.在一些实施方式中，所述组合物中的偶联物的浓度为约0.01mg/ml～约200mg/ml。在一些实施方式中，所述组合物中的偶联物的浓度为约0.5mg/ml～约10mg/ml。在一些实施方式中，所述组合物中的偶联物的浓度为约1.0～约5.0mg/ml。在一些实施方式中，所述组合物中的偶联物的浓度为约1.8～约2.1mg/ml。
97.在一些实施方式中，所述组合物的体积为约0.5毫升(ml)～约100ml、约1ml～约50ml或约1ml～约10ml。
98.在一些实施方式中，提供包含所述偶联物或稳定偶联物的容器。在一些实施方式中，所述容器确保具有约500nm～725nm或650nm～725nm的波长的光不透过。在一些实施方式中，所述容器确保光不透过，使得所述容器的透光率百分数小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％或小于5％。在一些实施方式中，所述容器是绿色、蓝色、琥珀色、半透明、不透明、或用具有小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％或小于5％的透光率的材料覆盖。在一些实施方式中，所述容器包在不透明的箔中。
99.在一些实施方式中，提供用于保护酞菁染料－靶向性分子偶联物不受光的影响的包装系统。在一些实施方式中，所述包装系统包括包含本文所述的容器的内部包装材料。在一些实施方式中，所述内部包装材料具有不大于5％的透光率。在一些实施方式中，外部包装材料包含所述内部包装材料。在一些实施方式中，所述外部包装材料具有不大于5％的透光率。在一些实施方式中，所述内部包装材料包括不透明的箔。
100.在一些实施方式中，提供用于保护酞菁染料－靶向性分子偶联物不受光的影响的包装系统，其包括第一容器、如本发明提供的任意容器，以及包含所述第一容器的第二容器，其中，所述第二容器确保具有约250nm～约800nm、约250nm～约450nm、约400nm～约800nm、约450nm～约650nm或约600nm～约720nm的波长的光不透过。在一些实施方式中，所述第二容器确保光不透过，使得透光率百分数小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％或小于5％。在一些实施方式中，所述第二容器是绿色、蓝色、琥珀色、半透明、不透明、或用具有小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％或小于5％的透光率的材料覆盖。在一些实施方式中，所述第一和第二容器独立地选自药瓶、管子、注射器、包、袋子和盒子。
101.在一些实施方式中，所提供的任意包装系统还包括包含所述第二容器的第三容器，其中，所述第三容器确保具有约250nm～约800nm、约250nm～约450nm、约400nm～约800nm、约450nm～约650nm或约600nm～约720nm的波长的光不透过。在一些实施方式中，所述第三容器确保光不透过，使得透光率百分数小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％或小于5％。在一些实施方式中，所述第三容器是绿色、蓝色、琥珀色、半透明、不透明、或用具有小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％或小于5％的透光率的材料覆盖。在一些实施方式中，所述第三容器选自药瓶、管子、注射器、包、袋子和盒子。
102.在一些实施方式中，提供一种药盒，其包括：本文所述的任意容器或本文所述的任意包装系统、能够覆盖能进行包含酞菁染料－靶向性分子偶联物的组合物的给药的装置的避光盖、以及任选的使用说明书。在一些实施方式中，所述给药装置是静脉内输液包。在一
些实施方式中，所述避光盖确保具有约250nm～约800nm、约250nm～约450nm、约400nm～约800nm、约450nm～约650nm或约600nm～约720nm的波长的光不透过。在一些实施方式中，所述避光盖确保光不透过，使得透光率百分数小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％或小于5％。在一些实施方式中，所述避光盖是绿色、蓝色、琥珀色、半透明、不透明、或用具有小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％或小于5％的透光率的材料覆盖。
103.在一些实施方式中，提供包含酞菁染料偶联物的给药用组合物的制备方法，其包括：将本文所述的任意一个或多个容器或者包括本文所述的任意容器的本文所述的任意一个或多个包装系统打开；以及将所述一个或多个容器内存在的组合物转移至能进行所述组合物向对象的给药的装置中，其中，所述组合物所暴露的光仅具有约400nm～约650nm范围内的波长，或者所述组合物所暴露的光仅具有小于500勒克斯的强度。在一些实施方式中，所述组合物所暴露的光仅具有小于200勒克斯或小于100勒克斯的强度。在一些实施方式中，所提供的方法在生物安全柜、生物安全罩或无菌环境中实施。在一些实施方式中，所述一个或多个容器均包含治疗有效量的酞菁染料偶联物。在一些实施方式中，所述一个或多个容器包括至少约2、4、6、8、10、12、18或24个容器。在一些实施方式中，所提供的方法进行不超过1小时、不超过30分钟或不超过15分钟；或者在所述方法中，所述组合物在任何光下的总暴露量不超过500勒克斯小时、不超过250勒克斯小时、不超过100勒克斯小时、不超过50勒克斯小时或不超过25勒克斯小时。
104.在一些实施方式中，所述给药装置是静脉内输液包。在一些实施方式中，所述给药装置包括能够覆盖该装置的避光盖。在一些实施方式中，所述避光盖确保具有约250nm～约800nm、约250nm～约450nm、约400nm～约800nm、约450nm～约650nm或约600nm～约720nm的波长的光不透过。
105.在一些实施方式中，所述避光盖确保光不透过，使得透光率百分数小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％或小于5％。在一些实施方式中，所述避光盖是绿色、蓝色、琥珀色、半透明、不透明、或用具有小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％或小于5％的透光率的材料覆盖。
106.在一些实施方式中，提供包括用本发明所提供的方法制备的组合物的避光装置。
107.在一些实施方式中，提供除去对象中的不希望的细胞或病原体的方法，其包括：(a)将包含来自本发明所提供的任意避光装置的酞菁染料偶联物的组合物给予对象，其中，在给药步骤之前及给药步骤中，所述组合物不暴露在大于500勒克斯的强度的环境光下；以及(b)以660～740nm的波长、以至少1焦耳每平方厘米(j cm-2
)或1焦耳每厘米纤维长(j/cm纤维长)的剂量对所述不希望的细胞或病原体进行辐照，从而除去对象中的所述不希望的细胞。
108.在一些实施方式中，提供除去对象中的不希望的细胞或病原体的方法，其包括：a)给予对象治疗有效量的本文所述的任意偶联物或组合物，其中，在给药步骤之前及给药步骤中，所述偶联物不暴露在大于500勒克斯的强度的环境光下；以及b)以660～740nm的波长、以至少1j cm-2
或1j/cm纤维长的剂量对所述不希望的细胞或病原体进行辐照，从而除去对象中的所述不希望的细胞。
109.在一些实施方式中，提供除去对象中的不希望的细胞或病原体的方法，其包括：a)
给予对象治疗有效量的偶联物，该偶联物包含与能够与不希望的细胞或病原体结合的靶向性分子连接的irdye 700dx(ir700)，其中，在给药步骤之前及给药步骤中，所述偶联物不暴露在大于500勒克斯的强度的环境光下；以及b)以600～800nm的波长、以至少1j cm-2
或1j/cm纤维长的剂量对所述不希望的细胞或病原体进行辐照，从而除去对象中的所述不希望的细胞或病原体。
110.在一些实施方式中，提供除去对象中的不希望的细胞或病原体的方法，其包括：a)给予对象治疗有效量的第一结合性分子，该第一结合性分子能够与不希望的细胞或病原体结合；b)给予对象偶联物分子，该偶联物分子包含与靶向性分子连接的irdye 700dx(ir700)，其中，所述靶向性分子是能够与所述第一结合性分子结合的第二结合性分子；以及c)以600～800nm的波长、以至少1j cm-2
或1j/cm纤维长的剂量对所述不希望的细胞或病原体进行辐照，从而除去对象中的所述不希望的细胞或病原体。
111.在一些实施方式中，提供除去样品中的不希望的细胞或病原体的方法，其包括：(a)将包含来自本发明所提供的任意避光装置的酞菁染料偶联物的组合物给予样品，其中，在给药步骤之前及给药步骤中，所述组合物不暴露在大于500勒克斯的强度的环境光下；以及(b)以660～740nm的波长、以至少1j cm-2
或1j/cm纤维长的剂量对所述不希望的细胞或病原体进行辐照，从而除去样品中的所述不希望的细胞。
112.在一些实施方式中，提供除去样品中的不希望的细胞或病原体的方法，其包括：a)给予样品治疗有效量的本文所述的任意偶联物或组合物，其中，在给药步骤之前及给药步骤中，所述偶联物不暴露在大于500勒克斯的强度的环境光下；以及b)以660～740nm的波长、以至少1j cm-2
或1j/cm纤维长的剂量对所述不希望的细胞或病原体进行辐照，从而除去样品中的所述不希望的细胞。
113.在一些实施方式中，提供除去样品中的不希望的细胞或病原体的方法，其包括：a)给予样品治疗有效量的偶联物，该偶联物包含与能够与不希望的细胞或病原体结合的靶向性分子连接的irdye 700dx(ir700)，其中，在给药步骤之前及给药步骤中，所述偶联物不暴露在大于500勒克斯的强度的环境光下；以及b)以600～800nm的波长、以至少1j cm-2
或1j/cm纤维长的剂量对所述不希望的细胞或病原体进行辐照，从而除去样品中的所述不希望的细胞或病原体。
114.在一些实施方式中，提供除去样品中的不希望的细胞或病原体的方法，其包括：a)给予样品治疗有效量的第一结合性分子，该第一结合性分子能够与不希望的细胞或病原体结合；b)给予样品偶联物分子，该偶联物分子包含与靶向性分子连接的irdye 700dx(ir700)，其中，所述靶向性分子是能够与所述第一结合性分子结合的第二结合性分子；以及c)以600～800nm的波长、以至少1j cm-2
或1j/cm纤维长的剂量对所述不希望的细胞或病原体进行辐照，从而除去样品中的所述不希望的细胞或病原体。
115.在一些实施方式中，所述方法在体外或离体条件下实施。在一些实施方式中，所述方法用体外装置实施。
116.在本发明所提供的方法的一些实施方式中，所述第一结合性分子在所述偶联物之前给予对象，或者所述第一结合性分子和偶联物同时给予对象。在一些实施方式中，所述靶向性分子是第二抗体。在一些实施方式中，在所述偶联物的给药之前和之时，所述偶联物不暴露在大于500勒克斯的强度的环境光下。
117.在一些实施方式中，所述细胞是干细胞、增殖性细胞、增生中的细胞、炎性细胞、负调节免疫细胞(任选地为t细胞)、被病原体感染的细胞、神经元、脂肪细胞或脂细胞。在一些实施方式中，所述细胞是癌细胞或肿瘤细胞。在一些实施方式中，所述细胞与疾病或病症的病因有关，或者导致或有助于疾病或病症的病因。在一些实施方式中，所述疾病或病症是肿瘤或癌症、感染、炎性疾病或病症、或者神经元性疾病或病症。在一些实施方式中，所述细胞是神经元，且所述疾病或病症是神经疾病，其任选地是疼痛；所述细胞是脂肪细胞或脂细胞，且所述疾病或病症涉及多余的脂肪；所述细胞是被病原体感染的细胞，且所述疾病或病症是感染；所述细胞是病原体，且所述疾病或病症是感染；所述细胞是炎性细胞，且所述疾病或病症是炎性疾病；所述细胞是免疫细胞，其任选地是调节性t细胞，且所述疾病或病症是肿瘤或癌症；或者所述细胞是肿瘤或癌细胞，且所述疾病或病症是肿瘤或癌症。
118.在一些实施方式中，所述细胞存在于与疾病或病症有关的病变的微环境中，或者在增生中。在一些实施方式中，所述病变是肿瘤，且所述疾病或病症是肿瘤或癌症。在一些实施方式中，所述方法治疗所述疾病或病症。
119.在一些实施方式中，提供除去对象中的被病原体感染的细胞的方法，其包括：a)给予对象治疗有效量的包含与靶向性分子连接的irdye 700dx(ir700)的偶联物分子，其中，所述靶向性分子能够直接或间接地与被病原体感染的细胞结合；以及b)以600～800nm的波长、以至少1j cm-2
或1j/cm纤维长的剂量对所述被病原体感染的细胞进行辐照，从而除去对象中的所述被病原体感染的细胞。在一些实施方式中，所述病原体是病毒、细菌、真菌、生物膜或其它原核细胞系统。在一些实施方式中，在所述偶联物的给药之前和之时，所述偶联物不暴露在大于500勒克斯的强度的环境光下。
120.在一些实施方式中，提供除去样品中的被病原体感染的细胞的方法，其包括：a)给予样品治疗有效量的包含与靶向性分子连接的irdye 700dx(ir700)的偶联物分子，其中，所述靶向性分子能够直接或间接地与被病原体感染的细胞结合；以及b)以600～800nm的波长、以至少1j cm-2
或1j/cm纤维长的剂量对所述被病原体感染的细胞进行辐照，从而除去样品中的所述被病原体感染的细胞。在一些实施方式中，所述病原体是病毒、细菌、真菌、生物膜或其它原核细胞系统。在一些实施方式中，在所述偶联物的给药之前和之时，所述偶联物不暴露在大于500勒克斯的强度的环境光下。
121.在一些实施方式中，所述方法在体外或离体条件下实施。在一些实施方式中，所述离体辐照是用体外装置实施的方法。在一些实施方式中，提供治疗对象中的增生或肿瘤的方法。在一些实施方式中，所述方法包括给予对象治疗有效量的所述偶联物或稳定偶联物或组合物，其中，在给药步骤之前及给药步骤中，所述偶联物不暴露在大于500勒克斯的强度的环境光下。在一些实施方式中，所述方法还包括以660～740nm的波长、以至少1j cm-2
或1j/cm纤维长的剂量对所述增生或所述肿瘤进行辐照，从而治疗对象中的肿瘤。
122.在一些实施方式中，提供治疗对象中的增生或肿瘤的方法。在以上一些实施方式中，所述方法包括给予对象治疗有效量的含有与靶向性分子连接的irdye 700dx(ir700)的偶联物。在一些实施方式中，所述偶联物靶向所述增生或所述肿瘤，并且在给药步骤之前及给药步骤中，所述偶联物不暴露在大于500勒克斯的强度的环境光下。在一些实施方式中，所述方法还包括以600～800nm的波长、以至少1j cm-2
或1j/cm纤维长的剂量对所述肿瘤进行辐照，从而治疗对象中的肿瘤。
123.在一些实施方式中，提供治疗样品中的增生或肿瘤的方法。在一些实施方式中，所述方法包括给予样品治疗有效量的所述偶联物或稳定偶联物或组合物，其中，在给药步骤之前及给药步骤中，所述偶联物不暴露在大于500勒克斯的强度的环境光下。在一些实施方式中，所述方法还包括以660～740nm的波长、以至少1j cm-2
或1j/cm纤维长的剂量对所述增生或所述肿瘤进行辐照，从而治疗样品中的肿瘤。
124.在一些实施方式中，提供治疗样品中的增生或肿瘤的方法。在以上一些实施方式中，所述方法包括给予样品治疗有效量的含有与靶向性分子连接的irdye 700dx(ir700)的偶联物。在一些实施方式中，所述偶联物靶向所述增生或所述肿瘤，并且在给药步骤之前及给药步骤中，所述偶联物不暴露在大于500勒克斯的强度的环境光下。在一些实施方式中，所述方法还包括以600～800nm的波长、以至少1j cm-2
或1j/cm纤维长的剂量对所述肿瘤进行辐照，从而治疗样品中的肿瘤。
125.在一些实施方式中，所述方法用于治疗肿瘤，其中，所述偶联物的靶向性分子将所述偶联物靶向至肿瘤或肿瘤的微环境。在一些实施方式中，所述肿瘤的辐照以600～800nm的波长、以至少1j cm-2
或1j/cm纤维长的剂量进行，从而治疗肿瘤，例如对象或样品中的肿瘤。
126.在一些实施方式中，所述靶向性分子是抗体、抗原结合片段、蛋白质、糖蛋白、肽、多肽、病毒、病毒衣壳或病毒颗粒。在一些实施方式中，所述靶向性分子是抗体或抗体片段。
127.在一些实施方式中，给药在荧光灯或led灯下且在不存在直接或间接的日光的条件下实施。
128.在一些实施方式中，所述偶联物在小于500勒克斯的光下的任何暴露的时间少于20分钟、少于15分钟、少于10分钟或少于5分钟。在一些实施方式中，所述偶联物所暴露的任何光是具有不大于50勒克斯的强度的光。
129.在一些实施方式中，所述肿瘤是癌症。在一些实施方式中，所述癌症是位于头颈、乳腺、肝脏、结肠、卵巢、前列腺、胰腺、脑、宫颈、骨、皮肤、眼、膀胱、胃、食道、腹膜或肺的癌症。在一些实施方式中，所述癌症是血液癌症。
130.在一些实施方式中，所述偶联物靶向肿瘤中表达的蛋白质。在一些实施方式中，所述偶联物靶向存在于肿瘤微环境中的细胞表面上表达的蛋白质。在一些实施方式中，所述细胞是肿瘤细胞、免疫细胞或癌症干细胞。
131.在一些实施方式中，所述肿瘤中表达的蛋白质是acthr、内皮细胞anxa-1、氨肽酶n、抗-il-6r、α-4-整联蛋白、α-5-β-3-整联蛋白、α-5-β-5-整联蛋白、甲胎蛋白(afp)、anpa、anpb、apa、apn、app、1ar、2ar、at1、b1、b2、bage1、bage2、b-细胞受体bb1、bb2、bb4、降钙素受体、癌抗原125(ca 125)、cck1、cck2、cd5、cd10、cd11a、cd13、cd14、cd19、cd20、cd22、cd25、cd30、cd33、cd38、cd45、cd52、cd56、cd68、cd90、cd133、cd7、cd15、cd34、cd44、cd206、cd271、cea(癌胚抗原)、cgrp、趋化因子受体、细胞表面膜联蛋白-1、细胞表面网蛋白-1、cripto-1、crlr、cxcr2、cxcr4、dcc、dll3、e2糖蛋白、egfr、egfrviii、emr1、内皮唾液酸蛋白、ep2、ep4、epcam、epha2、et受体、纤连蛋白、纤连蛋白ed-b、fgfr、卷曲受体(frizzled receptors)、gage1、gage2、gage3、gage4、gage5、gage6、glp-1受体、a族(视紫红质样)的g-蛋白偶联受体、b组(分泌素受体样)的g-蛋白偶联受体、c族(代谢型谷氨酸盐受体样)的g-蛋白偶联受体、gd2、gp100、gp120、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、血凝素、硫酸肝素、her1、her2、her3、her4、
hmfg、hpv 16/18和e6/e7抗原、htert、il11-r、il-13r、itgam、激肽释放酶-9、lewis y、lh受体、lhrh-r、lpa1、mac-1、mage 1、mage2、mage 3、mage 4、mart1、mc1r、间皮素、muc1、muc16、neu(细胞表面核仁素)、脑啡肽酶、神经菌毛素-1、神经菌毛素-2、ng2、nk1、nk2、nk3、nmb-r、notch-1、ny-eso-1、ot-r、突变型p53、p97黑色素瘤抗原、ntr2、ntr3、p32(p32/gc1q-r/habp1)、p75、pac1、par1、补缀(patched)(ptch)、pdgfr、pdfg受体、pdt、蛋白酶剪切胶原iv、蛋白水解酶3、抑制素、蛋白酪氨酸激酶7、psa、psma、嘌呤能p2x家族(如p2x1-5)、突变型ras、ramp1、ramp2、ramp3补缀、ret受体、丛蛋白、平滑(smoothened)、sst1、sst2a、sst2b、sst3、sst4、sst5、p物质、tems、t细胞cd3受体、tag72、tgfbr1、tgfbr2、tie-1、tie-2、trk-a、trk-b、trk-c、tr1、trpa、trpc、trpv、trpm、trpml、trpp(如trpv1-6、trpa1、trpc1-7、trpm1-8、trpp1-5、trpml1-3)、tsh受体、vegf受体(vegfr1或flt-1、vegfr2或flk-1/kdr、及vegf-3或flt-4)、电压门控离子通道、vpac1、vpac2、维尔姆斯瘤1、y1、y2、y4或y5。
132.在一些实施方式中，所述肿瘤中表达的蛋白质是her1/egfr、her2/erbb2、cd20、cd25(il-2rα受体)、cd33、cd52、cd133、cd206、cea、ceacam1、ceacam3、ceacam5、ceacam6、癌抗原125(ca125)、甲胎蛋白(afp)、lewis y、tag72、caprin-1、间皮素、pdgf受体、pd-1、pd-l1、ctla-4、il-2受体、血管内皮生长因子(vegf)、cd30、epcam、epha2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、gpa33、粘蛋白、caix、psma、叶酸盐结合蛋白、神经节苷脂(如gd2、gd3、gm1和gm2)、vegf受体(vegfr)、vegfr2、vegf-a、整联蛋白αvβ3、整联蛋白α5β1、erbb3、met、igf1r、epha3、trailr1、trailr2、rankl、fap、生腱蛋白、afp、bcr复合物、cd3、cd18、cd44、ctla-4、gp72、hla-dr 10β、hla-dr抗原、ige、muc-1、nuc242、pem抗原、金属蛋白酶、蝶素(ephrin)受体、蝶素配体、hgf受体、cxcr4、cxcr4、铃蟾肽受体、sk-1抗原、bcr-abl、ret、met、trkb、tie2、alk、ros、eml4-alk、ros1、brafv600e、src、c-kit、pdgfr、mtor、tsc1、tsc2、btk、kit、brca、cdk 4/6、jak1、jak2、braf、flt-3、mek1、mek2或smo。
133.在一些实施方式中，所述偶联物靶向肿瘤中表达的蛋白质。在一些实施方式中，以约600nm～约850nm的波长对所述细胞、增生或肿瘤进行辐照。在一些实施方式中，以690
±
50nm或690
±
20nm的波长对所述肿瘤进行辐照。
134.在一些实施方式中，以约2j cm-2
～约400j cm-2
或约2j/cm纤维长～约500j/cm纤维长的剂量对所述细胞、增生或肿瘤进行辐照。在一些实施方式中，以至少约2j cm-2
、5j cm-2
、10j cm-2
、25j cm-2
、50j cm-2
、75j cm-2
、100j cm-2
、150j cm-2
、200j cm-2
、300j cm-2
、400j cm-2
或500j cm-2
的剂量对所述细胞、增生或肿瘤进行辐照；或者以至少约2j/cm纤维长、5j/cm纤维长、10j/cm纤维长、25j/cm纤维长、50j/cm纤维长、75j/cm纤维长、100j/cm纤维长、150j/cm纤维长、200j/cm纤维长、250j/cm纤维长、300j/cm纤维长、400j/cm纤维长或500j/cm纤维长的剂量对所述细胞、增生或肿瘤进行辐照。
135.在一些实施方式中，所述疾病或病症是肿瘤，且所述肿瘤是浅表肿瘤。在一些实施方式中，以至少约10j/cm2、25j/cm2、50j/cm2、150j/cm2或250j/cm2的剂量对所述肿瘤进行辐照。
136.在一些实施方式中，所述疾病或病症是肿瘤，且所述肿瘤是间质肿瘤。在一些实施方式中，以至少约50j/cm纤维长、100j/cm纤维长、200j/cm纤维长或300j/cm纤维长的剂量对所述肿瘤进行辐照。
137.在一些实施方式中，在所述偶联物给药后约12小时、24小时、36小时、72小时或96
小时内对所述细胞、增生或肿瘤进行辐照。在一些实施方式中，所述靶向性分子在所述偶联物给药前最多96小时给药。在一些实施方式中，所述偶联物以约0.5mg/kg～约100mg/kg或20毫克/平方米(mg/m2)～约4000毫克/平方米(mg/m2)的量给药。
138.在一些实施方式中，所述偶联物以至少约或约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg、8.0mg/kg、16.0mg/kg、32.0mg/kg或64mg/kg的量给药；或者所述偶联物以至少约或约20mg/m2、40mg/m2、160mg/m2、320mg/m2、640mg/m2、1280mg/m2或2560mg/m2的量给药。
139.在本发明所提供的方法的一些实施方式中，在所述偶联物给药前进行所述靶向性分子的给药，例如给予对象或样品。在一些实施方式中，所述靶向性分子以约10mg/m2～约500mg/m2范围内的剂量给药。
140.在一些实施方式中，所述靶向性分子是抗体或抗原结合片段。在一些实施方式中，所述抗体是西妥昔单抗。
141.在一些实施方式中，提供含有酞菁染料和靶向性分子的偶联物。在以上一些实施方式中，所述靶向性分子是组织特异性归巢肽、rgd多肽、irgd多肽、lyp-1多肽、cripto-1结合多肽、促生长素抑制素受体结合多肽、抑制素结合多肽、ngr多肽、ingr多肽、由聚阳离子细胞穿透肽(cpp)通过可切割接头与中和性聚阴离子连接而构成的可激活细胞穿透肽(acpp)、或抗体如ado-曲妥珠单抗美坦新、阿法替尼、阿西替尼、博舒替尼、卡博替尼、色瑞替尼、克唑替尼、达拉非尼、达沙替尼、依维莫司、依鲁替尼、伊马替尼、乐伐替尼、尼洛替尼、奥拉帕尼、帕博西尼、帕唑帕尼、雷莫芦单抗、瑞格非尼、鲁索替尼、索拉非尼、舒尼替尼、坦西莫司、曲美替尼、凡德他尼、维罗非尼、维莫德吉、伊匹单抗、纳武单抗、派姆单抗、mpdl3280a、皮地利珠单抗(pidilizumab)(ct-011)、amp-224、msb001078c或medi4736、或其抗原结合片段。
142.在一些实施方式中，所述acpp包括结构：a-x1-b-，其中，b是约5～约20个碱性氨基酸残基的肽部分，适合于细胞摄取；a是约2～约20个酸性氨基酸残基的肽部分，当与b部分连接时能有效地抑制或防止b部分的细胞摄取；x1是约2～约100个原子的可切割接头；并且有一个或多个l-y连接在肽部分b的c-末端。
143.在一些实施方式中，所述归巢肽具有seq id no：1～52中任一项所列的序列。在一些实施方式中，所述染料是ir700。
附图说明
144.图1a显示高分子量物质(聚集体)和西妥昔单抗-irdye 700dx单体形式的相对量，其通过曝光前24小时的透明药瓶中的样品的使用尺寸排阻柱的高效液相色谱(hplc-sec)来评价。
145.图1b显示高分子量物质(聚集体)和西妥昔单抗-irdye 700dx单体形式的相对量，其通过曝光后24小时的透明药瓶中的样品的使用尺寸排阻柱的高效液相色谱(hplc-sec)分析来评价。
146.图2a显示西妥昔单抗-irdye 700dx在500勒克斯的白色荧光或绿色led光下的暴露持续时间以及其对可溶性聚集体形成的影响。
147.图2b显示西妥昔单抗-irdye 700dx在白色荧光或绿色led光下的不同光剂量和持续时间的预暴露对bxpc3 pit活性的影响。
148.图2c显示西妥昔单抗-irdye 700dx可溶性聚集体形成百分数对pit活性的影响。
149.图3显示用西妥昔单抗和驴抗人irdye 700dx(dxhu ir700)第二抗体顺序染色的情况下的pit活性。
150.图4a显示与单体链霉亲和素-irdye 700dx(msa ir700)预络合的生物素化西妥昔单抗对bxpc3细胞的光依赖性杀伤。
151.图4b显示与单体链霉亲和素-irdye 700dx(msa ir700)预络合的生物素化西妥昔单抗对pit的特异性。
152.图4c显示单体链霉亲和素-irdye 700dx在白光下的预暴露对生物素化西妥昔单抗在bxpc3细胞内的pit杀伤活性的影响。
153.图5a显示直接偶联的抗epcam-irdye 700dx对4t1细胞的抗体剂量依赖性杀伤。
154.图5b显示抗epcam-irdye 700dx pit杀伤活性的特异性。
155.图6显示西妥昔单抗-irdye 700dx对thp1细胞的fc受体特异性杀伤。
156.图7a显示a431细胞内的egf-irdye 700dx光依赖性杀伤的特异性。
157.图7b显示egf-irdye 700dx在不同种类的光下的预暴露对a431细胞内的光依赖性杀伤的影响。
158.图8a显示使用霍乱毒素b-irdye 700dx对bxpc3细胞的光依赖性杀伤。
159.图8b显示霍乱毒素b-irdye 700dx光活化杀伤的特异性。
160.图8c显示霍乱毒素b-irdye 700dx在不同波长的光下的预暴露对bxpc3细胞内的光活化杀伤的影响。
161.图9a显示流感病毒(x-31)-irdye 700dx对vero细胞的光依赖性杀伤。
162.图9b显示流感病毒(x-31)-irdye 700dx在白光和绿光下的预暴露对光活化细胞杀伤的影响的比较。
163.图10a显示光剂量对bxpc3细胞内的sna-irdye 700dx杀伤活性的影响。
164.图10b显示唾液酸酶处理对sna-irdye 700dx与细胞结合的特异性的影响。
165.图11显示西妥昔单抗-irdye 700dx与激光照射的组合对金黄色葡萄球菌(s.aureus)的pit杀伤。
166.图12显示使用与gtxms fab-irdye 700dx预络合的小鼠抗流感病毒(h3n2)的流感病毒颗粒的pit。
167.图13显示小鼠抗流感病毒(h3n2)和山羊抗小鼠irdye 700dx(gtxms-ir700)对被流感病毒感染的细胞的光依赖性杀伤。
168.图14显示使用霍乱毒素b-irdye 700dx的大鼠胚胎背根神经节(drg)神经元的pit杀伤。
169.图15a显示西妥昔单抗-irdye 700dx偶联物、西妥昔单抗-irdye680rd偶联物和西妥昔单抗-irdye 700+irdye 680rd双偶联物在白光或绿光下的预暴露对可溶性聚集体形成的影响。
170.图15b显示西妥昔单抗-irdye 700dx偶联物、西妥昔单抗-irdye680rd偶联物和西妥昔单抗-irdye 700+irdye 680rd双偶联物在白光或绿光下的预暴露对标准化为单体含量的荧光的影响。
具体实施方式
171.i.酞菁染料－靶向性分子偶联物的制造方法
172.在一些实施方式中，提供酞菁染料－靶向性分子偶联物、如irdye700dx(ir700)－靶向性分子(如抗体)偶联物的制备或制造方法，包括制造、配制和/或包装所述偶联物。在一些实施方式中，所述方法在减少或避免所述染料的聚集或降解的条件下、如在制造过程中保护所述偶联物不受可能会使所述偶联物的染料光活化的光的影响的条件下实施。在一些实施方式中，所提供的方法也包括保护所述偶联物不暴露在酸性ph、如低于6.0的酸性ph下。所提供的方法制造在多于3个月、通常多于6个月或多于12个月的时间内稳定的染料偶联物，包括在储存条件下稳定的染料偶联物。
173.在一些实施方式中，实施所述方法以制造用于光免疫疗法的酞菁染料－靶向性分子偶联物。光免疫疗法是采用基于酞菁染料的靶点特异性光敏剂、例如与靶向性分子(如靶向肿瘤细胞上的细胞表面蛋白)偶联的近红外(nir)酞菁染料(如ir700)的分子靶向性疗法。例如，在一些情况下，光免疫疗法中使用的酞菁染料偶联物可以包括与靶向肿瘤特异性细胞表面蛋白、如肿瘤特异性细胞表面受体的单克隆抗体(mab)的偶联。在一些实施方式中，所述染料偶联物通过吸收性光、如nir光的辐照而活化，该活化激发所述光敏剂并导致细胞杀伤。在一些情况下，仅进行单次剂量的外部nir光辐照后，nir范围内的光的使用就引起较深的组织穿透，导致肿瘤的成功根除。
174.一般来说，pit主要在所述酞菁染料偶联物、如ir700－抗体偶联物所结合的细胞受到nir辐照后引起该细胞的细胞死亡，而不表达被靶向性分子(如抗体)识别的细胞表面蛋白的细胞不会被显著地杀伤。所以，由于该疗法特异性地靶向疾病细胞、如肿瘤细胞，其效果对于疾病组织具有比健康组织或细胞更高的选择性。例如，虽然靶向化的光敏剂可分布在整个机体内，但其只在施加强光的部位活化，减小了脱靶效应的可能性。
175.通常，靶向化光毒性主要依赖于所述染料偶联物与细胞膜通过特异性的靶向性分子(如抗体之类的大分子)的结合。例如，使用示例性的抗体-ir700分子的研究表明，所述偶联物必须与细胞膜结合才能活化，且细胞杀伤不要求有效的胞内定位(参见例如美国专利第8,524,239号和美国公开申请号us20140120119)。与所述偶联剂结合的细胞的光活化导致迅速的细胞死亡和坏死。
176.通常，酞菁染料、尤其是irdye 700dx(ir700)是对光特别稳定的染料。例如有报道称，ir700对光比其它近红外染料稳定45～128倍，并且不会聚集(peng等(2006)proc.spie 6097,60970e；也参见www.licor.com/bio/products/reagents/irdye/700dx/photostability.html)。也有报道称，在配制成酸性ph时，ir700染料不会像其它染料那样出现聚集问题。同样地，据peng等人报道，将ir700与抗体偶联时，其具有与非偶联染料基本相同的荧光激发和吸收光谱，因而表明该偶联物保持着其荧光性质。在一些方面，ir700的光稳定性使其能够应用于将染料在很长的时间内暴露在光的连续激发下的用途，并且无需保护其不受光的影响。这与对光不稳定且在长时间暴露在光下时不能保持荧光性的其它荧光团染料不同。
177.然而，本文发现，染料与pit活性所必需的靶向性分子的偶联会降低该染料的稳定性，使得该偶联物更容易聚集且活性(如pit活性)降低。即使单体中的染料保持其光稳定性和荧光性质，也会产生该效应。在一些情况下，特别是在治疗用途中，这会降低偶联物的活
性，从而限制偶联物作为pit剂的功效。这样的结果在其它染料偶联物(如irdye 680偶联物)中未出现，其中，这种染料具有更低的光稳定性，但在与其它分子偶联时不易聚集。因此，本文发现，用于pit的ir700之类的酞菁染料的偶联物与包括其它700nm染料在内的其它染料的偶联物相比，在暴露于光时对可溶性聚集体形成特别敏感。在一些方面，这会成为问题，因为单体纯度的分数和药理学活性(如pit活性)对于酞菁染料偶联物(如ir700偶联物)的治疗用途而言是必需的，其原因在于，纯度或活性的变化可对光活化杀伤活性造成显著影响。
178.这些发现的部分基础是在不同条件下制备或暴露的染料偶联物的hplc-sec分析。例如，本发明所提供的实施例证明，当抗体－染料偶联物以更长的时间暴露在光下时，可发生该偶联物的染料结合部分的聚集，这可通过与主要单体峰相比尺寸更大的高分子量物质的增加来证实(比较图1a和1b)。该结果也表明，在白光的存在下，会发生ir700偶联物的显著聚集，但该显著聚集在与相同分子偶联的irdye 680偶联物中并未观察到(参见例如图15a)。在一些情况下，染料的稳定性降低意味着染料偶联物更容易发生光诱导的聚集，这可使长时间暴露在光下后的染料偶联物的应用缩减至最小。还发现，当偶联物配制成酸性ph时，染料偶联物的常见的不稳定性也很明显。例如，如实施例所示，染料偶联物在低于6.0的ph下出现聚集的增强。
179.通过以上发现确认，在一些情况下，为了最大程度减小聚集并保持活性，特别是为了保证产品制造中、例如按照药品生产质量管理规范(gmp)的方法来使用时的一致性，需要保护酞菁染料偶联物不受光的影响。因此，本发明提供一种提高染料偶联物的稳定性、如完整性、纯度、活性或效价的方法。在一些实施方式中，所述方法包括：在处理或制备染料的一个或多个步骤中保护染料或染料偶联物不受激发光的影响，进行染料与靶向性分子(如抗体)的偶联，配制偶联物和/或包装偶联物。在一些实施方式中，例如在需要光来观察制造或制备偶联物的过程的情况下，所述光的保护包括仅在绿光的存在下、例如仅以不被染料吸收的波长(如约400nm～约650nm的波长)实施上述步骤的一个或多个，在一些情况下实施全部步骤。在一些实施方式中，一个或多个上述步骤中存在的任何光的强度小于500勒克斯，例如小于200勒克斯。在一些实施方式中，在生产、制造或制备所述偶联物的过程中，所述染料和偶联物在任何光下的总暴露量不超过5000勒克斯小时，例如不超过80勒克斯小时。在一些实施方式中，在包装所述偶联物的过程中，所述染料和偶联物在任何光下的总暴露量不超过5000勒克斯小时，例如不超过80勒克斯小时。
180.在一些实施方式中，所述方法包括在药学上可接受的缓冲液中在高于6.0的ph、例如通常为约6.0～约8.0的ph下配制所述染料。
181.在一些实施方式中，也提供一种方法，其包括：通过将药物产品包装在确保光不透过的容器或其它制品内来保护所述染料偶联物不受激发光的影响，使得所述容器或其它制品对具有约250nm～约800nm、约250nm～约450nm、约400nm～约800nm、约450nm～约650nm或约600nm～约720nm的波长的光的透光率不大于40％。在一些实施方式中，所述容器或其它制品对任何光的透光率小于5％或不大于5％。在一些实施方式中，这种包含染料偶联物产品的容器或制品是内部包装材料，并且提供一个或多个其它外部容器或制品以包围或包封所述内部包装材料，从而提供进一步的光保护。
182.在一些实施方式中，提供稳定的染料偶联物。在一些实施方式中，通过实施所提供
的方法，所述偶联物的纯度、杂质、完整性、组合和效价的变化不超过制造目的的可接受的规定，以便临床或商业应用。在实施方式中，例如在所述染料的加工、制造或储存后，所述偶联物是稳定的，且发生尽可能少的聚集，并且保持效价和活性。在一些实施方式中，所述染料偶联物在多于3个月、4个月、5个月、例如通常为多于6个月、多于7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或更多的时间内稳定。在一些实施方式中，这样的稳定性存在于在低于30℃的温度下、例如通常为2～8℃的温度下储存的时候。
183.就所述染料偶联物而言，术语“稳定的”是指在储存了超过所需时间、例如多于3个月、如多于约6个月、12个月或24个月后，与储存所需时间之前的(如t＝0)的偶联物相比，偶联物中有超过约90％的偶联物作为主要单体成分存在，该百分数是样品中存在的所述偶联物的总分子量的百分数，不超过10.0％的偶联物作为高分子量成分存在，该百分数是样品中存在的所述偶联物的总分子量的百分数，或者所述偶联物保持至少20％且最高为100％的完整性，例如其物理和功能品质，包括其纯度(如单体含量/高分子量成分之类的聚集体含量的百分数)、相同性(如化学组成、例如结构特征)、效价(如产生药理学响应所需的浓度或用量)或活性(如pit杀伤)中的一种或多种。
184.在一些实施方式中，如果在储存了超过所需时间、例如多于3个月、如多于6个月、12个月或24个月后，超过90％的偶联物作为主要单体成分存在，该百分数是样品中存在的所述偶联物的总分子量的百分数，例如超过91％、超过92％、超过93％、超过94％、超过95％、超过96％、超过97％、超过98％或更多的偶联物作为主要单体成分存在，该百分数是样品中存在的所述偶联物的总分子量的百分数，则偶联物是稳定的。在一些实施方式中，如果在储存了多于3个月、如多于6个月、12个月或24个月后，不超过10.0％的偶联物作为高分子量成分存在，该百分数是样品中存在的所述偶联物的总分子量的百分数，并且通常有不超过9.0％、不超过8.0％、不超过7.0％、不超过6.0％、不超过5.0％、不超过4.0％或不超过3.0％的偶联物作为高分子量成分存在，该百分数是样品中存在的所述偶联物的总分子量的百分数，则所述染料偶联物是稳定的。在一些实施方式中，高分子量成分或主要单体成分的存在可采用能够基于尺寸来分离分子的、例如通过实施hplc-sec来鉴定。
185.在一些实施方式中，如果在储存了多于3个月、如多于约6个月、12个月或24个月后，其完整性、纯度、相同性、效价或活性分别能保持储存这段时间之前的偶联物(如t＝0时的偶联物)的至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的完整性、纯度、相同性、效价或活性，则偶联物是稳定的。在一些实施方式中，所述偶联物的效价可以与该偶联物与其靶分子结构的亲和性有关。在一些实施方式中，效价可以用其ed
50
、即在暴露于偶联物的对象的50％中是药理学有效的或具有所需效果的偶联物的剂量或用量的测定来评价。在一些实施方式中，活性与生物学活性有关，该生物活性包括由偶联物的体内给药所带来的治疗效果和药理学活性，例如偶联物诱导pit杀伤的活性。在一些实施方式中，生物学活性可以在设计用来检测该活性的体外系统中观察。在一些实施方式中，偶联物的纯度与偶联物的单体相对于聚集体(如高分子量成分)的存在量有关。在一些实施方式中，纯度可以基于组合物中的单体(如主要单体峰)/聚集体(如高分子量成分)的百分数来评价。在一些实施方式中，高分子量成分或主要单体成分的存在可采用能够基于尺寸来分离分子的任意方法、例如通过实施hplc-sec来鉴定。
186.在一些实施方式中，染料偶联物的主要单体成分通常是指染料偶联物的分子量物
质，其具有偶联物中存在的染料和靶向性分子的分子量的组合。通常，主要单体成分是染料偶联物的样品中存在量最大的物质。例如，通过hplc-sec方法，主要单体成分通常是在染料偶联物的制备中作为最高峰存在的染料偶联物种类。染料偶联物样品中的主要单体成分的精确分子量范围取决于特定的样品(如特定的染料和靶向性分子)和制备方法(如染料与靶向性分子的比例)。本领域技术人员能够认识这样的物质。例如，对于含有ir700染料(具有约1954.22da的分子量)和抗体(全长抗体具有约150,000da的平均分子量)的偶联物，主要单体成分的分子量范围一般为约151,000da～165,000da，如154,000da～158,000da。在图1a和1b所示的示例性的实验中，示例性的抗体－染料偶联物的主要单体成分包括通过hplc-sec在8～9分钟洗脱的成分。
187.在一些实施方式中，染料偶联物的高分子量成分通常是指染料偶联物的分子量物质，其具有比主要单体成分的分子量更大的分子量。在一些实施方式中，所述增加或更大的分子量可以归因于染料的聚集。在一些实施方式中，聚集可以归因于二聚体、三聚体或更高级的低聚物的形成。染料偶联物样品中的高分子量成分的精确分子量范围取决于特定的样品(如特定的染料和靶向性分子)和制备方法(如染料与靶向性分子的比例)，并且在一些情况下取决于聚集的程度或度。本领域技术人员能够认识这样的物质。在一些实施方式中，对于全长抗体和ir700染料之类的染料的染料偶联物，高分子量成分可以归因于具有通常大于200,000da、如大于300,000da、350,000da、400,000da、450,000da、500,000da或更高的分子量的二聚体、三聚体或高级低聚物的存在。在图1a和1b所示的示例性的实验中，示例性的抗体－染料偶联物的高分子量成分包括通过hplc-sec在8分钟之前、如6分钟～8分钟洗脱的成分。
188.a.含有酞菁染料和靶向性分子的偶联物
189.本发明所提供的方法包括制造含有酞菁染料之类的光敏剂、如ir700、和靶向性分子(如抗体)、如与细胞表面蛋白结合的抗体的偶联物。在一些实施方式中，与酞菁染料(如ir700)之类的光敏剂偶联的靶向性分子使偶联物能够靶向细胞表面分子，例如涉及肿瘤或癌症、感染、炎性疾病或病症、神经元性疾病或病症或者其它疾病或病症之类的疾病或病症的细胞的细胞表面受体。在一些实施方式中，细胞靶向性增加了由对象的局部辐照、如以被酞菁染料吸收的波长(如近红外(nir)波长)对对象中的肿瘤进行的辐照诱导的pit的功效。
190.本发明所提供的用于联合治疗的酞菁染料偶联物包含通过接头基团与靶向性分子偶联的染料分子。在一个方面，所述偶联物以式i表示：
191.a-[(l)
n-d]
p
[0192](i)[0193]
其中：
[0194]
a是能够与细胞或组织结合的靶向性分子；
[0195]
l是针对每个p独立选择的接头；
[0196]
n是1或2；
[0197]
d是针对每个p独立选择的亲水性酞菁；并且
[0198]
p独立地是1、2、3、4、5或大于5，例如最高为1000。例如，p可以是1～1000，例如通常为1～10或2～5。
[0199]
酞菁是一组具有酞菁环体系的光敏剂化合物。酞菁是氮杂卟啉，含有通过碳和氮
原子交替的16元环中的氮桥而连接的四个苯并吲哚基(即c
32h16
n8)，其与金属和准金属阳离子形成稳定的螯合物。在这些化合物中，环中心被金属离子(抗磁性离子或顺磁性离子)占据，根据离子的不同，其可以携带一个或两个配体。此外，环周围可以未取代或被取代。国际公开wo2005/099689和美国专利第7,005,518号中描述了多种酞菁的合成及其在光动力学疗法中的应用。
[0200]
在一些实施方式中，酞菁强烈地吸收红色或近红外辐射，吸收峰落在约600～810nm，在一些情况下，这能够实现光对组织的深度穿透。酞菁通常对光稳定。该光稳定性一般在颜料和染料以及酞菁的许多其它用途中是有利的。
[0201]
在一些实施方式中，所述酞菁染料是水溶性的，并且含有具有至少一个水增溶部分的发光性荧光团部分。在一些实施方式中，所述水增溶部分含有硅。在一些实施方式中，所述酞菁染料具有si、ge、sn或al之类的核心原子。在一些实施方式中，所述酞菁染料以单核心异构体的形式存在，基本上不含其它异构体。在一些实施方式中，所述酞菁染料含有具有反应性基团或可活化基团的接头，该基团能在接头和靶向性分子之间形成键。在一些实施方式中，所述酞菁染料可以定制成在特定的波长下发出荧光。
[0202]
在一些实施方式中，所述酞菁染料含有接头，即，是接头－酞菁染料部分(l-d)。在一些实施方式中，所述接头含有反应性基团。在一些实施方式中，所述酞菁染料以式ii表示：
[0203][0204]
其中
[0205]
l选自直接连接或共价连接；
[0206]
q是反应性基团或可活化基团，可以是接头l的一部分，并且是可进行反应而在l和靶向性分子a之间形成键的任意基团；
[0207]
r2、r3、r7和r8各自独立地选自任选取代的烷基和任选取代的芳基；
[0208]
r4、r5、r6、r9、r
10
和r
11
如果存在，则各自独立地选自氢、任选取代的烷基、任选取代
的烷酰基、任选取代的烷氧基羰基、任选取代的烷基氨基甲酰基或螯合配体，其中，r4、r5、r6、r9、r
10
和r
11
中的至少一个包含水溶性基团；
[0209]r12
、r
13
、r
14
、r
15
、r
16
、r
17
、r
18
、r
19
、r
20
、r
21
、r
22
和r
23
各自是官能团，可以独立地选自氢、卤素、任选取代的烷硫基、任选取代的烷基氨基或任选取代的烷氧基；
[0210]
或者在另一实施方式中，i)r
13
和r
14
及它们所连接的碳、或ii)r
17
和r
18
及它们所连接的碳、或iii)r
21
和r
22
及它们所连接的碳中的至少一个连接形成稠环；并且
[0211]
x2和x3各自独立地是c1～c
10
亚烷基，任选地被杂原子隔开。
[0212]
在一些实施方式中，l是共价连接。在一些实施方式中，所述共价连接是直链或支链的、环状或杂环状的、饱和或不饱和的，具有1～60个原子、如1～45个原子或1～25个原子。在一些情况下，该原子可以选自c、n、p、o和s。在一些实施方式中，l可以具有额外的氢原子以配平价数(除上述1～60个原子外)。通常，所述连接包含醚、硫醚、胺、酯、氨基甲酸酯、脲、硫脲、氧或酰胺键；或者单键、双键、三键或芳香族碳－碳键；或者磷－氧、磷－硫、氮－氮、氮－氧或氮－铂键；或者芳香族或杂芳族键的组合。
[0213]
在一些实施方式中，l以式
–r1-y-x
1-y
1-表示，其中，r1是二价自由基或直接连接；y和y1各自独立地选自直接连接、氧、任选取代的氮或硫；并且x1选自直接连接和c1–c10
亚烷基，任选地被原子隔开。二价自由基包括但不限于：任选取代的亚烷基、任选取代的亚烷氧基羰基、任选取代的亚烷基氨基甲酰基、任选取代的亚烷基磺酰基和任选取代的亚芳基。
[0214]
示例性的r1取代基包括但不限于：任选取代的亚烷基、任选取代的亚烷氧基羰基、任选取代的亚烷基氨基甲酰基、任选取代的亚烷基磺酰基、任选取代的亚烷基磺酰基氨基甲酰基、任选取代的亚芳基、任选取代的亚芳基磺酰基、任选取代的亚芳氧基羰基、任选取代的亚芳基氨基甲酰基、任选取代的亚芳基磺酰基氨基甲酰基、任选取代的羧基烷基、任选取代的氨基甲酰基、任选取代的羰基、任选取代的杂亚芳基、任选取代的杂亚芳氧基羰基、任选取代的杂亚芳基氨基甲酰基、任选取代的杂亚芳基磺酰基氨基甲酰基、任选取代的磺酰基氨基甲酰基、任选取代的硫代羰基、任选取代的磺酰基和任选取代的亚磺酰基。
[0215]
在一些实施方式中，q含有用于与靶向性分子之类的物质任选地连接的反应性基团。如本文所用，术语“反应性基团”或“反应性化学基团”是指化合物上的能够与其它物质(如靶向性分子)上的官能团发生化学反应而形成共价连接之类的连接的部分。一般来说，所述反应性基团是亲电体或亲核体，分别可通过暴露在作为亲核体或亲电体的相应的官能团下而形成共价连接。或者，所述反应性基团是可光致活化的基团，并且仅在合适波长的光照射后才变得具有化学反应性。一般来说，待偶联的反应性染料和靶向性分子之间的偶联反应导致反应性基团q的一个或多个原子参与到新的连接中，该连接将染料偶联到靶向性分子上。
[0216]
在一些实施方式中，q含有与靶向性分子上的羧基、胺或硫醇基团具有反应性的反应性基团。合适的反应性基团包括但不限于：用于与靶向性分子任选地连接的胺反应性化学基团、巯基反应性化学基团、活化酯、酰基卤、烷基卤、酸酐、羧酸、碳二亚胺、碳酸酯、氨基甲酸酯、卤代乙酰胺(如碘乙酰胺)、异氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、nhs酯、亚磷酰胺、铂络合物、磺酸酯和硫氰酸酯。在一些实施方式中，所述反应性基团与靶向性分子上的羧基、胺或硫醇基团具有反应性。在一些实施方式中，所述反应性化学基团是巯基反应性化学基团，如马来酰亚胺、卤代乙酰基和吡啶基二硫化物。在一些实施方式中，所述反应性基团
是胺反应性的。在一些实施方式中，所述反应性基团是nhs酯。
[0217]
在一些实施方式中，r2、r3、r7和r8各自是任选取代的烷基，如任选取代的甲基、乙基或异丙基。
[0218]
在一些实施方式中，r4、r5、r6、r9、r
10
和r
11
中的至少一个包含水溶性基团。例如，r4、r5、r6、r9、r
10
和r
11
被水溶性取代基取代。如本文所用，“水溶性基团”是指包含一个或多个提高整个分子在水性介质中的溶解度的极性和/或离子性取代基的基团。在一些情况下，r4、r5、r6、r9、r
10
和r
11
中的至少两个包含水溶性基团。在其它实施方式中，有三个或多个包含水溶性基团。水溶性基团包括但不限于：羧酸基(—co
2-)、磺酸基(—so
3-)、磺酰基(—so
2-)、硫酸基(—so
4-2
)、羟基(—oh)、磷酸基(—opo
3-2
)、膦酸基(—po
3-2
)、氨基(—nh2)和任选取代的季铵氮，它们均具有任选的抗衡离子。
[0219]
合适的抗衡离子包括但不限于：钠、钾、钙、铵、有机氨基盐或镁盐、或者类似的盐。优选地，所述抗衡离子是生物学上可接受的抗衡离子。
[0220]
在一些实施方式中，r4、r5、r6、r9、r
10
和r
11
所连接的氮原子可以是三价或四价的。
[0221]
在一些实施方式中，r
12
、r
13
、r
14
、r
15
、r
16
、r
17
、r
18
、r
19
、r
20
、r
21
、r
22
和r
23
各自是氢。
[0222]
在一些实施方式中，x2和x3各自独立地选自c1～c
10
亚烷基，任选地被原子隔开。在一些实施方式中，附加在x2和/或x3上的氮可以任选地季铵化。
[0223]
在一些实施方式中，所述酞菁染料以式iii表示：
[0224][0225]
其中
[0226]
x1和x4各自独立地是c1～c
10
亚烷基，任选地被杂原子隔开；并且
[0227]
r2、r3、r4、r5、r6、r7、r8、r9、r
10
、r
11
、r
16
、r
17
、r
18
、r
19
、x2和x3如本文所定义。
[0228]
在一些实施方式中，所述反应性基团是nhs酯。在一些实施方式中，所述nhs酯的反应性可通过改变nhs酯和氨基甲酸酯官能团之间的亚烷基x4的长度来调节。在一些实施方式中，nhs酯和氨基甲酸酯官能团之间的亚烷基x4的长度与nhs酯的反应性成反比。在一些实施方式中，x4是c
5-亚烷基。在其它实施方式中，x4是c
3-亚烷基。在一些实施方式中，x1是c6-亚烷基。在其它实施方式中，x1是c
3-亚烷基。
[0229]
在一些实施方式中，所述酞菁染料所具有的总电子电荷为零。在某些情况下，该电荷中性可通过一个或多个任选的抗衡离子或季铵氮来获得。
[0230]
在一些实施方式中，所述酞菁染料在水性熔液中具有足够的溶解度，从而当其与可溶性靶向性分子连接时，该靶向性分子保持其溶解度。在一些实施方式中，所述染料也可溶于有机介质(如dmso或dmf)。
[0231]
在一些实施方式中，所述酞菁染料在近红外范围(nir范围)内具有最大光吸收。在一些实施方式中，所述酞菁染料具有600nm～850nm、如680nm～850nm、例如约690nm
±
50nm～690
±
20nm的最大光吸收波长。在一些实施方式中，所述酞菁染料可以被发出以上波长的光的市售激光二极管有效地激发。
[0232]
在一些实施方式中，所述含有反应性基团的酞菁染料是ir700 nhs酯，如irdye 700dx nhs酯(licor 929-70010、929-70011)。因此，在一些实施方式中，所述染料是具有下式结构的化合物：
[0233][0234]
出于本发明的目的，当所述染料例如通过反应性基团与靶向性分子偶联时，术语“ir700”、“irdye 700dx”或其变体是指上式。通常，ir700具有多种有利的化学性质。氨基反应性ir700是相对亲水的染料，可以用ir700的nhs酯与抗体共价偶联。一般来说，ir700也具有比普通的光敏剂如血卟啉衍生物(在630nm为1.2
×
103m-1
cm-1
)、间－四羟基苯基二氢卟吩；(在652nm为2.2
×
104m-1
cm-1
)和单-l-天冬氨酰基二氢卟吩e6；npe6/(在654nm为4.0
×
104m-1
cm-1
)高出超过5倍的消光系数(在最大吸收的689nm为2.1
×
105m-1
cm-1
)。
[0235]
本文所述的酞菁染料可以用市售的起始材料制造。核心结构通过两个或多个不同
的二亚氨基异吲哚啉的缩合来合成。使用不同的二腈或二亚氨基异吲哚啉的合成策略可导致不同程度的酞菁的取代和/或区域异构体的分布。美国专利第7,005,518号中描述了用于生成所述染料的示例性的合成方案。
[0236]
在一些实施方式中，所述酞菁染料通过染料分子的反应性基团与靶向性分子偶联。在一些实施方式中，所述靶向性分子例如能够通过与细胞或病原体上的细胞表面分子(如细胞表面受体)结合来将偶联物靶向至细胞或病原体。在一些实施方式中，所述靶向性分子如大分子可与所需的细胞类型、具有特定表型的细胞、或者展示一种或多种细胞表面标记物或抗原的细胞选择性地结合。在一些情况下，所述靶向性分子与癌细胞、肿瘤细胞、炎性细胞、免疫细胞、神经元、干细胞、增殖性细胞或增生中的细胞结合。在一些情况下，所述靶向性分子与病原体或被病原体感染的细胞结合。在一些实施方式中，所述细胞是白细胞之类的炎性细胞，例如中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞或单核细胞。在一些实施方式中，所述细胞是免疫细胞，如t细胞、b细胞、自然杀伤(nk)细胞、树突细胞、巨噬细胞或中性粒细胞。在一些实施方式中，所述细胞是神经元，其是外周神经系统神经元或中枢神经系统神经元、如伤害感受器，例如温度性伤害感受器、机械性伤害感受器、化学性伤害感受器或多形性伤害感受器。在一些实施方式中，所述靶向性分子与病原体或致病细胞、如病毒、细菌、真菌、生物膜或其它原核细胞系统结合。在一些实施方式消肿，所述靶向性分子与病原体结合，该病原体是革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌。
[0237]
在一些实施方式中，所述酞菁染料偶联物的靶向性分子(如抗体)与存在于病变的微环境中的细胞表面上的蛋白质结合，该病变与疾病或病症有关或者是疾病或病症的结果。例如，在一些实施方式中，所述偶联物与存在于肿瘤中或者与肿瘤有关的肿瘤微环境中存在的细胞表面上的蛋白质结合。在一些实施方式中，所述偶联物与存在于肿瘤微环境中的胞外基质中的蛋白质结合。
[0238]
如本文所用，“存在于损害的微环境中的细胞”是指存在于与损害、疾病或失调有关的细胞环境中的任何细胞，例如存在于肿瘤中或直接毗邻肿瘤的任何细胞，如存在于肿瘤微环境或肿瘤微环境中的胞外基质中的细胞。
[0239]
如本文所用，“存在于肿瘤微环境中的细胞”是指存在于出现肿瘤的细胞环境中的任何细胞，例如存在于肿瘤中或直接毗邻肿瘤的任何细胞，包括增殖性肿瘤细胞(如癌细胞)、肿瘤间质、血管、浸润性炎性细胞(如免疫细胞)和各种相关的组织细胞(如成纤维细胞)。因此应理解，提及肿瘤时，不仅是指可包括恶性细胞或癌细胞的肿瘤细胞，也是指存在于肿瘤微环境中的调节肿瘤生长的其它细胞，包括免疫细胞。在一些情况下，存在于肿瘤微环境中的免疫细胞可以包括t淋巴细胞，包括调节性t淋巴细胞(treg)、树突细胞、自然杀伤(nk)细胞、b细胞、巨噬细胞及其它免疫细胞(whiteside(2008)oncogene,27:5904-5912)。应认识到，在一些方面，许多存在于肿瘤中或肿瘤周围的非癌细胞可调节肿瘤细胞的增殖、血管发生、侵袭和/或转移，从而促进肿瘤生长。因此，在一些情况下，靶向存在于肿瘤中的这种非癌细胞、如免疫细胞(如t细胞、例如调节性t细胞)可以作为用于通过pit来杀伤肿瘤的有效疗法。
[0240]
通常，含有肿瘤特异性抗原的癌细胞应当被免疫系统识别。一般来说，在活跃的免疫系统中，细胞毒性t细胞之类的免疫细胞会攻击并根除这些癌细胞。在正常生理条件下，t细胞介导的免疫应答通过t细胞受体(tcr)对抗原的识别而开始，并且通过共刺激信号和抑
制信号(如免疫检查点蛋白)的平衡来调节。尤其是表达tcr的cd4+和cd8+t细胞分别可通过主要组织相容性复合体(mhc)i类或ii类分子上的抗原呈递细胞上表达的抗原肽的识别而活化。在一些方面，活化的cd8+细胞或细胞毒性t细胞可以杀伤表达所述抗原的肿瘤细胞，而cd4+t细胞的存在可以辅助该现象。
[0241]
然而，在肿瘤的情况下，肿瘤微环境具有抑制免疫系统的机制，从而逃避免疫识别并防止或减少肿瘤细胞的杀伤。例如，在一些情况下，作为逃避免疫系统的机制，免疫检查点蛋白可以在肿瘤中失调，从而导致肿瘤微环境中的免疫应答的抑制。在一些情况下，肿瘤浸润性淋巴细胞可以包括tregs(如cd4+cd25+t细胞)，其是能够抑制微环境中的其它t细胞增殖的细胞(whiteside,tl(2008)oncogene,27:5904-5912)。在一些情况下，其它机制可以起到阻止免疫细胞到达肿瘤抗原的作用，从而也有助于肿瘤逃避免疫系统的能力。
[0242]
在一些实施方式中，所述靶向性分子是与肿瘤细胞或癌细胞上的细胞表面蛋白结合的分子。在一些实施方式中，所述靶向性分子与t淋巴细胞、如treg、树突细胞、自然杀伤(nk)细胞、b细胞、巨噬细胞或存在于肿瘤微环境中的其它免疫细胞结合。例如，所述肿瘤细胞或癌细胞可以是与位于头颈、乳腺、肝脏、结肠、卵巢、前列腺、胰腺、脑、宫颈、骨、皮肤、眼、膀胱、胃、食道、腹膜或肺的癌症有关的细胞。在一些实施方式中，所述靶向性细胞所结合的细胞是癌症干细胞或循环肿瘤细胞。
[0243]
示例性的靶向性分子如大分子包括但不限于在已公开的pct国际申请号wo2014120974、wo2014176284、wo2015042325、美国专利第8,524,239号或美国专利公开号us20140120119中描述的靶向肿瘤或癌症的任意分子。
[0244]
示例性的靶向性分子包括但不限于：蛋白质、糖蛋白、抗体、抗体片段、抗原、抗原结合片段、肽、多肽、小分子、聚合物合成分子、聚合物纳米颗粒、脂质体、酶底物、激素、神经递质、细胞代谢物、病毒颗粒、病毒衣壳、病毒纳米颗粒、细菌颗粒、标记物、细胞、半抗原、亲和素、链霉亲和素、单体链霉亲和素、生物素、碳水化合物、寡糖、多糖、核酸、脱氧核酸、dna片段、rna片段、核苷酸三磷酸、无环鸟苷终止子三磷酸或pna。
[0245]
在一些实施方式中，所述靶向性分子是氨基酸、肽、蛋白质、酪胺、多糖、离子复合性部分、核苷、核苷酸、寡核苷酸、补骨脂素、药物、激素、脂质、脂质组装体、聚合物、聚合物微粒、生物细胞或病毒。在一些实施方式中，所述靶向性分子是抗原、类固醇、维生素、药物、代谢物、毒素、环境污染物、核酸聚合物、碳水化合物、脂质或者玻璃、塑料或其它非生物聚合物。在一些实施方式中，所述靶向性分子是细胞、细胞系统、细胞碎片或亚细胞颗粒如病毒颗粒、细菌颗粒、病毒成分、生物细胞(如动物细胞、植物细胞、细菌、酵母或原生生物)或细胞成分。在一些实施方式中，反应性染料可以对细胞表面、细胞膜内、细胞器内或细胞质内的官能团进行标记。
[0246]
在一些实施方式中，所述靶向性分子可以与所需的细胞类型、具有特定表型的细胞、或者展示一种或多种细胞表面标记物或抗原的细胞选择性地结合。在一些实施方式中，所述靶向性分子是肿瘤靶向性分子。在一些实施方式中，所述靶向性分子可以与肿瘤细胞或癌细胞结合。在一些实施方式中，所述靶向性分子靶向细胞表面上、例如肿瘤细胞的细胞表面上的标记物或抗原，或者与之结合。
[0247]
在一些实施方式中，所述靶向性分子靶向抗原、例如作为能够被所述分子结合的靶点的任意结构物质，或者与之结合。在一些实施方式中，所述抗原是在细胞表面上表达的
蛋白质之类的细胞表面分子、如受体，或者构成其一部分。在一些实施方式中，例如所述抗原是存在于肿瘤中的细胞、包括存在于肿瘤微环境中的任意细胞的表面上表达的分子，或者构成其一部分。靶向性分子能够结合的细胞表面分子的例子包括但不限于：抗原、肽、脂质、多糖、碳水化合物或含有例如被免疫细胞识别的抗原决定簇的核酸。在一些实施例中，抗原包括肿瘤特异性肽(如癌细胞的表面上可见的肽)或其免疫原性片段。
[0248]
在一些实施方式中，所述靶向性分子是能够与细胞表面蛋白、如细胞表面受体之类的细胞表面分子结合的配体之类的结合配偶体。在一些实施方式中，所述靶向性分子选自促肾上腺皮质激素(acth)、血管紧张素ii、心房钠尿因子(anf)、铃蟾肽、缓激肽、脑源性神经营养因子(bdnf)、骨形态发生蛋白2(bmp-2)、骨形态发生蛋白6(bmp-6)、骨形态发生蛋白7(bmp-7)、降钙素、心肌营养素1(bmp-2)、cd22、cd40、胆囊收缩素(cck)、睫状节神经细胞营养因子(cntf)、ccl1-ccl28、cxcl1-cxcl17、xcl1、xcl2、cx3cl1、cripto 1结合肽、血管内皮细胞生长因子(vegf)、表皮生长因子(egf)、内皮素1、内皮素1/3、fas配体、成纤维细胞生长因子1(fgf-1)、成纤维细胞生长因子2(fgf-2)、成纤维细胞生长因子4(fgf-4)、成纤维细胞生长因子5(fgf-5)、成纤维细胞生长因子6(fgf-6)、成纤维细胞生长因子7(fgf-7)、成纤维细胞生长因子10(fgf-10)、flt-3、胃泌素、胃泌素释放肽(grp)、粒细胞集落刺激因子(g-csf)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、胰高血糖素样肽(glp-1)、肝细胞生长因子(hgf)、α干扰素(ifn-a)、β干扰素(ifn-b)、γ干扰素(ifng)、胰岛素样生长因子1(igf-1)、胰岛素样生长因子2(igf-2)、白细胞介素1(il-1)、白细胞介素2(il-2)、白细胞介素3(il-3)、白细胞介素4(il-4)、白细胞介素5(il-5)、白细胞介素6(il-6)、白细胞介素7(il-7)、白细胞介素8(il-8)、白细胞介素9(il-9)、白细胞介素10(il-10)、白细胞介素11(il-11)、白细胞介素12(il-12)、白细胞介素13(il-13)、白细胞介素15(il-15)、白细胞介素17(il-17)、白细胞介素19(il-19)、黄体生成素(lh)、黄体生成素释放激素(lhrh)、巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)、单核细胞趋化蛋白1(mcp-1)、巨噬细胞炎性蛋白3a(mip-3a)、巨噬细胞炎性蛋白3b(mip-3b)、神经生长因子(ngf)、神经介素b、神经营养因子3(nt-3)、神经营养因子4(nt-4)、神经降压素、神经肽y、催产素、垂体腺苷酸环化酶激活肽(pacap)、血小板衍生生长因子aa(pdgf-aa)、血小板衍生生长因子ab(pdgf-ab)、血小板衍生生长因子bb(pdgf-bb)、血小板衍生生长因子cc(pdgf-cc)、血小板衍生生长因子dd(pdgf-dd)、导蛋白-1(ntn1)、导蛋白-2(ntn2)、导蛋白-4(ntn4)、导蛋白-g1(ntng1)和导蛋白-g2(ntng2)、蝶素a1(efna1)、蝶素a2(efna2)、蝶素a3(efna3)、蝶素a4(efna4)、蝶素a5(efna5)、脑信号蛋白3a(sema3a)、脑信号蛋白3b(sema3b)、脑信号蛋白3c(sema3c)、脑信号蛋白3d(sema3d)、脑信号蛋白3f(sema3f)、脑信号蛋白3g(sema3g)、脑信号蛋白4a(sema4a)、脑信号蛋白4b(sema4b)、脑信号蛋白4c(sema4c)、脑信号蛋白4d(sema4d)、脑信号蛋白4f(sema4f)、脑信号蛋白4g(sema4g)、脑信号蛋白5a(sema5a)、脑信号蛋白5b(sema5b)、脑信号蛋白6a(sema6a)、脑信号蛋白6b(sema6b)、脑信号蛋白6d(sema6d)、脑信号蛋白7a(sema7a)、slit1、slit2、slit3、slit和ntrk样家族成员1(slitrk1)、slit和ntrk样家族成员2(slitrk2)、slit和ntrk样家族成员3(slitrk3)、slit和ntrk样家族成员4(slitrk4)、slit和ntrk样家族成员5(slitrk5)、slit和ntrk样家族成员6(slitrk6)、前列腺素e2(pge2)、rantes、促生长素抑制素-14、促生长素抑制素-28、干细胞因子(scf)、基质细胞衍生因子1(sdf-1)、p物质、促甲状腺激素(tsh)、转化生长因子α(tgf-α)、转化生长因子β(tgf-b)、肿
瘤坏死因子α(tnf-α)、凝血酶、血管活性肠肽(vip)、wntl、wnt2、wnt2b/13、wnt3、wnt3a、wnt4、wnt5a、wnt5b、wnt6、wnt7a、wnt7b、wnt7c、wnt8、wnt8a、wnt8b、wnt8c、wntl0a、wntl0b、wnt11、wnt14、wnt15或wnt16、音猬因子(sonic hedgehog)、沙漠刺猬因子(desert hedgehog)和印度刺猬因子(indian hedgehog),或能与其同源的细胞表面分子，诸如细胞表面蛋白之类，如细胞表面受体结合的结合片段。
[0249]
在一些实施方式中，所述靶向性分子可以是免疫调节剂，其可以与抑制或激活机体的免疫应答的免疫细胞上的细胞表面分子或蛋白质结合。在一些实施方式中，所述免疫调节剂与细胞表面分子或蛋白质的结合例如可以通过抑制免疫抑制或通过增强免疫刺激来刺激针对肿瘤和/或病原体的免疫应答。在一些实施方式中，所述细胞表面分子或蛋白质可以是cd25、pd-1(cd279)、pd-l1(cd274、b7-h1)、pd-l2(cd273、b7-dc)、ctla-4、lag3(cd223)、tim3(havcr2)、4-1bb(cd137、tnfrsf9)、cxcr2、cxcr4(cd184)、cd27、ceacam1、半乳糖凝集素9、btla、cd160、vista(pd1同源物)、b7-h4(vctn1)、cd80(b7-1)、cd86(b7-2)、cd28、hhla2(b7-h7)、cd28h、cd155、cd226、tigit、cd96、半乳糖凝集素3、cd40、cd40l、cd70、light(tnfsf14)、hvem(tnfrsf14)、b7-h3(cd276)、ox40l(tnfsf4)、cd137l(tnfsf9、gitrl)、b7rp1、icos(cd278)、icosl、kir、gal9、nkg2a(cd94)、garp、tl1a、tnfrsf25、tmigd2、btnl2、嗜乳脂蛋白家族、cd48、cd244、唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素(siglec)家族、cd30、csf1r、mica(mhc i类多肽相关序列a)、micb(mhc i类多肽相关序列b)、nkg2d、kir家族(杀伤细胞免疫球蛋白样受体)、lilr家族(白细胞免疫球蛋白样受体、cd85、ilts、lirs)、sirpa(信号调节蛋白α)、cd47(iap)、神经菌毛素1(nrp-1)、vegfr或vegf。
[0250]
在一些实施方式中，所述细胞表面分子可以是细胞膜磷脂、原核肽聚糖、细菌细胞包膜蛋白、病毒衣壳蛋白、acthr、内皮细胞anxa-1、氨肽酶n、抗-il-6r、α-4-整联蛋白、α-5-β-3-整联蛋白、α-5-β-5-整联蛋白、甲胎蛋白(afp)、anpa、anpb、apa、apn、app、1ar、2ar、at1、b1、b2、bage1、bage2、b-细胞受体bb1、bb2、bb4、降钙素受体、癌抗原125(ca 125)、cck1、cck2、cd5、cd10、cd11a、cd13、cd14、cd19、cd20、cd22、cd25、cd30、cd33、cd38、cd45、cd52、cd56、cd68、cd90、cd133、cd7、cd15、cd34、cd44、cd206、cd271、cea(癌胚抗原)、cgrp、趋化因子受体、细胞表面膜联蛋白-1、细胞表面网蛋白-1、cripto-1、crlr、cxcr2、cxcr4、dcc、dll3、e2糖蛋白、egfr、egfrviii、emr1、内皮唾液酸蛋白、ep2、ep4、epcam、epha2、et受体、纤连蛋白、纤连蛋白ed-b、fgfr、卷曲受体(frizzled receptors)、gage1、gage2、gage3、gage4、gage5、gage6、glp-1受体、a族(视紫红质样)的g-蛋白偶联受体、b组(分泌素受体样)的g-蛋白偶联受体、c族(代谢型谷氨酸盐受体样)的g-蛋白偶联受体、gd2、gp100、gp120、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、血凝素、硫酸肝素、her1、her2、her3、her4、hmfg、hpv 16/18和e6/e7抗原、htert、白细胞介素受体(如il-2r、il11-r、il-13r)、itgam、激肽释放酶-9、lewis y、lh受体、lhrh-r、lpa1、mac-1、mage 1、mage 2、mage 3、mage 4、mart1、mc1r、间皮素、muc1、muc16、neu(细胞表面核仁素)、脑啡肽酶、神经菌毛素-1、神经菌毛素-2、ng2、nk1、nk2、nk3、nmb-r、notch-1、ny-eso-1、ot-r、突变型p53、p97黑色素瘤抗原、ntr2、ntr3、p32(p32/gc1q-r/habp1)、p75、pac1、par1、补缀(patched)(ptch)、pdgfr、pdfg受体、pdt、蛋白酶剪切胶原iv、蛋白水解酶3、抑制素、蛋白酪氨酸激酶7、psa、psma、嘌呤能p2x家族(如p2x1-5)、突变型ras、ramp1、ramp2、ramp3补缀、ret受体、丛蛋白、平滑(smoothened)、sst1、sst2a、sst2b、sst3、sst4、sst5、p物质、tems、t细胞cd3受体、tag72、tgfbr1、tgfbr2、tie-1、tie-2、trk-a、
区，也称为“互补决定区”或“cdr”。框架区和cdr的程度已经确定(参见kabat等，免疫学上感兴趣的蛋白质序列(sequences of proteins of immunological interest)，美国卫生及公共服务部(u.s.department of health and human services)，1991，其通过引用纳入本文)。kabat数据库目前在网上维护。不同的轻链和重链的框架区的序列在人类之类的物种内相对保守。由轻链和重链组成部分的框架区组合而成的抗体框架区起到在三维空间内将cdr定位并对齐的作用。
[0258]
cdr一般负责与抗原的表位结合。各链的cdr一般是指cdr1、cdr2和cdr3，它们从n-末端开始依次编号，并且通常也通过特定的cdr所在的链来鉴定。因此，v
h cdr3位于其所在的抗体的重链的可变结构域，而v
l cdr1是来自其所在的抗体的轻链的可变结构域的cdr1。具有不同特异性、例如对于不同抗原具有不同结合位点的抗体具有不同的cdr。虽然cdr在不同抗体之间有差别，但只有cdr中的有限数量的氨基酸位置直接参与抗原结合。cdr中的这些位置称为特异性决定残基(sdr)。
[0259]
提及“v
h”或“vh”时，是指免疫球蛋白重链的可变区，包括fv、scfv、dsfv或fab的可变区。提及“v
l”或“vl”时，是指免疫球蛋白轻链的可变区，包括fv、scfv、dsfv或fab的可变区。
[0260]
所提供的抗体中有抗体片段。“抗体片段”是指不同于完整抗体的、包含完整抗体的一部分、与完整抗体所结合的抗原结合的分子。抗体片段的例子包括但不限于：fv、fab、fab'、fab
’‑
sh、f(ab')2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(如scfv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。其它抗体片段或由抗体片段形成的多特异性抗体包括多价scfv、双特异性scfv或scfv-ch3二聚体。抗体片段可通过多种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化和由重组宿主细胞生产。
[0261]“单克隆抗体”是由b淋巴细胞的单克隆或转染了一个抗体的轻链和重链基因的细胞生产的抗体。单克隆抗体通过本领域技术人员已知的方法生产，例如通过由杂交瘤细胞和免疫脾细胞制造杂合抗体形成细胞来生产。单克隆抗体包括人源化单克隆抗体。
[0262]“嵌合抗体”具有来自一个物种、如人类的框架残基，和来自另一物种、例如与间皮素特异性结合的小鼠抗体的通常赋予抗体结合性的cdr。
[0263]“人源化”免疫球蛋白是包括人框架区和来自非人(例如小鼠、大鼠或合成)免疫球蛋白的一个或多个cdr的免疫球蛋白。提供cdr的非人免疫球蛋白称为“供体”，提供框架的人免疫球蛋白称为“受体”。在一些实施方式中，所述cdr来自人源化免疫球蛋白中的供体免疫球蛋白。恒定区不需要存在，但如果存在，则其可以与人免疫球蛋白恒定区基本相同，例如至少约85～90％、如约95％或更高程度地相同。因此，人源化免疫球蛋白的一部分、但不可能是cdr、与天然人免疫球蛋白序列的相应部分基本相同。“人源化抗体”是包含人源化轻链和人源化重链免疫球蛋白的抗体。人源化抗体与提供cdr的供体抗体所结合的抗原相同的抗原结合。人源化免疫球蛋白或抗体的受体框架可以用取自供体框架氨基酸进行有限数量的取代。人源化或其它单克隆抗体可以具有其它的保守性氨基酸取代，该保守性氨基酸取代对抗原结合性或其它免疫球蛋白功能基本没有影响。人源化免疫球蛋白可通过基因工程的方法构建(参见例如美国专利第5,585,089号)。
[0264]“人”抗体(也称为“全人”抗体)是包括人框架区和来自人免疫球蛋白的cdr的抗体。在一些实施方式中，框架和cdr来自同一个起源人重链和/或轻链氨基酸序列。但是，可
以将来自一个人抗体的框架加工成包括来自不同的人抗体的cdr。人免疫球蛋白的一部分可以与天然人免疫球蛋白序列的相应部分基本相同。
[0265]“特异性结合”是指相对于与非肿瘤蛋白质之类的无关的蛋白质、如β-肌动蛋白的结合，抗体或抗原结合片段之类的分子与肿瘤特异性抗原之类的抗原特异性结合的能力。在一些实施方式中，抗体或片段之类的分子、包括与酞菁染料分子连接的抗体或片段之类的分子、与细胞表面蛋白之类的靶点特异性结合，其结合常数比与样品或对象中的其它分子的结合常数大至少103m-1
、104m-1
或105m-1
。在一些实施方式中，抗体或其片段之类的分子具有大于或等于约106m-1
、大于或等于约107m-1
、大于或等于约108m-1
、或者大于或等于约109m-1
、10
10
m-1
、10
11
m-1
或10
12
m-1
的平衡结合常数(ka)。抗体也可以用10-6
m、10-7
m、10-8
m、10-10
m、10-11
m或10-12
m或更低的平衡解离常数(kd)来表征。在一些实施方式中，平衡解离常数(kd)可以是1nm或更低。kd或ka之类的亲和常数可以经验性地估计，或者亲和性可通过例如一种抗体和另一种抗体对于特定抗原的亲和性的比较来比较性地确定。例如，该亲和性可以用本领域已知的技术、例如通过竞争elisa(酶联免疫吸附试验)、或者采用表面等离子共振装置如biacore t100(可购自必爱可公司(biacore,inc.)，新泽西州皮斯卡塔韦)、使用放射性标记的靶抗原的放射性免疫试验、或者通过本领域技术人员已知的其它方法容易地确定。
[0266]
在一些实施方式中，所述酞菁染料(如ir700)与抗体或抗原结合性抗体片段偶联。例如，在一些方面，所述酞菁染料－靶向性分子偶联物是ir700－抗体偶联物。可以与所述酞菁染料(如ir700)偶联的示例性的抗体包括但不限于：西妥昔单抗、帕尼单抗、扎卢木单抗、尼妥珠单抗、曲妥珠单抗、ado-曲妥珠单抗美坦新、托西莫单抗利妥昔单抗(rituxan、mabthera)、替伊莫单抗(zevalin)、达珠单抗(zenapax)、吉姆单抗(mylotarg)、阿仑单抗、cea-扫描fab片段、oc125单克隆抗体、ab75705、b72.3、贝伐单抗阿法替尼、阿西替尼、博舒替尼、卡博替尼、色瑞替尼、克唑替尼、达拉非尼、达沙替尼、埃罗替尼、依维莫司、依鲁替尼、伊马替尼、拉帕替尼、乐伐替尼、尼洛替尼、奥拉帕尼、帕博西尼、帕唑帕尼、帕妥珠单抗、雷莫芦单抗、瑞格非尼、鲁索替尼、索拉非尼、舒尼替尼、坦西莫司、曲美替尼、凡德他尼、维罗非尼、维莫德吉、巴利昔单抗、伊匹单抗、纳武单抗、派姆单抗、mpdl3280a、皮地利珠单抗(pidilizumab)(ct-011)、mk-3475、bms-936559、mpdl3280a、替西木单抗(tremelimumab)、imp321、bms-986016、lag525、乌瑞鲁单抗(urelumab)、pf-05082566、trx518、mk-4166、达西珠单抗(dacetuzumab)、鲁卡木单抗(lucatumumab)、seq-cd40、cp-870、cp-893、medi6469、medi6383、moxr0916、amp-224、msb0010718c、medi4736、pdr001、rhigm12b7、乌洛鲁单抗(ulocuplumab)、bkt140、伐利鲁单抗(varlilumab)(cdx-1127)、argx-110、mga271、利瑞鲁单抗(lirilumab)(bms-986015、iph2101)、iph2201、agx-115、依玛妥珠单抗(emactuzumab)、cc-90002和mnrp1685a、或其抗原结合片段。
[0267]
在一些实施方式中，所述靶向性分子是组织特异性归巢肽。例如，在一些实施方式中，所述归巢肽可以含有seq id no：1～52中任一项所列的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述靶向性分子是rgd多肽如irgd多肽、lyp-1多肽、cripto-1结合性多肽、促生长素抑制素受体结合性多肽或抑制素结合性多肽、ngr多肽或ingr多肽。
[0268]
在一些实施方式中，所述靶向性分子是可激活细胞穿透肽(acpp)，该可激活细胞
穿透肽由聚阳离子细胞穿透肽(cpp)通过可切割接头与中和性聚阴离子连接而构成。例如，在一些实施方式中，所述acpp包括结构：a-x1-b-，其中，b是约5～约20个碱性氨基酸残基的肽部分，适合于细胞摄取；a是约2～约20个酸性氨基酸残基的肽部分，当与b部分连接时能有效地抑制或防止b部分的细胞摄取；x1是约2～约100个原子的可切割接头；并且有一个或多个l-y连接在肽部分b的c-末端。
[0269]
在一些实施方式中，所述靶向性分子是病毒颗粒，如病毒样颗粒、病毒样纳米颗粒或病毒衣壳。在一些实施方式中，所述靶向性分子是病毒样纳米颗粒。在一些实施方式中，所述病毒样纳米颗粒由l1衣壳蛋白组装而成。在一些实施方式中，所述病毒样纳米颗粒由l1和l2衣壳蛋白的组合组装而成。在一些实施方式中，所述靶向性分子与被感染的细胞结合。在一些实施方式中，所述靶向性分子如wo2015042325中所述。
[0270]
在一些实施方式中，病毒样颗粒(vlp)是指组织好的衣壳样结构，例如形状为大致球形或圆柱形，其包含l1或者l1和l2衣壳粒的自组装有序阵列，并且不包括病毒基因组。在一些实施方式中，病毒样颗粒在形态学和抗原性方面类似于真正的病毒颗粒，但它们缺乏病毒核酸之类的病毒遗传物质，使得该颗粒没有感染性。vlp可以用于将预防剂、治疗剂或诊断剂、或者闭环或线性dna或rna分子之类的药剂递送至接受细胞。
[0271]
在一些实施方式中，vlp可以具有相对于野生型vlp发生了改变的免疫原性和/或抗原性。例如，vlp可以由具有改变了免疫原性和/或抗原性的变异衣壳蛋白的衣壳粒组装而成。在一些实施方式中，改变了免疫原性和/或抗原性的变异衣壳蛋白是指发生了天然或合成的改变、例如氨基酸的突变、置换、缺失、peg化或插入，从而减少或避免衣壳蛋白被预先存在的、例如内源性的病毒血清型特异性抗体识别。变异衣壳蛋白可以是人乳头瘤病毒(hpv)l1变种、非人乳头瘤病毒l1变种、或基于来自不同hpv血清型的氨基酸的组合的乳头瘤病毒l1变种。
[0272]
在一些实施方式中，vlp是乳头瘤病毒vlp。vlp可以是例如源自能感染人的病毒的人乳头瘤病毒vlp，而在其它实施方式中，vlp可以是非人乳头瘤病毒vlp。非人vlp的例子包括但不限于源自牛乳头瘤病毒、小鼠乳头瘤病毒、棉尾兔乳头瘤病毒以及猕猴或恒河猴乳头瘤病毒颗粒的vlp。在一些实施方式中，vlp是牛乳头瘤病毒病毒样纳米颗粒，例如1型病毒样纳米颗粒，例如由bpv l1衣壳蛋白或者bpv l1和bpv l2衣壳蛋白的组合组装而成。
[0273]
在一些实施方式中，衣壳蛋白是指蛋白质单体，多个该蛋白质单体形成衣壳粒低聚物。在一些实施方式中，衣壳粒是指病毒衣壳、即保护病毒遗传物质的蛋白质外壳的基本低聚结构单元。在一些实施方式中，衣壳蛋白可以包括乳头瘤病毒l1主要衣壳蛋白和乳头瘤病毒l2次要衣壳蛋白。在一些实施方式中，vlp仅含有l1衣壳蛋白，而在其它实施方式中，vlp含有l1和l2衣壳蛋白的混合物或组合。
[0274]
在一些实施方式中，病毒样颗粒中的l1衣壳蛋白的百分比大于病毒样颗粒中的l2衣壳蛋白的百分比。例如，在一些实施方式中，病毒样颗粒中的l1衣壳蛋白的百分比是病毒样颗粒中的衣壳蛋白总数的80％～100％。在一些实施方式中，病毒样颗粒中的l1衣壳蛋白的百分比至少为约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一些实施方式中，病毒样颗粒中的l2衣壳蛋白的百分比是病毒样颗粒中的衣壳蛋白总数的1％～25％。例如，在一些实施方式中，病毒样颗粒中的l2衣壳蛋白的百分比为至少或约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、
17％、18％、19％或20％。
[0275]
在一些实施方式中，病毒样颗粒含有12～72个l2蛋白。在一些实施方式中，病毒样颗粒含有360个l1蛋白和12～72个l2蛋白。在一些实施方式中，衣壳蛋白组装成直径20～60nm的病毒样纳米颗粒。例如，衣壳蛋白可以组装成直径至少或约20、25、30、35、40、45、50、55或60nm的病毒样纳米颗粒。
[0276]
在一些实施方式中，所述靶向性分子是darpin(预设计锚蛋白重复蛋白，designed ankyrin repeat protein)。一般来说，darpin源自天然锚蛋白重复蛋白，与包括例如人受体、细胞因子、激酶、人蛋白酶、病毒和膜蛋白在内的蛋白质结合(分子伴侣(molecular partners)ag zurich switzerland；参见第5章“预设计锚蛋白重复蛋白(darpins)：从研究到疗法(designed ankyrin repeat proteins(darpins):from research to therapy)”，酶学方法(methods in enzymology)，第503卷：101～134(2012)；和“使用srp噬菌体展示的具有亚纳摩尔级亲和力的darpin的高效筛选(efficient selection of darpins with sub-nanomolar affinities using srp phage display)”，j.mol.biol.(2008)382，1211～1227，其全文通过引用纳入本文)。在一些实施方式中，darpin是通过基因工程制备的抗体模拟蛋白，对靶蛋白具有高特异性和高结合亲和性。在一些实施方式中，darpin具有包含至少2个锚蛋白重复基序、例如包含至少3个、4个或5个锚蛋白重复基序的结构。darpin可以具有任意的合适的分子量，取决于重复基序的数量。例如，包含3个、4个或5个锚蛋白重复基序的darpin分别可以具有约10kda、约14kda或约18kda的分子量。
[0277]
在一些实施方式中，darpin包括提供结构的核心部分和留在核心外部且与靶点结合的靶点结合部分。在一些实施方式中，所述结构核心包括保守的氨基酸序列，并且所述靶点结合部分包括根据靶点而不同的氨基酸序列。
[0278]
在一些实施方式中，所述偶联物相对于每一个靶向性分子含有多个染料残基，其数量为约1～约1000，例如约1～约100、约1～约50、约1～约25、约1～约10、约1～约5。在一些实施方式中，染料分子与靶向性分子的比例为约2:1、3:1、4:1、5:1、10:1、15:1、20:1、25:1、50:1、75:1、100:1、150:1、200:1、250:1、300:1、350:1、400:1、450:1、500:1、550:1、600:1、650:1、700:1、750:1、800:1、850:1、900:1、950:1或1000:1、或者在上述任意两个数值之间。在一些实施方式中，所述靶向性分子可以含有最多2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000个染料分子。在一些实施方式中，所述靶向性分子可以含有多于1000个染料分子或少于10个染料分子。
[0279]
在一些实施方式中，例如所述靶向性分子是抗体或抗原结合片段之类的多肽时，相对于每一个靶向性分子的染料分子的数量可以为约2～5，例如约2～4，例如约3或3。在一些实施方式中，例如所述靶向性分子是病毒样颗粒(vlp)之类的纳米颗粒时，相对于靶向性分子的染料分子的数量可以为约10～1000、10～500、50～500或50～1000。因此，在一些实施方式中，所述靶向性分子可以含有约10～约1000个染料分子。
[0280]
在一些实施方式中，例如所述靶向性分子是vlp时，一个衣壳蛋白可以与多于一个染料分子偶联。例如，一个衣壳蛋白、如li或l2衣壳蛋白可以与1～5、如1、2、3、4或5个染料分子偶联。因此，衣壳蛋白可以有多于一个氨基酸与染料分子偶联。在一些实施方式中，一个衣壳蛋白可以与1～2、1～3或2～3个染料分子偶联。因此，一个衣壳蛋白可以有1、2、3、4
或5个不同氨基酸、如赖氨酸、精氨酸和/或组氨酸、或其它氨基酸与染料分子偶联。
[0281]
b.染料－靶向性分子偶联物的避光制备
[0282]
在一些实施方式中，提供在避光条件下制备酞菁染料－靶向性分子偶联物、如ir700－靶向性分子(如ir700－抗体)偶联物的方法或工艺。在一些实施方式中，所述方法包括：1)制备或提供酞菁染料和靶向性分子；2)在染料的暴露尽可能少的制造或产生偶联物的条件下将靶向性分子与酞菁染料接触；以及3)配制、纯化和/或分子偶联物，以制造含有药物物质的组合物，其中的一个或多个步骤、例如在一些情况下为所有步骤、在染料或含有染料的偶联物在环境光下的暴露尽可能少的条件下实施。
[0283]
在一些实施方式中，在制备所述染料和/或偶联物之前、之时和之后，不暴露在任何环境光下，或者不暴露在具有超过700勒克斯、超过600勒克斯、超过500勒克斯、超过400勒克斯、超过300勒克斯、超过200勒克斯或超过100勒克斯的强度的光下。在一些实施方式中，所述染料和/或偶联物在具有超过700勒克斯的强度的光下不暴露多于20分钟、多于10分钟或多于5分钟。在一些实施方式中，所述染料和/或偶联物在具有超过200勒克斯的强度的光下不暴露多于20分钟、多于10分钟或多于5分钟。
[0284]
在一些实施方式中，在所述方法的一个或多个步骤或者所述方法的所有步骤之前、之时或之后，保护所述染料和/或偶联物不受环境光、例如近红外(ir)范围内的光的影响。在一些实施方式中，在制备所述偶联物之前、之时和/或之后，所述染料和偶联物所暴露的光仅具有不被染料吸收或基本上不被染料吸收的波长。在一些实施方式中，在制备所述药物物质之前、之时和/或之后，所述染料和偶联物所暴露的光只有绿光。在一些实施方式中，在制备所述药物物质之前、之时和/或之后，所述染料和偶联物所暴露的光仅具有约400nm～650nm、如400nm～600nm、425nm～575nm或450nm～550nm范围内的波长。
[0285]
在一些实施方式中，在所述方法的一个或多个步骤或者所有步骤中，所述染料和/或偶联物所暴露的光仅具有不被染料吸收或基本上不被染料吸收的波长、以及小于700勒克斯、小于600勒克斯、小于500勒克斯、小于400勒克斯、小于300勒克斯、小于200勒克斯或小于100勒克斯的强度。在一些实施方式中，在所述方法的一个或多个步骤或者所有步骤中，所述染料和/或偶联物所暴露的光只有绿光，并且具有小于700勒克斯、小于600勒克斯、小于500勒克斯、小于400勒克斯、小于300勒克斯、小于200勒克斯或小于100勒克斯的强度。在一些实施方式中，在所述方法的一个或多个步骤或者所有步骤中，所述染料和偶联物所暴露的光仅具有约400nm～650nm、如400nm～600nm、425nm～575nm或450nm～550nm范围内的波长、以及小于700勒克斯、小于600勒克斯、小于500勒克斯、小于400勒克斯、小于300勒克斯、小于200勒克斯或小于100勒克斯的强度。
[0286]
在一些实施方式中，在制备、制造、配制和/或包装所述染料和/或偶联物之前、之时和之后，不暴露在任何环境光下，或者的总曝光量不超过5000勒克斯小时、不超过2500勒克斯小时、不超过1000勒克斯小时、不超过500勒克斯小时、不超过250勒克斯小时、不超过100勒克斯小时或不超过80勒克斯小时。在一些实施方式中，在所提供的方法中，在方法的整个实施过程中，所述染料和/或偶联物不暴露在任何环境光下，或者的总曝光量不超过5000勒克斯小时、不超过2500勒克斯小时、不超过1000勒克斯小时、不超过500勒克斯小时、不超过250勒克斯小时、不超过100勒克斯小时或不超过80勒克斯小时。例如，在整个方法中或者在制备、制造、配制和/或包装所述染料和/或偶联物之前、之时和之后，所述染料和/或
偶联物的总曝光量不超过500勒克斯小时、不超过250勒克斯小时、不超过100勒克斯小时、不超过50勒克斯小时或不超过25勒克斯小时。总曝光量通过将照明强度(lux)乘以曝光时间(hours)来确定。
[0287]
在一些实施方式中，在本发明所提供的方法的一个或多个步骤或者所有步骤中，所述染料和/或偶联物在任何光下的总暴露量不超过5000勒克斯小时、不超过2500勒克斯小时、不超过1000勒克斯小时、不超过500勒克斯小时、不超过250勒克斯小时、不超过100勒克斯小时或不超过80勒克斯小时。例如，在包装步骤中，所述染料和/或偶联物的总曝光量不超过500勒克斯小时、不超过250勒克斯小时、不超过100勒克斯小时、不超过50勒克斯小时或不超过25勒克斯小时。
[0288]
在一些实施方式中，在所述方法的一个或多个步骤或者所有步骤中，通过使用保护内容物不受光的影响或者不受某些波长或强度的光的影响的一个或多个容器来实施所述方法的步骤，来保护所述染料和/或偶联物不受光的影响。例如，在一些实施方式中，在所述方法中使用一个、两个、三个或更多个避光容器。例如，在一些实施方式中，所述容器具有不大于50％、不大于40％、不大于30％、不大于20％、不大于10％、不大于5％或不大于1％的透光率。在一些实施方式中，所述容器确保具有约250nm～800nm、如约250nm～450nm、400nm～800nm、450nm～650nm、500nm～725nm、600nm～720nm或650nm～725nm的波长的光不透过，或者不让超过700勒克斯、600勒克斯、500勒克斯、400勒克斯、300勒克斯、200勒克斯或100勒克斯的强度的光透过。在一些实施方式中，所述染料和/或偶联物在半透明或不透明容器内制备。在一些实施方式中，所述容器是绿色、蓝色或琥珀色的。在一些实施方式中，所述容器用箔之类的不透明材料、如铝箔覆盖。在一些实施方式中，所述容器用具有小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％或小于5％的透光率的材料覆盖。在一些实施方式中，所述容器是药瓶、管子、注射器、包、袋子和/或盒子。
[0289]
在一些实施方式中，偶联物的制造方法包括制备或制造所述偶联物的步骤。在一些实施方式中，该方法包括提供酞菁染料。在一些实施方式中，所述酞菁染料以水性形式、如水溶液的形式提供。在一些实施方式中，所述染料以冻干形式、如冻干粉的形式提供，并且重建或溶解于溶剂中以形成水溶液。例如，在一些实施方式中，含有反应性基团的所述酞菁染料、如ir 700nhs酯溶解于溶剂。在一些实施方式中，所述方法包括例如在将所述染料与靶向性分子偶联之前将所述酞菁染料溶解于溶剂的步骤。在一些实施方式中，所述溶剂是有机溶剂，如二甲亚砜(dmso)或dmf。在一些实施例中，所述溶剂是水基溶剂。在一些实施方式中，所述染料以约0.1mg/ml～100mg/ml、1mg/ml～50mg/ml、1mg/ml～15mg/ml的浓度溶解于溶解，或者以约10mg/ml的浓度溶解于溶剂。
[0290]
在一些实施方式中，在制备用于所述方法的所述染料的步骤中，确保所述酞菁染料、如ir700 nhs酯不暴露在环境光下。在一些实施方式中，在制备所述酞菁染料之前、之时和之后，所述染料不暴露在环境光之类的光下，或者仅暴露在具有约400nm～650nm、如约425nm～475nm范围内的波长的光下。在一些实施方式中，所述酞菁染料不暴露在具有超过700勒克斯的强度的光下，或者在具有超过700勒克斯的强度的光下不暴露多于10分钟或多于5分钟。在一些实施方式中，所述酞菁染料不暴露在具有超过200勒克斯的强度的光下，或者在具有超过200勒克斯的强度的光下不暴露多于10分钟或多于5分钟。
[0291]
在一些实施方式中，制备或制造偶联物的步骤包括提供用于与所述酞菁染料、如
ir700偶联的靶向性分子(如抗体)。在一些实施方式中，所述靶向性分子在与所述酞菁染料偶联之前制备。在一些实施方式中，制备所述靶向性分子包括在偶联反应之前将所述靶向性分子浓缩或稀释至特定的量或浓度。在一些实施方式中，制备所述靶向性分子包括将所述靶向性分子交换至缓冲液、例如与偶联反应相容或适合于偶联反应的缓冲液中。在一些实施方式中，制备所述靶向性分子包括将ph调整至适合用于偶联反应的ph。例如，在约6～10、如约8～9、如约8.5、如约8.46的ph下制备抗体之类的靶向性分子。
[0292]
在一些实施方式中，所述抗体之类的靶向性分子例如采用超滤/渗滤、如采用切向流过滤(tff)进行缓冲液交换。在一些实施方式中，所述tff包括再生膜，例如再生纤维素膜。在一些实施方式中，所述靶向性分子所交换至的所述缓冲液是磷酸钠缓冲液、例如100mm磷酸钠，例如具有8.5或8.65的ph。在一些实施方式中，实施切向流过滤直至滤液达到所需ph为止。在一些实施方式中，所需ph为约6～10，例如约8～9，例如约8.5，例如8.46。
[0293]
在一些实施方式中，所述靶向性分子以约0.01g～100g、约1g～50g、约1g～25g、约5g～15g或约12g的量提供。在一些实施方式中，靶向性分子的制备体积为约0.01l～100l、约1l～50l、约1l～15l或约6l。在一些实施方式中，抗体之类的所述靶向性分子的浓度低于0.01mg/ml，或者为约0.1mg/ml～100.0mg/ml、约0.1mg/ml～50mg/ml、约0.1mg/ml～10mg/ml或约1mg/ml～5mg/ml，或者为约5mg/ml或4.5mg/ml，或者为约2mg/ml。在一些实施方式中，抗体之类的所述靶向性分子稀释至例如约0.1mg/ml～100.0mg/ml、约0.1mg/ml～50mg/ml、约0.1mg/ml～10mg/ml、约1mg/ml～5mg/ml或约1.8mg/ml～2.4mg/ml的浓度，或者稀释至约2mg/ml的浓度。
[0294]
在一些实施方式中，抗体之类的所述靶向性分子通过无菌滤器、如0.2μm滤器或0.22μm滤器过滤。在一些实施方式中，所制备的靶向性分子储存在例如低于30℃、如通常低于26℃、20℃、15℃、10℃、如通常约2～8℃的温度下。在一些实施方式中，确定所述靶向性分子的重量。
[0295]
在一些实施方式中，偶联物的制造方法包括将例如任意的上述靶向性分子(如抗体)与酞菁染料(如ir700)接触的步骤。在一些实施方式中，酞菁染料和靶向性分子在反应器之类的容器内混合在一起。在一些实施方式中，所述接触步骤在容器或器皿、如反应器内进行。在一些实施方式中，所述器皿是管子、瓶子或坛子。在一些实施方式中，所述器皿的最大体积为约或至少1l、2l、5l、10l、15l、20l、30l、40l、50l或100l。在一些实施方式中，所述器皿是40l坛子。在一些实施方式中，所述器皿的最大体积为约或至少100μl、500μl、1ml、1.5ml、5ml、15ml、50ml、250ml或500ml。在一些实施方式中，所述容器或器皿是半透明或不透明的，是绿色或琥珀色的，和/或用不透明的箔、如铝箔覆盖、如包裹。
[0296]
在一些实施方式中，用于与靶向性分子接触的染料的量基于容器或器皿内存在的靶向性分子的重量来计算。例如，在一些实施方式中，所加入的染料的量使得染料与靶向性分子的最终摩尔比为约1:1～1000:1、约1:1～100:1、约1:1～10:1、约1:1～4:1或约4:1或4:1。
[0297]
在一些实施方式中，例如所述靶向性分子是病毒样颗粒(vlp)时，染料分子与靶向性分子的比例为约10:1～1000:1、10:1～500:1、50:1～500:1或50:1～1000:1。因此，在一些实施方式中，所述靶向性分子可以含有约10～约1000个染料分子。在一些实施方式中，染料分子与靶向性分子的比例为约10:1、15:1、20:1、25:1、50:1、75:1、100:1、150:1、200:1、
250:1、300:1、350:1、400:1、450:1、500:1、550:1、600:1、650:1、700:1、750:1、800:1、850:1、900:1、950:1或1000:1、或者在上述任意两个数值之间。在一些实施方式中，所述靶向性分子可以含有最多10、15、20、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000个染料分子。在一些实施方式中，所述靶向性分子可以含有多于1000个染料分子或少于10个染料分子。
[0298]
在一些实施方式中，选择染料与靶向性分子的比例，使得每一个靶向性分子结合所需数量的染料残基。在一些实施方式中，每一个靶向性分子的染料残基的所需数量为约1～50、约1～25、约1～10、约1～5、约2～5、约2～3、或者约3或3。
[0299]
在一些实施方式中，例如所述靶向性分子是vlp时，一个衣壳蛋白可以与多于一个染料分子偶联。例如，一个衣壳蛋白、如li或l2衣壳蛋白可以与1～5、如1、2、3、4或5个染料分子偶联。因此，衣壳蛋白可以有多于一个氨基酸与染料分子偶联。在一些实施方式中，一个衣壳蛋白可以与1～2、1～3或2～3个染料分子偶联。因此，一个衣壳蛋白可以有1、2、3、4或5个不同氨基酸、如赖氨酸、精氨酸和/或组氨酸、或其它氨基酸与染料分子偶联。
[0300]
在一些实施方式中，所述接触步骤在染料和靶向性分子共价或非共价连接、例如一起反应或相连或连接的条件下实施。
[0301]
在一些实施方式中，酞菁染料含有反应性化学基团，且通过将酞菁染料与靶向性分子接触，制得的偶联物含有与靶向性分子的连接基团共价结合的酞菁染料。
[0302]
在一些实施方式中，所述染料和靶向性分子在受控的温度下接触，或者在具有受控的温度的单元、例如孵育器或冰箱内接触。在一些实施方式中，所述方法涉及将酞菁染料(如ir700)和靶向性分子(如抗体)在约4℃～37℃、如约10℃～30℃、约20℃～30℃或约23℃～27℃、或者约25℃
±
2.0℃、25℃
±
1.0℃或25℃
±
0.3℃、如约25℃范围内的温度下接触。在一些实施方式中，所述接触步骤在室温下、如21℃～25℃、如约23℃的温度下进行。
[0303]
在一些实施方式中，所述接触步骤包括对染料和靶向性分子进行孵育、例如进行反应。在一些实施方式中，所述接触可以在反应器内进行。在一些实施方式中，所述接触包括在接触的至少一部分中例如通过搅拌将染料和靶向性分子组合而成的组合物混合。在一些实施方式中，所述成分在例如搅拌板上搅拌。在一些实施方式中，所述成分搅拌约或至少5～30分钟，例如约5～20分钟，例如约10～15分钟。
[0304]
在一些实施方式中，所述接触步骤进行至少5分钟、至少15分钟、至少30分钟、至少60分钟、至少90分钟、至少120分钟、至少240分钟、至少360分钟、至少24小时、至少72小时或至少120小时。在一些实施方式中，所述接触步骤进行5分钟～150小时、5分钟～100小时、5分钟～48小时、5分钟～24小时、5分钟～6小时、5分钟～2小时、5分钟～90分钟、5分钟～60分钟、5分钟～30分钟、30分钟～150小时、30分钟～100小时、30分钟～48小时、30分钟～24小时、30分钟～6小时、30分钟～2小时、30分钟～90分钟、30分钟～60分钟、60分钟～150小时、60分钟～100小时、60分钟～48小时、60分钟～24小时、60分钟～6小时、60分钟～2小时、60分钟～90分钟、90分钟～150小时、90分钟～100小时、90分钟～48小时、90分钟～24小时、90分钟～6小时、90分钟～2小时、2小时～150小时、2小时～100小时、2小时～48小时、2小时～24小时、2小时～6小时、6小时～150小时、6小时～100小时、6小时～48小时、6小时～24小时、24小时～150小时、24小时～100小时、24小时～48小时、48小时～150小时、48小时～100小时或100小时～150小时。在一些实施方式中，所述基础进行5分钟～6小时、如5分钟～4小
时、5分钟～2小时、5分钟～60分钟、5分钟～30分钟、如约5分钟～20分钟、如约10分钟～15分钟的时间。在一些实施方式中，所述方法包括例如通过将酞菁染料(如ir700)和靶向性分子(如抗体)孵育至少或约15分钟、至少或约30分钟、至少或约60分钟、至少或约90分钟、至少或约120分钟、或者至少或约150分钟来进行接触。在一些实施方式中，所述方法包括将染料和靶向性分子接触、如反应约90～150分钟、如120分钟。
[0305]
在一些实施方式中，所述染料和靶向性分子在水性缓冲液中混合，该水性缓冲液可以包括dmso或dmf之类的有机溶剂。在一些实施方式中，所述溶剂是水基溶剂。在一些实施方式中，所述缓冲液的ph为约6～10，例如约7～10、约8～10或约8～9。
[0306]
在一些实施方式中，所述接触步骤在避光条件下进行。例如，在一些实施方式中，在所述接触步骤中，所述染料和偶联物不暴露在任何环境光下，或者不暴露在具有超过700勒克斯、超过600勒克斯、超过500勒克斯、超过400勒克斯、超过300勒克斯、超过200勒克斯或超过100勒克斯的强度的光下。在一些实施方式中，所述染料和偶联物在具有超过700勒克斯的强度的光下不暴露多于10分钟或多于5分钟。在一些实施方式中，所述染料和/或偶联物在具有超过200勒克斯的强度的光下不暴露多于10分钟或多于5分钟。
[0307]
在一些实施方式中，在所述接触步骤中，保护所述染料和偶联物不受环境光、例如近红外(ir)范围内的光的影响。在一些实施方式中，在所述接触步骤之前、之时和/或之后，所述染料和偶联物所暴露的光仅具有不被染料吸收或基本上不被染料吸收的波长。在一些实施方式中，在所述接触步骤之前、之时和/或之后，所述染料和偶联物所暴露的光只有绿光。在一些实施方式中，在所述接触步骤之前、之时和/或之后，所述染料和偶联物所暴露的光仅具有约400nm～600nm、如425nm～575nm或450nm～550nm范围内的波长。
[0308]
在一些实施方式中，在所述接触步骤中，所述染料和偶联物所暴露的光仅具有不被染料吸收或基本上不被染料吸收的波长、以及小于700勒克斯、小于600勒克斯、小于500勒克斯、小于400勒克斯、小于300勒克斯、小于200勒克斯或小于100勒克斯的强度。在一些实施方式中，在所述接触步骤中，所述染料和偶联物所暴露的光仅具有约400nm～600nm、如425nm～575nm或450nm～550nm范围内的波长、以及小于700勒克斯、小于600勒克斯、小于500勒克斯、小于400勒克斯、小于300勒克斯、小于200勒克斯或小于100勒克斯的强度。在一些实施方式中，在所述接触步骤中，所述染料和偶联物所暴露的光只有绿光、例如具有425nm～575nm的波长的光，并且具有小于700勒克斯、小于600勒克斯、小于500勒克斯、小于400勒克斯、小于300勒克斯、小于200勒克斯或小于100勒克斯的强度。在一些实施方式中，在所述接触步骤中，所述染料和/或偶联物在任何光下的总暴露量不超过5000勒克斯小时、不超过2500勒克斯小时、不超过1000勒克斯小时、不超过500勒克斯小时、不超过250勒克斯小时、不超过100勒克斯小时或不超过80勒克斯小时、不超过50勒克斯小时或不超过25勒克斯小时。
[0309]
在一些实施方式中，在所述接触步骤中，使用保护内容物不受光的影响或者不受某些波长或强度的光的影响的容器来保护所述染料和偶联物不受光的影响。例如，在一些实施方式中，所述容器具有不大于50％、不大于40％、不大于30％、不大于20％、不大于10％、不大于5％或不大于1％的透光率。在一些实施方式中，所述容器确保具有约500nm～725nm、如约650nm～725nm的波长的光不透过，或者不让超过700勒克斯、600勒克斯、500勒克斯、400勒克斯、300勒克斯、200勒克斯或100勒克斯的强度的光透过。在一些实施方式中，
所述染料和/或偶联物在半透明或不透明容器内制备。在一些实施方式中，所述容器是绿色、蓝色或琥珀色的。在一些实施方式中，所述容器用箔之类的不透明材料、如铝箔覆盖。
[0310]
在一些实施方式中，在本发明所提供的任意方法中，靶向性分子(如抗体)直接或间接地与酞菁染料(如ir700)连接。在一些实施方式中，靶向性分子(如抗体)提供共价键或非共价相互作用直接或间接地与酞菁染料(如ir700)连接。在一些实施方式中，所述共价或非共价的相互作用或连接是直接或间接的。在一些实施方式中，所述连接包括间接连接，例如通过接头(例如上述的任意示例性的接头)、结合性部分或结构域或反应性基团的连接。在一些实施方式中，所述连接包括靶向性分子和酞菁染料(如ir700)之间的直接相互作用。在其它实施方式中，靶向性分子和酞菁染料中的一者或两者与一个或多个接头连接，并且所述相互作用是间接的，例如与一个分子连接的接头和另一个分子之间的相互作用或者分别与靶向性分子或酞菁染料连接的两个接头之间的相互作用。
[0311]
在一些实施方式中，酞菁染料与靶向性分子非共价连接或相连。例如，酞菁染料通过非共价相互作用与靶向性分子形成复合物。在一些实施方式中，酞菁染料(如ir700)含有能够与靶向性分子的连接基团产生非共价相互作用的部分或结构域。在一些实施方式中，所述方法包括将酞菁染料(如ir700)和靶向性分子(如抗体)孵育或使其结合，以在染料和靶向性分子之间形成非共价相互作用。在一些实施例中，靶向性分子和酞菁染料之间的非共价相互作用包括例如静电相互作用、范德华力、疏水相互作用、π效应、离子相互作用、氢键、卤素键和/或它们的组合、或者基于上述一种或多种力的任意相互作用。在一些实施方式中，靶向性分子和酞菁染料利用模拟非共价分子相互作用的相互作用、例如配体－受体相互作用、抗体－抗原相互作用、亲和素－生物素相互作用、链霉亲和素－生物素相互作用、组氨酸－二价金属离子相互作用(如ni、co、cu、fe)、多聚化(如二聚化)结构域之间的相互作用、谷胱甘肽-s-转移酶(gst)－谷胱甘肽相互作用和/或它们的任意组合物而连接。
[0312]
在一些实施方式中，非共价相互作用部分或结构域与靶向性分子连接或是靶向性分子的一部分，并且与酞菁染料(如ir700)形成非共价相互作用、如复合物。在其它实施方式中，非共价相互作用分子或结构域与酞菁染料分子连接或是酞菁染料分子的一部分，并且与靶向性分子形成非共价相互作用、如复合物。在一些实施方式中，所述方法包括将与生物素偶联的靶向性分子(如抗体－生物素、例如西妥昔单抗－生物素)和与亲和素或其类似物或者链霉亲和素或其类似物偶联的酞菁染料、包括其单体形式(如单体亲和素-ir700或单体链霉亲和素-ir700)孵育或接触。在一些实施方式中，凭借亲和素、链霉亲和素或其类似物与生物素之间的非共价相互作用，酞菁染料(如ir700)与靶向性分子形成非共价复合物。
[0313]
在一些实施方式中，酞菁染料与靶向性分子共价连接，例如共价结合。在一些实施方式中，酞菁染料(如ir700)含有反应性基团以使其与靶向性分子连接。在一些实施方式中，通过靶向性分子(如抗体)与酞菁染料(如ir700)、例如含有反应性化学基团的染料的接触，产生含有与靶向性分子的连接基团连接的染料的偶联物。在一些实施方式中，所述连接包括间接连接，例如通过接头的连接。示例性的接头如上所述。在一些实施方式中，所述连接包括直接连接或共价连接，其中，所述共价连接是直链或支链的、环状或杂环状的、饱和或不饱和的，具有1～60个原子，例如选自c、n、p、o和s。在一些实施方式中，所述连接可以包含醚、硫醚、胺、酯、氨基甲酸酯、脲、硫脲、氧或酰胺键的任意组合。在一些实施方式中，所述
连接可以包含单键、双键、三键或芳香族碳－碳键，磷－氧、磷－硫、氮－氮、氮－氧或氮－铂键，或者芳香族或杂芳族键。
[0314]
在一些实施方式中，所述方法包括将酞菁染料(如ir700)与靶向性分子(如抗体)反应，以在染料和靶向性分子之间形成共价键。在一些实施方式中，所述键例如是酰胺、仲胺或叔胺、氨基甲酸酯、酯、醚、肟、磷酸酯、磺酰胺、硫醚、硫脲或脲。在一些实施方式中，所述键是共价键，例如酰胺或氨基甲酸酯键。在一些实施方式中，所述共价键是磷酸酯或其它连接基团。在一些实施方式中，所述键是磷酸二酯键(如为dna、rna的情况下)。
[0315]
在一些实施方式中，染料的反应性基团与靶向性分子的连接基团、如硫醇、羟基、羧基或氨基反应，在染料和靶向性分子之间形成连接。在一些实施方式中，靶向性分子的连接基团是赖氨酸残基。因此，在一些实施方式中，所述酞菁染料(如ir700)与靶向性分子的赖氨酸残基共价结合。
[0316]
在一些实施方式中，在所述接触步骤之后，所述反应例如通过加入甘氨酸之类的猝灭剂而猝灭。术语“猝灭”是指未反应的反应性基团与过量的非特异性猝灭剂(也称为猝灭物)反应，从而停止染料和靶向性分子之间的反应。根据与染料连接的特定反应性基团使用特定的试剂或猝灭物。例如，nhs-酯交联反应可以在含胺缓冲液、如含有tris或甘氨酸的缓冲液的存在下猝灭。
[0317]
在一些实施方式中，所述猝灭不仅除去任何未反应的染料。在一些实施方式中，所加入的猝灭剂的量为至少或约200mm、至少或约500mm、至少或约1m、至少或约2m、至少或约5m、或者至少或约10m。在一些实施方式中，猝灭反应涉及1m甘氨酸的加入。在一些实施方式中，加入至偶联反应后的猝灭剂的终浓度为至少或约1mm、至少或约2mm、至少或约3mm、至少或约4mm、至少或约5mm、或者至少或约10mm。在一些实施方式中，甘氨酸之类的猝灭剂的终浓度为约4.2nm。
[0318]
在一些实施方式中，在所述猝灭步骤中，反应器的内容物例如在搅拌板上混合、如搅拌。在一些实施方式中，反应器的内容物以约100rpm～1000rpm、约200rpm～500rpm搅拌，或者以300
±
50rpm或300rpm搅拌。在一些实施方式中，猝灭反应混合至少或约5分钟、至少或约10分钟、或者至少或约15分钟。在一些实施方式中，猝灭反应混合约10～12分钟。
[0319]
在一些实施方式中，在猝灭反应的混合之后，将反应器之类的容器例如在孵育器内恢复至受控的温度。在一些实施方式中，所述器皿的内容物在例如约21℃～30℃、例如约23℃～27℃、例如约25℃下孵育。在一些实施方式中，所述猝灭步骤的孵育、如猝灭剂与反应器的内容物混合后的额外的孵育进行至少或约10分钟、至少或约15分钟、至少或约20分钟、至少或约25分钟、或者至少或约30分钟。在一些实施方式中，孵育进行约20～25分钟。
[0320]
在一些实施方式中，所述猝灭步骤在避光条件下进行。例如，在一些实施方式中，在所述猝灭步骤中，所述偶联物不暴露在任何环境光下，或者不暴露在具有超过700勒克斯、超过600勒克斯、超过500勒克斯、超过400勒克斯、超过300勒克斯、超过200勒克斯或超过100勒克斯的强度的光下。在一些实施方式中，所述偶联物在具有超过700勒克斯的强度的光下不暴露多于10分钟或多于5分钟。在一些实施方式中，所述偶联物在具有超过200勒克斯的强度的光下不暴露多于10分钟或多于5分钟。
[0321]
在一些实施方式中，在所述猝灭步骤中，保护所述偶联物不受环境光、例如近红外(ir)范围内的光的影响。在一些实施方式中，在所述猝灭步骤中，所述偶联物所暴露的光仅
具有不被染料或偶联物吸收或者基本上不被染料或偶联物吸收的波长。在一些实施方式中，在所述猝灭步骤中，所述偶联物所暴露的光只有绿光。在一些实施方式中，在所述猝灭步骤中，所述偶联物所暴露的光仅具有约400nm～600nm、如425nm～575nm或450nm～550nm范围内的波长。
[0322]
在一些实施方式中，在所述猝灭步骤中，所述偶联物所暴露的光仅具有不被偶联物吸收或基本上不被偶联物吸收的波长、以及小于700勒克斯、小于600勒克斯、小于500勒克斯、小于400勒克斯、小于300勒克斯、小于200勒克斯或小于100勒克斯的强度。在一些实施方式中，在所述猝灭步骤中，所述偶联物所暴露的光仅具有约400nm～600nm、如425nm～575nm或450nm～550nm范围内的波长、以及小于700勒克斯、小于600勒克斯、小于500勒克斯、小于400勒克斯、小于300勒克斯、小于200勒克斯或小于100勒克斯的强度。在一些实施方式中，在所述猝灭步骤中，所述偶联物所暴露的光只有绿光、例如具有425nm～575nm的波长的光，并且具有小于700勒克斯、小于600勒克斯、小于500勒克斯、小于400勒克斯、小于300勒克斯、小于200勒克斯或小于100勒克斯的强度。在一些实施方式中，在所述猝灭步骤中，所述染料和/或偶联物在任何光下的总暴露量不超过5000勒克斯小时、不超过2500勒克斯小时、不超过1000勒克斯小时、不超过500勒克斯小时、不超过250勒克斯小时、不超过100勒克斯小时或不超过80勒克斯小时、不超过50勒克斯小时或不超过25勒克斯小时。
[0323]
在一些实施方式中，在所述猝灭步骤中，使用保护内容物不受光的影响或者不受某些波长或强度的光的影响的容器来保护所述偶联物不受光的影响。例如，在一些实施方式中，所述容器具有不大于50％、不大于40％、不大于30％、不大于20％、不大于10％、不大于5％或不大于1％的透光率。在一些实施方式中，所述容器确保具有约500nm～725nm、如约650nm～725nm的波长的光不透过，或者不让超过700勒克斯、600勒克斯、500勒克斯、400勒克斯、300勒克斯、200勒克斯或100勒克斯的强度的光透过。在一些实施方式中，所述偶联物在半透明或不透明容器内制备。在一些实施方式中，所述容器是绿色、蓝色或琥珀色的。在一些实施方式中，所述容器用箔之类的不透明材料、如铝箔覆盖。
[0324]
在一些实施方式中，本发明所提供的制造方法包括将所述偶联物配制、纯化或分离以制造药物物质的步骤。在一些实施方式中，将所述偶联物配制成约0.1mg/ml～约1000mg/ml、0.1mg/ml～约500mg/ml、0.1mg/ml～约200mg/ml、0.1mg/ml～约100mg/ml、0.1mg/ml～约50mg/ml、0.1mg/ml～约10mg/ml、0.5mg/ml～约10mg/ml或0.5mg/ml～约5mg/ml范围内的浓度。
[0325]
在一些实施方式中，所述偶联物的配制方法可以包括浓缩或稀释所述偶联物、将所述偶联物交换至药学上可接受的缓冲液中、或灭菌工艺。
[0326]
在一些实施方式中，所述配制步骤包括浓缩所述偶联物。在一些实施方式中，所述浓缩步骤包括减少所述偶联物的体积。在一些实施方式中，体积的减少采用超滤/渗滤系统来实现。在一些实施方式中，所述偶联物的体积从约10l、15l、20l、25l、30l、40l或50l减少至约5l、8l、9l、10l、12l或15l。在一些实施方式中，浓缩后的终体积为约8l～10l。在一些实施方式中，将所述偶联物浓缩至约0.1mg/ml～约1000mg/ml、0.1mg/ml～约500mg/ml、0.1mg/ml～约200mg/ml、0.1mg/ml～约100mg/ml、0.1mg/ml～约50mg/ml、0.1mg/ml～约10mg/ml、0.5mg/ml～约10mg/ml、0.5mg/ml～约5mg/ml或1.8mg/ml～约2.1mg/ml范围内的浓度。在一些实施方式中，所述偶联物浓缩至约2.0mg/ml。
[0327]
在一些实施方式中，所述配制步骤包括稀释所述偶联物。在一些实施方式中，所述偶联物的稀释涉及包含所述偶联物的缓冲液体积的增加，例如从约5l、10l、15l、20l、30l、40l或50l增加至约20l、30l、40l、50l或75l。在一些实施方式中，将所述偶联物稀释至约0.1mg/ml～约1000mg/ml、0.1mg/ml～约500mg/ml、0.1mg/ml～约200mg/ml、0.1mg/ml～约100mg/ml、0.1mg/ml～约50mg/ml、0.1mg/ml～约10mg/ml、0.5mg/ml～约10mg/ml或0.5mg/ml～约5mg/ml范围内的浓度。
[0328]
在一些实施方式中，所述配制步骤包括纯化所述偶联物。在一些实施方式中，所述偶联物通过使用sephadex g-50柱之类的设备的凝胶渗透色谱、或者通过透析除去未偶联的染料来纯化。在一些实施方式中，所述偶联物例如通过使用切向流过滤(tff)来超滤或渗滤。在一些实施方式中，超滤/渗滤在黑暗或避光条件下实施，以避免所述偶联物暴露在环境光下。
[0329]
在一些实施方式中，所述配制步骤包括将酞菁染料－靶向性分子偶联物(如ir700－靶向性分子偶联物，例如ir700－抗体偶联物)从反应缓冲液交换至药学上可接受的缓冲液中。在一些实施方式中，所述缓冲液交换可以通过超滤/渗滤来进行。
[0330]
在一些实施方式中，所述偶联物在例如含有药学上可接受的载体或载剂的药学上可接受的缓冲液中配制。通常，药学上可接受的载体或载剂、如药学上可接受的缓冲液中存在的载体或载剂可以是本领域已知的。雷明登药物科学、e.w.martin著、麦克出版公司(mack publishing co.)、宾夕法尼亚州伊斯顿、第19版(1995)描述了适合于一种或多种治疗性化合物的药物递送的组合物和制剂。
[0331]
在一些实施方式中，所述组合物的ph为约6～10，例如约6～8、约6.9～7.3，例如约ph 7.1。在一些实施方式中，所述药学上可接受的缓冲液的ph为至少或约5、至少或约6、至少或约7、至少或约8、至少或约9、或者至少或约10，或者为7.1。
[0332]
在一些实施方式中，所述药学上可接受的缓冲液或载体的性质取决于所采用的特定的给药形式。例如，在一些实施方式中，胃肠外制剂可以包含作为载剂的可注射液体，其包括药学上和生理学上可接受的液体、如水、生理盐水、平衡盐溶液、水性右旋糖或甘油。在一些实施方式中，对于固体组合物、例如粉末、丸剂、片剂或胶囊形式，无毒固体载体可以包括例如药物级的甘露糖醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除了生物学中性的载体外，在一些实施方式中，给予的药物组合物可以含有少量的无毒辅料，例如湿润剂或乳化剂、防腐剂和ph缓冲液、如乙酸钠或脱水山梨糖醇单月桂酸酯。
[0333]
在一些实施方式中，所述药学上可接受的缓冲液是磷酸盐缓冲盐水(pbs)。在一些实施方式，pbs的ph为约7.1。
[0334]
在一些实施方式中，所述配制步骤包括例如通过无菌滤器进行所述偶联物的过滤。在一些实施方式中，所述偶联物通过无菌滤器、例如约0.2μm滤器、如0.22μm滤器进行过滤。
[0335]
在一些实施方式中，在所述配制步骤中，保护所述偶联物不受被偶联物强烈吸收的波长的光的影响。例如，在一些实施方式中，所述浓缩在避光冰箱内实施。
[0336]
在一些实施方式中，所述配制步骤在避光条件下进行。例如，在一些实施方式中，在所述配制步骤中，所述偶联物不暴露在任何环境光下，或者不暴露在具有超过700勒克斯、超过600勒克斯、超过500勒克斯、超过400勒克斯、超过300勒克斯、超过200勒克斯或超
过100勒克斯的强度的光下。在一些实施方式中，所述偶联物在具有超过700勒克斯的强度的光下不暴露多于10分钟或多于5分钟。在一些实施方式中，所述偶联物在具有超过200勒克斯的强度的光下不暴露多于10分钟或多于5分钟。
[0337]
在一些实施方式中，在所述配制步骤中，保护所述偶联物不受环境光、例如近红外(ir)范围内的光的影响。在一些实施方式中，在所述配制步骤中，所述偶联物所暴露的光仅具有不被偶联物吸收或者基本上不被偶联物吸收的波长。在一些实施方式中，在所述配制步骤中，所述偶联物所暴露的光只有绿光。在一些实施方式中，在所述配制步骤中，所述偶联物所暴露的光仅具有约400nm～600nm、如425nm～575nm或450nm～550nm范围内的波长。
[0338]
在一些实施方式中，在所述配制步骤中，所述偶联物所暴露的光仅具有不被偶联物吸收或基本上不被偶联物吸收的波长、以及小于700勒克斯、小于600勒克斯、小于500勒克斯、小于400勒克斯、小于300勒克斯、小于200勒克斯或小于100勒克斯的强度。在一些实施方式中，在所述配制步骤中，所述偶联物所暴露的光仅具有约400nm～600nm、如425nm～575nm或450nm～550nm范围内的波长、以及小于700勒克斯、小于600勒克斯、小于500勒克斯、小于400勒克斯、小于300勒克斯、小于200勒克斯或小于100勒克斯的强度。在一些实施方式中，在所述配制步骤中，所述偶联物所暴露的光只有绿光、例如具有425nm～575nm的波长的光，并且具有小于700勒克斯、小于600勒克斯、小于500勒克斯、小于400勒克斯、小于300勒克斯、小于200勒克斯或小于100勒克斯的强度。在一些实施方式中，在所述配制步骤中，所述染料和/或偶联物在任何光下的总暴露量不超过5000勒克斯小时、不超过2500勒克斯小时、不超过1000勒克斯小时、不超过500勒克斯小时、不超过250勒克斯小时、不超过100勒克斯小时或不超过80勒克斯小时、不超过50勒克斯小时或不超过25勒克斯小时。
[0339]
在一些实施方式中，在所述配制步骤中，通过将内部发生反应的容器置于避光区域、例如黑暗区域，来保护所述偶联物不受光的影响。例如，在一些实施方式中，例如通过将tff之类的超滤/渗滤装置置于冰箱之类的黑暗区域，在黑暗中进行所述超滤/渗滤。在一些实施方式中，在所述配制步骤中，使用保护内容物不受光的影响或者不受某些波长或强度的光的影响的容器来保护所述偶联物不受光的影响。例如，在一些实施方式中，所述容器具有不大于50％、不大于40％、不大于30％、不大于20％、不大于10％、不大于5％或不大于1％的透光率。在一些实施方式中，所述容器确保具有约500nm～725nm、如约650nm～725nm的波长的光不透过，或者不让超过700勒克斯、600勒克斯、500勒克斯、400勒克斯、300勒克斯、200勒克斯或100勒克斯的强度的光透过。在一些实施方式中，所述偶联物在半透明或不透明容器内制备。在一些实施方式中，所述容器是绿色、蓝色或琥珀色的。在一些实施方式中，所述容器用箔之类的不透明材料、如铝箔覆盖。在一些实施方式中，所述容器用具有小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％或小于5％的透光率的材料覆盖。
[0340]
在一些实施方式中，在药物产品的包装、如装瓶之前，将配制好的药物物质储存起来。在一些实施方式中，将配制好的偶联物储存在黑暗中和/或储存在不透明或半透明的容器、如绿色或琥珀色容器内，或者储存在用不透明的箔、如铝箔覆盖、如包裹的容器内。在一些实施方式中，将配制好的药物物质储存在冰箱内，例如约2-8℃、如约4℃下。
[0341]
包装药物物质以制造药物产品
[0342]
在一些实施方式中，所述方法包括包装酞菁染料－靶向性分子偶联物(如ir700－靶向性分子偶联物，例如ir700－抗体偶联物)，例如包装如上所述制备的药物物质，以生产
包装好的药物产品。在一些实施方式中，所述药物物质在制备后4周内、如制备后1周、2周或3周内包装在例如一个或多个容器内。在一些实施方式中，所述容器是药瓶、管子、注射器、包、袋子或盒子、或者它们的组合。
[0343]
本发明也提供避光容器之类的容器和/或避光装置之类的装置，其含有本文所述的任意偶联物或组合物或者用本文所述的任意方法制造或产生的任意偶联物或组合物。本发明也提供用于保护本文所述的任意偶联物或组合物或者用本文所述的任意方法制造或产生的任意偶联物或组合物的包装系统。在一些实施方式中，这种包装系统包括一个或多个本文所述的容器。
[0344]
本发明也提供药盒或制品，其含有本文所提供的容器、装置和/或包装系统，用于保护所述偶联物或组合物，并且用于储存和/或给药。所述药盒可以包括容器和/或包装系统、能够覆盖能进行包含酞菁染料－靶向性分子偶联物的组合物的给药的装置的避光盖、以及任选的使用说明书。所述药盒也可以含有针对药盒内容物或与药盒内容物有关的标签或药品说明书。所述药盒或制品还可以包括揭示容器和/或包装系统内所含的偶联物或组合物的使用、储存或给药的说明的药品说明书。
[0345]
在一些实施方式中，将所述偶联物包装在一个或多个容器、如避光容器内。在一些实施方式中，所述容器是药瓶，例如去热原的玻璃药瓶。在一些实施方式中，所述容器、如药瓶阻挡特定波长的光、例如被染料或染料－靶向性分子偶联物吸收的波长的光。因此，在一些实施方式中，所述容器保护其中所含的偶联物不受具有小于约250nm或约550nm～750nm的波长的光的影响。在一些实施方式中，所述容器确保具有约500nm～725nm、如约650nm～725nm的波长的光不透过。在一些实施方式中，所述容器只允许特定波长的光、例如约400nm～600nm、如约425nm～575nm或约450nm～550nm的光透过。在一些实施方式中，所述容器是绿色、蓝色、琥珀色、半透明、不透明、或包在箔之类的不透明材料、如铝箔中。在一些实施方式中，所述容器是无菌的或去热原的。在一些实施方式中，所述容器确保光不透过，使得透光率百分数小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％或小于5％。
[0346]
在一些实施方式中，所述容器的最大体积为至少或约5ml、至少或约10ml、至少或约25ml、至少或约50ml、例如51
±
1ml、至少或约100ml、至少或约250ml、至少或约500ml、或者至少或约1l。
[0347]
在一些实施方式中，例如所述容器是药瓶时，药瓶在填充之前塞上塞子并盖紧。在一些实施方式中，确定平均空瓶重量，并用其来确定填充后的药瓶的重量范围。
[0348]
在一些实施方式中，所述包装包括半自动无菌填充。例如，在一些实施方式中，使用蠕动泵和填充针组件将所述偶联物填充至容器如药瓶中。在一些实施方式中，所述偶联物在填充之前通过例如约0.2μm滤器、如0.22μm滤器进行无菌过滤。在一些实施方式中，对无菌滤液进行称重，以确定要填充的容器如药瓶的大致数量。
[0349]
在一些实施方式中，所述方法包括用至少0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml、1ml、1.5ml、2.0ml、3.0ml、5.0ml、10.0ml、20.0ml、30.0ml、40.0ml、50.0ml或更多、例如通常为0.5ml～50ml或1ml～10ml体积量的染料－偶联物药物物质来填充药瓶。在一些实施方式中，填充的所有药瓶含有相同体积和量的染料偶联物。在一些实施方式中，所述制造方法可实现多个药瓶、例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50或更多个药瓶的填充。
[0350]
在一些实施方式中，在一个容器内含有单次剂量的偶联物。在一些实施方式中，在
多个容器内、例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个容器内提供单次剂量。
[0351]
在一些实施方式中，在所述填充步骤之后，将容器如药瓶塞上塞子、密封并盖紧。在一些实施方式中，所述容器避光储存在例如不透明的箱子中，储存在例如低于或等于或约26℃、如低于或等于或约20℃、15℃、8℃、0℃、-20℃或-80℃的温度下。在一些实施方式中，所述温度为约20～26℃、如23
±
3℃，或为约2℃～8℃、如5
±
3℃，例如为约4℃或约5℃，或为低于0℃、如约-20或-80℃。
[0352]
在一些实施方式中，所述容器如药瓶带有标签。在一些实施方式中，在室温下贴标签，并且注意避免偶联物暴露在室温下的时间。例如，在一些实施方式中，所述容器在常温下暴露少于或约30分钟，例如少于或约20分钟、少于或约10分钟、少于或约2分钟、或者少于或约1分钟。
[0353]
在一些实施方式中，还对所述容器进行包装以保护内容物不受光的影响。在一些实施方式中，提供一种包装系统，其包括内部包装材料，该内部包装材料包含含有酞菁染料－靶向性分子偶联物(如ir700－靶向性分子偶联物，例如ir700－抗体偶联物)的容器。在一些实施方式中，所述内部包装材料具有小于20％、例如小于15％、小于10％、小于5％或小于1％的透光率。在一些实施方式中，所述包装系统包括包含所述内部包装材料的外部包装材料。在一些实施方式中，所述外部包装材料具有小于20％、例如小于15％、小于10％、小于5％或小于1％的透光率。在一些实施方式中，所述内部或外部包装材料包括不透明的箔、如铝箔。在一些实施方式中，所述容器用具有小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％或小于5％的透光率的材料覆盖。在一些实施方式中，所述第二包装材料是铝袋。在一些实施方式中，所述外部包装材料包含卡纸板。
[0354]
在一些实施方式中，所述内部和/或外部包装材料适合于所述偶联物的储存。在一些实施方式中，所述内部和/或外部包装材料适合于所述偶联物的货运。
[0355]
本发明也提供用于保护酞菁染料－靶向性分子偶联物不受光的影响的包装系统，其包括一个或多个容器，例如一个、两个、三个或更多个容器。本发明所提供的包装系统中的各容器或所有容器可以是避光容器，例如本文所述的任意避光容器。
[0356]
在一些实施方式中，所述包装系统包括两个容器：包含本文所述的任意容器的第一容器、和包含所述第一容器的第二容器，其中，所述第二容器确保具有约250nm～约800nm、约250nm～约450nm、约400nm～约800nm、约450nm～约650nm或约600nm～约720nm的波长的光不透过。
[0357]
在一些实施方式中，所述第二容器确保光不透过，使得透光率百分数小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％或小于5％。在一些实施方式中，所述第二容器是绿色、蓝色、琥珀色、半透明、不透明、或用具有小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％或小于5％的透光率的材料覆盖。在一些实施方式中，所述第一和第二容器独立地选自药瓶、管子、注射器、包、袋子和盒子。
[0358]
在一些实施方式中，所提供的任意包装系统还包括包含所述第二容器的第三容器，其中，所述第三容器确保具有约250nm～约800nm、约250nm～约450nm、约400nm～约800nm、约450nm～约650nm或约600nm～约720nm的波长的光不透过。在一些实施方式中，所述第三容器确保光不透过，使得透光率百分数小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％或小于5％。在一些实施方式中，所述第三容器是绿色、蓝色、琥珀色、半透明、不透
明、或用具有小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％或小于5％的透光率的材料覆盖。在一些实施方式中，所述第三容器选自药瓶、管子、注射器、包、袋子和盒子。
[0359]
在一些实施方式中，所述容器或包含所述偶联物的容器或包装系统、例如包含单次剂量的一个容器或多个容器、包装在药盒中。因此，在一些实施方式中，所述药盒包括一份或多份单次剂量。在一些实施方式中，所述药盒包括例如关于在例如避光条件下进行偶联物给药的说明书。在一些实施方式中，所述药盒包含用于保护所述偶联物不受光的影响的材料，例如不透明的箔、不透明的容器、不透明的静脉内(iv)注射包、或用于保护iv注射包的不透明的套筒。
[0360]
例如，在一些实施方式中，所述药盒包括：本文所述的任意容器或本文所述的任意包装系统、能够覆盖能进行包含酞菁染料－靶向性分子偶联物的组合物的给药的装置的避光盖、以及任选的使用说明书。在一些实施方式中，所述给药装置是静脉内输液包或注射器。在一些实施方式中，所述避光盖确保具有约250nm～约800nm、约250nm～约450nm、约400nm～约800nm、约450nm～约650nm或约600nm～约720nm的波长的光不透过。在一些实施方式中，所述避光盖确保光不透过，使得透光率百分数小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％或小于5％。在一些实施方式中，所述避光盖是绿色、蓝色、琥珀色、半透明、不透明、或用具有小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％或小于5％的透光率的材料覆盖。
[0361]
在一些实施方式中，在包装所述偶联物之前、之时和之后，保护所述偶联物不受环境光、例如近红外(ir)范围内的光的影响。在一些实施方式中，在制备所述药物物质之前、之时和/或之后，所述染料和偶联物所暴露的光只有绿光。在一些实施方式中，在制备所述药物物质之前、之时和/或之后，所述染料和偶联物所暴露的光仅具有约400nm～600nm、如425nm～575nm或450nm～550nm范围内的波长。在一些实施方式中，在制备所述药物物质之前、之时和/或之后，所述染料和偶联物所暴露的光仅具有不被染料吸收或基本上不被染料吸收的波长。
[0362]
在一些实施方式中，在制备所述药物物质之前、之时和之后，所述染料和/或偶联物不暴露在任何环境光下，或者不暴露在具有超过700勒克斯、超过600勒克斯、超过500勒克斯、超过400勒克斯、超过300勒克斯、超过200勒克斯或超过100勒克斯的强度的光下。在一些实施方式中，在所述包装步骤中，所述染料和/或偶联物在任何光下的总暴露量不超过5000勒克斯小时、不超过2500勒克斯小时、不超过1000勒克斯小时、不超过500勒克斯小时、不超过250勒克斯小时、不超过100勒克斯小时或不超过80勒克斯小时、不超过50勒克斯小时或不超过25勒克斯小时。
[0363]
酞菁染料－靶向性分子偶联物的特征
[0364]
在一些实施方式中，提供稳定的酞菁染料－靶向性分子偶联物，如ir700染料－靶向性分子偶联物，例如ir700－抗体偶联物。也提供根据本文所述的任意制造方法制造、配制或包装的偶联物、如稳定偶联物。
[0365]
在一些实施方式中，所述偶联物所具有的染料与靶向性分子(如ir700于靶向性分子)的摩尔比为约1:1～1000:1、约1:1～100:1、约1:1～10:1、约1:1～4:1或约4:1或4:1。
[0366]
在一些实施方式中，所述偶联物(如ir700－靶向性分子，例如ir700－抗体)的浓度在约0.1mg/ml～1000mg/ml、0.1mg/ml～500mg/ml、0.1mg/ml～200mg/ml、0.1mg/ml～
100mg/ml、0.1mg/ml～50mg/ml、0.1mg/ml～10mg/ml、0.5mg/ml～10mg/ml、0.5mg/ml～5mg/ml或1.8mg/ml～2.1mg/ml的范围内。在一些实施方式中，所述偶联物的浓度为约2.0mg/ml，或者浓度为2.0mg/ml。
[0367]
在一些实施方式中，通过所述方法制造的偶联物的量多于约1克、多于约2克、多于约3克、多于约4克、多于约5克或多于约10克。在一些实施方式中，所述偶联物用药品生产质量管理规范(gmp)制造。
[0368]
在一些实施方式中，所提供的酞菁染料－靶向性分子偶联物(如ir700-靶向性分子偶联物，例如ir700-抗体偶联物)是稳定的，且在储存过程中或储存之后、例如3个月或更长的时间内发生尽可能少的光诱导的聚集之类的聚集。因此，在一些实施方式中，所述偶联物在至少3、4、5、6、7、8或9个月的时间内稳定，或者在约或至少一年或更长的时间内稳定。在一些实施方式中，所述偶联物在多于1年的时间内稳定。
[0369]
在一些实施方式中，所述偶联物的稳定性可通过评价偶联物的单体百分含量来测定。在一些实施方式中，所述偶联物在制备或储存后3个月、多于3个月或更长的时间内显示出大于90％的单体含量，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的单体含量。在一些实施方式中，如果所述偶联物在制备或储存后3个月或更长的时间内显示出小于10％的高分子量(hmw)物质、例如小于9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的hmw，则所述偶联物具有稳定性。
[0370]
在一些实施方式中，所述偶联物的效价或活性可通过评价偶联物的ed50或者通过评价偶联物诱导或介导pit杀伤的能力来测定。在一些实施方式中，所述偶联物与储存前的偶联物、如t＝0时的偶联物相比，在储存后3个月、多于3个月或更长的时间内显示出大于约30％的效价或活性，例如大于约40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的效价或活性。
[0371]
在一些实施方式中，所述稳定的酞菁染料－靶向性分子偶联物、如ir700染料－靶向性分子偶联物(例如ir700－抗体偶联物)是稳定的，这是在例如如上所述的避光条件下制备或制造或储存染料或染料偶联物的结果。
[0372]
在一些实施方式中，影响所述偶联物的稳定性的因素是保护偶联物不受光的影响，因此是保护偶联物不发生光诱导的聚集。因此，在一些实施方式中，所述偶联物的稳定性是通过保护其不受光的影响或者不受某些波长或强度的光的影响而赋予的。例如，在一些实施方式中，所述偶联物不暴露在任何环境光下，或者不暴露在具有超过700勒克斯、超过600勒克斯、超过500勒克斯、超过400勒克斯、超过300勒克斯、超过200勒克斯或超过100勒克斯的强度的光下。在一些实施方式中，所述偶联物在具有超过700勒克斯的强度的光下不暴露多于10分钟或多于5分钟。在一些实施方式中，所述偶联物在具有超过200勒克斯的强度的光下不暴露多于10分钟或多于5分钟。在一些实施方式中，在所提供的方法的步骤中，所述染料和偶联物在任何光下的总暴露量不超过5000勒克斯小时、不超过2500勒克斯小时、不超过1000勒克斯小时、不超过500勒克斯小时、不超过250勒克斯小时、不超过100勒克斯小时或不超过80勒克斯小时。
[0373]
在一些实施方式中，保护所述偶联物不受环境光、例如近红外(ir)范围内的光的影响。在一些实施方式中，所述偶联物所暴露的光仅具有不被偶联物吸收或者基本上不被偶联物吸收的波长。在一些实施方式中，所述偶联物所暴露的光只有绿光。在一些实施方式中，所述偶联物所暴露的光仅具有约400nm～600nm、如425nm～575nm或450nm～550nm范围
内的波长。
[0374]
在一些实施方式中，所述偶联物所暴露的光仅具有不被偶联物吸收或基本上不被偶联物吸收的波长、以及小于700勒克斯、小于600勒克斯、小于500勒克斯、小于400勒克斯、小于300勒克斯、小于200勒克斯或小于100勒克斯的强度。在一些实施方式中，所述偶联物所暴露的光仅具有小于700勒克斯、小于600勒克斯、小于500勒克斯、小于400勒克斯、小于300勒克斯、小于200勒克斯或小于100勒克斯的强度。在一些实施方式中，所述偶联物所暴露的光仅具有约400nm～600nm、如425nm～575nm或450nm～550nm范围内的波长、以及小于700勒克斯、小于600勒克斯、小于500勒克斯、小于400勒克斯、小于300勒克斯、小于200勒克斯或小于100勒克斯的强度。
[0375]
在一些实施方式中，所述偶联物在避光容器内储存后具有稳定性。在一些实施方式中，使用保护内容物不受光的影响或者不受某些波长或强度的光的影响的容器来保护所述偶联物不受光的影响。例如，在一些实施方式中，所述容器具有不大于50％、不大于40％、不大于30％、不大于20％、不大于10％、不大于5％或不大于1％的透光率。在一些实施方式中，所述容器确保具有约500nm～725nm、如约650nm～725nm的波长的光不透过，或者不让超过700勒克斯、600勒克斯、500勒克斯、400勒克斯、300勒克斯、200勒克斯或100勒克斯的强度的光透过。在一些实施方式中，所述偶联物储存在半透明或不透明容器内。在一些实施方式中，所述容器是绿色或琥珀色的。在一些实施方式中，所述容器用箔之类的不透明材料、如铝箔覆盖。
[0376]
在一些实施方式中，所述偶联物在将偶联物储存在低于或等于或约26℃、如低于或等于或约20℃、15℃、8℃、0℃、-20℃或-80℃的温度下后具有稳定性。在一些实施方式中，所述温度为约20～26℃、如23
±
3℃，或为约2℃～8℃、如5
±
3℃，例如为约4℃或约5℃，或为低于0℃、如约-20或-80℃。
[0377]
在一些实施方式中，所述偶联物的ph、例如在其中配制所述偶联物的药学上可接受的缓冲液的ph赋予偶联物稳定性。在一些实施方式中，所述高于6.0，例如高于或约7.0、高于或约8.0或者高于或约9.0。在一些实施方式中，所述ph是6.0～9.0，例如6.0～8.0、6.5～7.4，例如约7.1
±
3.0。
[0378]
在一些实施方式中，所述稳定的酞菁染料－靶向性分子偶联物(如ir700－靶向性分子偶联物，例如ir700－抗体偶联物)通过本发明所提供的方法、例如小章节c中描述的避光方法来制造。
[0379]
在一些实施方式中，例如在低于26℃如2～8℃的温度下在如上所述的避光条件下制造和储存时，以及在高于6.0、例如6.0～8.0的ph下配制时，所提供的稳定偶联物在多于3个月的时间内稳定。
[0380]
ii.治疗方法
[0381]
在一些实施方式中，提供酞菁染料－靶向性分子偶联物(如ir700－靶向性分子偶联物，例如ir700－抗体偶联物)的使用方法和应用，该偶联物例如通过与细胞上表达的细胞表面分子、细胞表面蛋白或细胞表面受体结合来靶向与疾病或病症有关的细胞或病原体。这种方法和应用包括治疗方法和应用，例如涉及将分子给予患有疾病、病症或失调的对象，随后进行辐照以进行光免疫疗法，从而导致这种细胞或病原体的光解，以实现疾病或失调的治疗。应用包括所述偶联物在这种方法和治疗中的应用，以及在用于实施这种治疗方
法的药品的制备中的应用。在一些实施方式中，提供这种分子的使用方法和应用，该分子用于通过利用酞菁染料－靶向性分子偶联物(如ir700－靶向性分子偶联物，例如ir700－抗体偶联物)治疗对象中的肿瘤来治疗对象中的肿瘤。在一些实施方式中，所述酞菁染料－靶向性分子偶联物是例如如上所述的任意稳定偶联物。在一些实施方式中，所述酞菁染料－靶向性分子偶联物采用如上所述的方法制造。在一些实施方式中，所述方法因而能治疗对象中的疾病或病症或失调。
[0382]
也提供含有本文所述的任意偶联物或采用本发明所提供的方法制备的偶联物的组合物的制备方法，该组合物用于给予对象例如任意的酞菁染料偶联物(如抗体-ir700偶联物)。在一些实施方式中，所述偶联物的制备在避光条件下进行。在一些实施方式中，所述制备方法包括：将本文所述的任意一个或多个容器或者包括本文所述的任意容器的本文所述的任意一个或多个包装系统打开；以及将所述一个或多个容器内存在的组合物转移至能进行所述组合物向对象的给药的装置中，其中，所述组合物所暴露的光仅具有约400nm～约650nm范围内的波长，或者所述组合物所暴露的光仅具有小于500勒克斯、例如小于200勒克斯或小于100勒克斯的强度。
[0383]
在一些实施方式中，所提供的方法在生物安全柜、生物安全罩或无菌环境中实施。在一些实施方式中，所述一个或多个容器均包含治疗有效量的酞菁染料偶联物。在一些实施方式中，所述一个或多个容器包括至少约2、4、6、8、10、12、18或24个容器。
[0384]
在一些实施方式中，所提供的酞菁染料偶联物(如抗体-ir700偶联物)的制备方法进行不超过1小时、不超过30分钟或不超过15分钟；或者在所述方法中，所述组合物在任何光下的总暴露量不超过500勒克斯小时、不超过250勒克斯小时、不超过100勒克斯小时、不超过50勒克斯小时或不超过25勒克斯小时。
[0385]
也提供一种避光装置，其包括通过本发明所提供的方法制备的组合物。在一些实施方式中，所述避光装置用于进行本文所述的组合物或偶联物的给药。
[0386]
在一些实施方式中，所述给药装置是静脉内输液包或注射器。在一些实施方式中，所述给药装置包括能够覆盖该装置的避光盖。在一些实施方式中，所述避光盖确保具有约250nm～约800nm、约250nm～约450nm、约400nm～约800nm、约450nm～约650nm或约600nm～约720nm的波长的光不透过。在一些实施方式中，所述避光盖确保光不透过，使得透光率百分数小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％或小于5％。在一些实施方式中，所述避光盖是绿色、蓝色、琥珀色、半透明、不透明、或用具有小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％或小于5％的透光率的材料覆盖。
[0387]
在一些实施方式中，所述方法包括在杀伤的靶细胞通常与偶联物接触的条件下，将酞菁染料－靶向性分子偶联物给予对象。在一些实施方式中，所述方法导致所述偶联物的靶向性分子(如抗体)部分和与肿瘤或癌症有关的细胞表面蛋白结合。在所述偶联物的接触或给药后，用被染料吸收的光、通常是nir光对含有肿瘤之类的靶细胞的对象的局部进行暴露或辐照，从而激活所述偶联物以实现特异性细胞杀伤。例如，在一些实施方式中，所述方法还包括对象中的疾病区域的局部辐照，例如肿瘤的局部辐照。在一些实施方式中，以600～850nm的波长、以至少1j cm-2
的剂量进行辐照。在一些实施方式中，所述偶联物靶向疾病细胞、例如肿瘤，并且所述辐照例如通过光免疫疗法(pit)导致细胞杀伤。在一些实施方式中，所述方法包括美国专利第8,524,239号或美国专利公开号us2014/0120119中描述的
方法。
[0388]
在一些实施方式中，所述偶联物的给药在避光条件下进行。在一些实施方式中，所述给药在荧光灯或led灯下实施。在一些实施方式中，所述给药在不存在直接或间接的日光的条件下实施。
[0389]
在一些实施方式中，在给药之前或之时，所述偶联物不暴露在环境光下，或者不暴露在具有超过700勒克斯、超过600勒克斯、超过500勒克斯、超过400勒克斯、超过300勒克斯、超过200勒克斯或超过100勒克斯或超过50勒克斯的强度的环境光下。
[0390]
在一些实施方式中，所述偶联物在具有超过700勒克斯、超过600勒克斯、超过500勒克斯、超过400勒克斯、超过300勒克斯、超过200勒克斯或超过100勒克斯或超过50勒克斯的强度的光下不暴露多于20分钟、10分钟或多于5分钟。在一些实施方式中，所述染料和/或偶联物在具有超过200勒克斯的强度的光下不暴露多于10分钟或多于5分钟。在一些实施方式中，在给药之前或之时，所述偶联物在光下的任何暴露的时间少于20分钟、少于15分钟、少于10分钟、少于5分钟、少于4分钟、少于3分钟、少于2分钟或少于1分钟。在一些实施方式中，在给药之前或之时，所述染料和/或偶联物在任何光下的总暴露量不超过5000勒克斯小时、不超过2500勒克斯小时、不超过1000勒克斯小时、不超过500勒克斯小时、不超过250勒克斯小时、不超过100勒克斯小时或不超过80勒克斯小时、不超过50勒克斯小时或不超过25勒克斯小时。
[0391]
在一些实施方式中，保护所述偶联物不受环境光、例如近红外(ir)范围内的光的影响。在一些实施方式中，所述偶联物所暴露的光仅具有不被偶联物吸收或者基本上不被偶联物吸收的波长。
[0392]
在一些实施方式中，在给予对象之前，使用保护内容物不受光的影响或者不受某些波长或强度的光的影响的容器来保护所述偶联物不受光的影响。所述容器可以是管子、注射器、输液包或与所述偶联物向对象的转移注射相容的其它容器。例如，在一些实施方式中，所述容器具有不大于50％、不大于40％、不大于30％、不大于20％、不大于10％、不大于5％或不大于1％的透光率。在一些实施方式中，所述容器确保具有约500nm～725nm、如约650nm～725nm的波长的光不透过，或者不让超过700勒克斯、600勒克斯、500勒克斯、400勒克斯、300勒克斯、200勒克斯或100勒克斯的强度的光透过。在一些实施方式中，所述偶联物从或在半透明或不透明容器内给药。在一些实施方式中，所述容器是绿色或琥珀色的。在一些实施方式中，所述容器用箔之类的不透明材料、如铝箔覆盖。在一些实施方式中，所述容器是静脉内(iv)注射包，并且所述包用不透明的套筒、例如箔、如铝箔覆盖。
[0393]
所述靶细胞可以是不需要的细胞或不需要其生长的细胞，例如肿瘤细胞。在一些实施方式中，所述细胞可以在培养基中生长，或存在于待治疗的哺乳动物、例如患癌对象中。任何靶细胞都可以用本发明要求保护的方法来治疗。在一些实施方式中，所述靶细胞表达在其它正常细胞表面上基本上见不到的细胞表面蛋白。在一些实施方式中，可以选择与这种蛋白质特异性结合的抗体，并且可以针对该蛋白质产生酞菁染料－抗体偶联物。在一些实施方式中，所述细胞表面蛋白是肿瘤特异性蛋白。在一些实施方式中，所述细胞表面蛋白是cd25，其可用于靶向与不需要的移植排斥有关的细胞。
[0394]
也提供从对象中除去不希望的细胞或病原体、例如疾病细胞或被病原体感染的细胞的方法，其中使用本文所述的任意偶联物或组合物、或用本文所述的任意方法制造的任
意偶联物或组合物。例如，在一些实施方式中，不希望的细胞可以包括干细胞、增殖性细胞、增生中的细胞、炎性细胞、负调节免疫细胞(任选地为t细胞)、被病原体感染的细胞、神经元、脂肪细胞或脂细胞。在一些实施方式中，所述不希望的细胞是癌细胞或肿瘤细胞。在一些实施方式中，所述不希望的细胞是癌症干细胞或循环肿瘤细胞。在一些实施方式中，所述不希望的病原体可以是病毒、细菌细胞或真菌细胞。
[0395]
在一些实施方式中，提供从样品中除去不希望的细胞或病原体、例如疾病细胞或被病原体感染的细胞的方法，其中使用本文所述的任意偶联物或组合物、或用本文所述的任意方法制造的任意偶联物或组合物。例如，从来自对象的生物样品、例如血液样品或骨髓样品或活组织中除去不希望的细胞或病原体。在一些实施方式中，所述样品是血液样品或组织样品。在一些实施方式中，从组织、例如在手术或治疗过程中从对象暂时除去的组织中除去不希望的细胞或病原体。在一些实施方式中，从与医疗器件上的生物膜之类的装置有关的样品中除去不希望的细胞。
[0396]
在一些实施方式中，所述除去或治疗用的辐照在例如接受了直接给药的对象的体内起效。在一些实施方式中，所述方法在体外或离体条件下、例如对象的机体外部实施。在一些实施方式中，所述方法用体外装置实施。示例性的体外装置包括血液透析、体外氧合、co2除去和单采血液成分用的装置，或接受从对象除去的血液、对该血液进行加工(例如过滤、纯化、处理、给予治疗剂等)、随后将该血液返回至对象的装置。
[0397]
在本发明所提供的方法的一些实施方式中，从血液样品或组织样品之类的样品中除去不希望的细胞或病原体包括用于治疗、例如治疗增生、肿瘤或感染的方法。
[0398]
在一些实施方式中，所述不希望的细胞与疾病或病症的病因有关，或者导致或有助于疾病或病症的病因。在一些实施方式中，所述疾病或病症是肿瘤或癌症、感染、炎性疾病或病症、或者神经元性疾病或病症。在一些实施方式中，所述细胞是神经元，且所述疾病或病症是神经疾病，其任选地是疼痛；所述细胞是脂肪细胞或脂细胞，且所述疾病或病症涉及多余的脂肪；所述细胞是被病原体感染的细胞，且所述疾病或病症是感染；所述细胞是病原体，且所述疾病或病症是感染；所述细胞是炎性细胞，且所述疾病或病症是炎性疾病；所述细胞是免疫细胞，其任选地是调节性t细胞，且所述疾病或病症是肿瘤或癌症；或者所述细胞是肿瘤或癌细胞，且所述疾病或病症是肿瘤或癌症。在一些实施方式中，所述细胞存在于与疾病或病症有关的病变的微环境中，或者在增生中。在一些实施方式中，所述病变是肿瘤，且所述疾病或病症是肿瘤或癌症。在一些实施方式中，所述方法治疗所述疾病或病症。
[0399]
所述方法通常包括给予对象本发明所提供的偶联物或组合物或用本文所述的方法制造的偶联物或组合物，以及对不希望的细胞或病原体进行辐照以激活所述偶联物，从而除去细胞。
[0400]
在一些实施方式中，所述除去对象中的不希望的细胞或病原体的方法包括：(a)将包含来自本发明所提供的任意避光装置的酞菁染料偶联物的组合物给予对象，其中，在给药步骤之前及给药步骤中，所述组合物不暴露在大于500勒克斯的强度的环境光下；以及(b)以660～740nm的波长、以至少1j cm-2
或1j/cm纤维长的剂量对所述不希望的细胞或病原体进行辐照，从而除去对象中的所述不希望的细胞。
[0401]
在一些实施方式中，所述除去对象中的不希望的细胞或病原体的方法包括：a)给予对象治疗有效量的本文所述的任意偶联物或组合物，其中，在给药步骤之前及给药步骤
中，所述偶联物不暴露在大于500勒克斯的强度的环境光下；以及b)以660～740nm的波长、以至少1j cm-2
或1j/cm纤维长的剂量对所述不希望的细胞或病原体进行辐照，从而除去对象中的所述不希望的细胞。
[0402]
在一些实施方式中，所述除去对象中的不希望的细胞或病原体的方法包括：a)给予对象治疗有效量的偶联物，该偶联物包含与能够与不希望的细胞或病原体结合的靶向性分子连接的irdye 700dx(ir700)，其中，在给药步骤之前及给药步骤中，所述偶联物不暴露在大于500勒克斯的强度的环境光下；以及b)以600～800nm的波长、以至少1j cm-2
或1j/cm纤维长的剂量对所述不希望的细胞或病原体进行辐照，从而除去对象中的所述不希望的细胞或病原体。
[0403]
在一些实施方式中，所述除去对象中的不希望的细胞或病原体的方法包括：a)给予对象治疗有效量的第一结合性分子，该第一结合性分子能够与不希望的细胞或病原体结合；b)给予对象偶联物分子，该偶联物分子包含与靶向性分子连接的irdye 700dx(ir700)，其中，所述靶向性分子是能够与所述第一结合性分子结合的第二结合性分子；以及c)以600～800nm的波长、以至少1j cm-2
或1j/cm纤维长的剂量对所述不希望的细胞或病原体进行辐照，从而除去对象中的所述不希望的细胞或病原体。在本发明所提供的方法的一些实施方式中，所述第一结合性分子在所述偶联物之前给予对象，或者所述第一结合性分子和偶联物同时给予对象。在一些实施方式中，所述靶向性分子是第二抗体。在一些实施方式中，在所述偶联物的给药之前和之时，所述偶联物不暴露在大于500勒克斯的强度的环境光下。
[0404]
在一些实施方式中，所述除去对象中的不希望的细胞或病原体、例如被病原体感染的细胞的方法包括：a)给予对象治疗有效量的包含与靶向性分子连接的irdye 700dx(ir700)的偶联物分子，其中，所述靶向性分子能够直接或间接地与被病原体感染的细胞结合；以及b)以600～800nm的波长、以至少1j cm-2
或1j/cm纤维长的剂量对所述被病原体感染的细胞进行辐照，从而除去对象中的所述被病原体感染的细胞。在一些实施方式中，所述病原体是病毒、细菌、真菌、生物膜或其它原核细胞系统。在一些实施方式中，在所述偶联物的给药之前和之时，所述偶联物不暴露在大于500勒克斯的强度的环境光下。
[0405]
在一些实施方式中，待治疗的对象或待除去不希望的细胞或病原体的对象具有肿瘤，并且所述酞菁染料－靶向性分子偶联物靶向该肿瘤。在一些实施方式中，所述肿瘤是癌症。在一些实施方式中，所述癌症是头颈、乳腺、肝脏、结肠、卵巢、前列腺、胰腺、脑、宫颈、骨、皮肤、肺或血液的癌症。在一些实施方式中，癌症可以包括以异常或不受控的细胞生长为特征的恶性肿瘤。可能与癌症有关的其它特征包括转移、对相邻细胞的正常功能的干扰、细胞因子或其它分泌产物的异常水平的释放以及炎症或免疫应答的抑制或恶化、对周围或远端组织或器官如淋巴结的侵袭等。转移性疾病可以指癌细胞离开原来的肿瘤位点，并通过例如血流或淋巴系统迁移至机体的其它部分。在一些实施方式中，本文所揭示的方法的靶细胞是癌细胞。在一些实施方式中，所述靶细胞是癌症干细胞或循环肿瘤细胞。
[0406]
在一些实施方式中，所述肿瘤细胞是癌细胞，例如患癌对象中的细胞。可在本文所揭示的方法中作为靶点的示例性的细胞包括下述肿瘤的细胞：液体肿瘤，例如白血病、包括急性白血病(例如急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病和成髓细胞、前髓细胞、髓单核细胞、单核细胞和红细胞白血病)、慢性白血病(例如慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病和慢性淋巴细胞性白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多发
性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、重链病)。在一些实施方式中，所述细胞是实体肿瘤细胞，例如肉瘤或癌、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨源性肉瘤及其它肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、肺癌、结直肠癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌(例如胰腺、结肠、卵巢、肺、乳腺、胃、前列腺、宫颈或食道的腺癌)、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、维尔姆斯瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、膀胱癌、cns肿瘤例如胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。在一些实施方式中，所述癌症是头颈的鳞状细胞癌。
[0407]
可以用本发明要求保护的方法来治疗示例性的肿瘤如癌症包括实体肿瘤，例如乳腺癌如小叶癌和导管癌、肉瘤、肺癌如非小细胞癌、大细胞癌、鳞状细胞癌和腺癌、肺间皮瘤、结直肠腺癌、胃癌、前列腺癌、卵巢癌如浆液性囊腺癌和粘液性囊腺癌、卵巢生殖细胞瘤、睾丸癌和生殖细胞瘤、胰腺癌、胆管腺癌、肝细胞癌、膀胱癌例如包括移行细胞癌、腺癌和鳞状细胞癌、肾细胞腺癌、子宫内膜癌例如包括腺癌和混合副中肾管肿瘤(癌肉瘤)、宫颈内膜、外宫颈和阴道癌如它们的腺癌和鳞状细胞癌、皮肤肿瘤如鳞状细胞癌、基底细胞癌、恶性黑色素瘤、皮肤附属器肿瘤、卡波西肉瘤、皮肤淋巴细胞瘤、皮肤附件肿瘤和多种肉瘤及梅克尔(merkel)细胞癌、食道癌、鼻咽和口咽癌包括它们的鳞状细胞癌和腺癌、唾液腺癌、脑和中枢神经系统肿瘤例如包括胶质、神经元和脑膜起源肿瘤、周围神经肿瘤、软组织肉瘤以及骨和软骨肉瘤、淋巴系统肿瘤报b细胞和t细胞恶性淋巴瘤。在一些实施方式中，所述肿瘤是腺癌。
[0408]
所述方法也可以用于治疗液体肿瘤，例如淋巴性、白细胞或其它类型的白血病。在一些实施方式中，待治疗的肿瘤是血液肿瘤，例如白血病如急性淋巴细胞性白血病(all)、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、急性髓细胞性白血病(aml)、慢性髓细胞性白血病(cml)、毛细胞性白血病(hcl)、t细胞幼淋巴细胞性白血病(t-pll)、大颗粒淋巴细胞性白血病和成人t细胞白血病、淋巴瘤例如霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤、以及骨髓瘤。
[0409]
在一些实施方式中，所述偶联物靶向肿瘤中表达的蛋白质。
[0410]
在一些实施方式中，所靶向的靶细胞的细胞表面上的蛋白质在其它细胞上不大量存在。例如，细胞表面蛋白可以是只在靶细胞类型中可见的受体。
[0411]
在一些实施方式中，肿瘤中表达的蛋白质、例如肿瘤特异性蛋白可以是her1/egfr、her2/erbb2、cd20、cd25(il-2rα受体)、cd33、cd52、cd133、cd206、cea、癌抗原125(ca125)、甲胎蛋白(afp)、lewis y、tag72、血管内皮生长因子(vegf)、cd30、epcam、epha2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、gpa33、粘蛋白、caix、psma、叶酸盐结合蛋白、神经节苷脂(如gd2、gd3、gm1和gm2)、vegf受体(vegfr)、整联蛋白αvβ3、整联蛋白α5β1、erbb3、met、igf1r、epha3、trailr1、trailr2、rankl、fap、生腱蛋白、afp、bcr复合物、cd3、cd18、cd44、ctla-4、gp72、hla-dr 10β、hla-dr抗原、ige、muc-1、nuc242、pem抗原、sk-1抗原或pd-l1。在一些实施方式中，肿瘤特异性蛋白是pd-l1、her1/egfr、her2、cd20、cd25、cd33、cd52或前列腺特异性膜抗原(psma)。其它细胞表面蛋白包括如上所述的任意蛋白质。
[0412]
在一些实施方式中，细胞表面蛋白是肿瘤特异性蛋白或肿瘤特异性抗原，例如egf受体家族成员(如her1、2、3和4)和细胞因子受体(如cd20、cd25、il-13r、cd5、cd52等)。在一
些实施方式中，肿瘤特异性蛋白是与正常细胞之类的其它细胞相比在癌细胞中独有或更加丰富的蛋白质。例如，her2在乳腺癌中常见，而her1在腺癌中常见，在许多器官如胰脏、乳房、前列腺和结肠中可见。
[0413]
在靶细胞中可见且对该蛋白质具有特异性的抗体或抗体片段可用于配制酞菁染料－抗体偶联物的示例性的肿瘤特异性蛋白，包括但不限于：任意mage(黑色素瘤相关抗原e)，包括mage 1、mage 2、mage 3和mage4，任意酪氨酸酶，突变型ras，突变型p53，p97黑色素瘤抗原，可能与乳房肿瘤有关的人乳脂肪球(hmfg)，任意bage(人b黑色素瘤相关抗原e)，包括bage1和bage2，任意gage(g抗原)，包括gage1、gage2-6，各种神经节苷脂，以及cd25。
[0414]
其它肿瘤特异性抗原包括与宫颈癌有关的hpv 16/18和e6/e7抗原、可能与乳腺癌有关的粘蛋白(muc 1)-klh抗原、可能与结直肠癌有关的cea(癌胚抗原)、可能与例如黑色素瘤有关的gp100、可能与黑色素瘤有关的marti抗原、可能与卵巢癌或其它癌症有关的癌抗原125(ca125，也称为粘蛋白16或muc16)、可能与肝癌有关的甲胎蛋白(afp)、可能与结直肠癌、胆管癌、乳腺癌、小细胞肺癌和其它癌症有关的lewis y抗原、可能与腺癌有关的肿瘤相关糖蛋白72(tag72)、以及可能与前列腺癌有关的psa抗原。
[0415]
其它示例性的肿瘤特异性蛋白还包括但不限于：可能与实体肿瘤新血管系统和前列腺癌有关的pmsa(前列腺特异性膜抗原)、可能与乳腺癌、卵巢癌、胃癌和子宫癌有关的her-2(人表皮生长因子受体2)、可能与肺癌、肛门癌、成胶质细胞瘤和腺癌有关的her-1、可能与黑色素瘤、肉瘤、睾丸癌和其它癌症有关的ny-eso-1、htert(aka端粒酶)、蛋白水解酶3和维尔姆斯瘤1(wt-1)。
[0416]
在一些实施方式中，所述肿瘤特异性蛋白是可能与慢性淋巴细胞性白血病有关的cd52、可能与急性髓细胞性白血病有关的cd33、或可能与非霍奇金淋巴瘤有关的cd20。
[0417]
因此，本文所揭示的方法可以用于治疗任何表达肿瘤特异性蛋白的癌症。
[0418]
在一些实施方式中，所述对象是人或非人哺乳动物。在一些实施方式中，所述对象是人或兽类对象，例如小鼠。在一些实施方式中，所述对象是哺乳动物，例如患癌或欲治疗癌症的人。在一些实施方式中，本文所揭示的方法用于治疗具有肿瘤、如本文所述的肿瘤的对象。在一些实施方式中，所述肿瘤先前已经过治疗、例如手术去除或化学去除，并且本文所揭示的方法随后用于杀伤任何可能残留在对象中的不需要的残余肿瘤细胞。
[0419]
本文所揭示的方法可以用于治疗任何哺乳动物对象，例如患有癌症之类的肿瘤或先前已做过去除或治疗的人。需要进行本文所揭示的疗法的对象可以包括患癌的人对象，其中，癌细胞在其表面表达能够与酞菁染料－靶向性分子偶联物特异性结合的肿瘤特异性蛋白。例如，本文所揭示的方法可以单独或者与放射或其它化疗组合用作癌症的初始治疗。本文所揭示的方法也可以用于先前的放射或化疗失败了的患者。因此，在一些实施方式中，所述对象是接受了其它疗法、但该其它疗法并未提供所需的治疗反应的对象。本文所提供的方法也可以用于患有局部和/或转移性癌症的患者。
[0420]
在一些实施方式中，所述方法包括选择将得益于本文所揭示的疗法的对象，例如选择患有表达细胞表面蛋白的肿瘤的对象，该细胞表面蛋白例如是能够与酞菁染料－靶向性分子偶联物特异性结合的肿瘤特异性蛋白。例如，如果判断对象患有表达her1的乳腺癌，则可以选择该对象用抗her1-ir700分子如西妥昔单抗-ir700进行治疗。
[0421]
在一些实施方式中，用于所述偶联物的给药的组合物在含有有效量的偶联物的同
时，也含有常规的药物载体和适合于所考虑的给药类型的赋形剂。
[0422]
在一些实施方式中，单次剂量的所述偶联物包含在一个容器、例如储存有所述偶联物的容器内。在一些实施方式中，所述容器、如药瓶是如上所述在避光条件下包装的容器。在一些实施方式中，单次剂量的所述偶联物包含在多个容器内。因此，在一些实施方式中，多个容器、如药瓶组合在用于所述偶联物的给药的容器、如静脉内(iv)注射包内。在一些实施方式中，用于给药的所述容器、如iv注射包通过如下方式制备：将包含所述偶联物的一个或多个容器打开，并将内容物置于包内，例如直至达到输液之类的给药所需的偶联物剂量为止。在给药容器如iv包的制备过程中，采用光防护措施、例如本文所述的各种光防护措施来避免所述偶联物暴露在光下。
[0423]
在一些实施方式中，所述方法包括给予对象治疗有效量的所述偶联物药物产品。在一些实施方式中，所述方法包括给予对象治疗有效量的含有与靶向性分子偶联的染料的偶联物，例如irdye 700dx－靶向性分子偶联物。在一些实施方式中，所述irdye 700dx－靶向性分子偶联物靶向肿瘤。
[0424]
在一些实施方式中，治疗有效量是组合物单独或与其它治疗剂如化疗剂一起、足以在用该组合物治疗的对象或细胞中达到所需效果的量。治疗剂如酞菁染料－靶向性分子偶联物的治疗有效量可以取决于多种因素，包括但不限于：所治疗的对象或细胞、特定的治疗剂、以及治疗组合物的给药方式。在一些实施方式中，治疗有效量或浓度是足以防止转移之类的进展、延缓进程、或导致疾病的消退、或者能够减轻由疾病引起的症状的量或浓度，所述疾病例如是癌症。在一些实施方式中，治疗有效量或浓度是足以增加患有肿瘤的患者的存活时间的量或浓度。
[0425]
在一些实施方式中，本发明所提供的方法的所需的治疗反应是减轻或抑制与癌症有关的一种或多种症状。在一些实施方式中，所述一种或多种症状并不一定要完全消失才认为所述组合物是有效的。例如，通过给予含有酞菁染料－靶向性分子偶联物的组合物、随后进行辐照，与不存在该偶联物的情况下的肿瘤的尺寸、体积、重量或转移相比，可使肿瘤的尺寸、例如肿瘤的体积或重量或者肿瘤的转移减少例如至少20％、至少50％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少100％。
[0426]
在一些实施方式中，本发明所提供的方法的所需的治疗反应是以所需量杀伤细胞群，例如与不存在所述偶联物和辐照的情况下的细胞杀伤性相比，可杀伤至少20％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少100％的细胞。
[0427]
在一些实施方式中，所需的反应是以所需量增加患有肿瘤的患者或肿瘤最近刚被去除的患者的存活时间，例如与不存在所述偶联物和辐照的情况下的存活时间相比，可增加至少20％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少100％的存活时间。
[0428]
给予人或兽类对象的包含酞菁染料－靶向性分子偶联物的药剂的量取决于与该对象有关的多个因素，例如该对象的总体健康状况。在一些实施方式中，药剂的有效量可通过改变产品的剂量并测定所得的治疗反应、如肿瘤的消退来确定。在一些实施方式中，有效量可通过各种体外、体内或离体免疫试验来确定。在一些实施方式中，本文所揭示的药剂可根据需要以单次剂量或多次剂量给药以获得所需的反应。在一些实施方式中，有效量取决于实施源头、欲治疗的对象、欲治疗的症状的严重性和类型、以及给药方式。
[0429]
在一些实施方式中，所述偶联物的治疗有效剂量为至少0.5毫克每60千克(mg/kg)、至少5mg/60kg、至少10mg/60kg、至少20mg/60kg、至少30mg/60kg、至少50mg/60kg，例如在静脉内给药时为0.5～50mg/60kg，例如1mg/60kg、2mg/60kg、5mg/60kg、20mg/60kg或50mg/60kg的剂量。在一些实施方式中，例如在肿瘤内或ip给药时，所述偶联物的剂量为至少10μg/kg、如至少100μg/kg、至少500μg/kg或至少500μg/kg，例如为10μg/kg～1000μg/kg、如100μg/kg、250μg/kg、约500μg/kg、750μg/kg或1000μg/kg的剂量。在一些实施方式中，例如在外用溶液中给药时，所述剂量为至少1μg/ml、如至少500μg/ml、如20μg/ml～100μg/ml、如10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、70μg/ml、80μg/ml、90μg/ml或100μg/ml。
[0430]
在一些实施方式中，所述偶联物的治疗有效剂量为约10mg/m2～2000mg/m2，例如约10mg/m2～1500mg/m2、25mg/m2～2000mg/m2、200mg/m2～1250mg/m2、500mg/m2～1250mg/m2、500mg/m2～750mg/m2或750mg/m2～1250mg/m2。在一些实施方式中，所述治疗有效量为至少约0.01毫克(mg)、0.1mg、0.5mg、1mg、5mg、10mg、50mg、100mg、200mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg、1000mg、2000mg、3000mg或更多。
[0431]
本领域技术人员能够认识到，也可以采用更高或更低的剂量，例如取决于特定的偶联物。在一些实施方式中，每日剂量之类的剂量以一次或分多次的剂量给药，例如2、3或4次剂量或者单次制剂。本文所揭示的偶联物可以单独给药、在药学上可接受的载体的存在下给药、或者在其它治疗剂如其它抗肿瘤剂的存在下给药。
[0432]
在一些实施方式中，所述靶向性分子是抗体、抗原结合片段、蛋白质、糖蛋白、肽、多肽、病毒、病毒衣壳或病毒颗粒。在一些实施方式中，所述靶向性分子是抗体或抗原结合片段。
[0433]
在一些实施方式中，在所述偶联物的给药之前，单独给予对象非偶联形式的靶向性分子、如西妥昔单抗之类的抗体。通常，在所述偶联物之前给予的靶向性分子与将要作为所述偶联物的一部分给药的靶向性分子相同。在一些实施方式中，靶向性分子的给药剂量为约10mg/m2～2000mg/m2，例如约10mg/m2～1500mg/m2、25mg/m2～2000mg/m2、200mg/m2～1250mg/m2、500mg/m2～1250mg/m2、500mg/m2～750mg/m2或25mg/m2～100mg/m2。
[0434]
在一些实施方式中，在所述偶联物给药前至少1周、至少6天、至少5天、至少96小时、至少72小时、至少48小时、至少24小时或至少12小时给予所述靶向性分子。在一些实施方式中，在所述偶联物给药前约1小时～1周的范围内、如约1小时～96小时、1小时～48小时、1小时～24小时、24小时～96小时或24小时～48小时的范围内给予所述靶向性分子。在一些实施方式中，所述靶向性分子在所述偶联物给药前约96小时给药。
[0435]
在一些实施方式中，所述偶联物可以全身给药或者局部给药至欲治疗的器官或组织。示例性的给药途径包括但不限于：局部、注射(如皮下、肌肉内、皮内、腹膜内、肿瘤内和静脉内)、口服、舌下、直肠、透皮、鼻内、阴道和吸入途径。在一些实施方式中，静脉内给予所述偶联物。在一些实施方式中，胃肠外给予所述偶联物。在一些实施方式中，肠内给予所述偶联物。在一些实施方式中，通过局部注射给予所述偶联物。在一些实施方式中，通过局部施用给予所述偶联物。
[0436]
包含所述偶联物的组合物可以用本领域已知的任意方法局部或全身给药，例如给予患有癌症之类的肿瘤的对象或先前已通过例如手术去除过肿瘤的对象。虽然提供了特定
的实施例，但本领域技术人员能够理解，本文所揭示的偶联物的其它给药方法也是可以采用的。这种方法可以包括例如使用导管或可植入泵在数小时至数天的时间内为需要治疗的对象提供连续输注。
[0437]
在一些实施方式中，所述偶联物通过胃肠外方式给药，包括直接注射、直接注射或输注至肿瘤内，如肿瘤内给药。在一些实施方式中，所述偶联物通过将偶联物施用于肿瘤来给药至肿瘤，例如通过将肿瘤浸在含有酞菁染料－靶向性分子偶联物的溶液中、或通过将偶联物倾倒在肿瘤上来给药至肿瘤。
[0438]
附加的或可选的，本文所揭示的组合物可以全身给药，例如静脉内、肌肉内、皮下、皮内、腹膜内、皮下或口服给药至具有癌症之类的肿瘤的对象。
[0439]
对于给药至对象的所述偶联物的剂量没有绝对限制，但取决于组合物的性质、其活性成分、其不希望的副作用如针对抗体的免疫应答、欲治疗的对象、欲治疗的症状类型、以及给药方式。通常，剂量是治疗有效量，例如足以达到所需生物学效果的量，如能有效地减少肿瘤的尺寸如体积和/或重量、或减缓肿瘤的进一步生长、或减轻肿瘤的不需要的症状的量。
[0440]
在一些实施方式中，例如就所述偶联物的静脉内给药而言，在单次治疗中给予对象的示例性的剂量可以在0.5～100mg/60kg体重、1～100mg/60kg体重、1～50mg/60kg体重、1～20mg/60kg体重、例如约1～2mg/60kg体重的范围内。在一些实施方式中，腹膜内或肿瘤内给药的偶联物的治疗有效量可以为10μg～5000μg偶联物每1kg体重，例如10μg/kg～1000μg/kg、10μg/kg～500μg/kg或100μg/kg～1000μg/kg。在一些实施方式中，所述偶联物以约0.5mg/kg～约100mg/kg或20mg/m2～约4000mg/m2的量给药。在一些实施方式中，所述偶联物以至少约或约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg、8.0mg/kg、16.0mg/kg、32.0mg/kg或64mg/kg的量给药；或者所述偶联物以至少约或约20mg/m2、40mg/m2、160mg/m2、320mg/m2、640mg/m2、1280mg/m2或2560mg/m2的量给药。
[0441]
在一些实施方式中，给药至人类患者的偶联物的剂量为至少50mg，例如至少100mg、至少300mg、至少500mg、至少750mg或甚至1g。
[0442]
使用本文所揭示的偶联物的治疗可以在一天内完成，或者可以在多天内以相同或不同剂量重复进行。重复治疗可以在同一天进行、在连续的天内进行、或者每1～3天、每3～7天、每1～2周、每2～4周、每1～2个月或以更长的间隔进行。
[0443]
在一些实施方式中，用于所述偶联物的给药的组合物在含有有效量的偶联物的同时，也含有常规的药物载体和适合于所考虑的给药类型的赋形剂。例如，在一些实施方式中，胃肠外制剂可以含有所述偶联物的无菌水溶液或混悬液。在一些实施方式中，肠内给药用组合物可以在水溶液或混悬液中含有有效量的所述偶联物，其可以任选地包括缓冲液、表面活性剂、触变剂和芳香剂。
[0444]
在一些实施方式中，所述方法包括对肿瘤进行辐照。在一些实施方式中，所述辐照在所述偶联物给药后约30分钟～96小时进行，例如在所述偶联物给药后30分钟～48小时、30分钟～24小时或12小时～48小时、例如通常为至少30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时或更长时间后进行。例如，所述辐照可以在所述偶联物给药后约24小时内实施。
[0445]
在一些实施方式中，在细胞与酞菁染料－靶向性分子偶联物接触后，对这些细胞进行辐照。辐照方法是本领域已知的。因为一般只有表达所述细胞表面蛋白的细胞会被所述靶向性分子识别，所以通常只有这些细胞上会结合足量的所述偶联物。因为辐照只会杀伤结合有所述偶联物的细胞而通常不会杀伤其它细胞，所以这可以减小不需要的副作用、如杀伤正常细胞的可能性。
[0446]
在一些实施方式中，在体外、例如在组织培养皿中对细胞进行辐照。在一些实施方式中，在体内对细胞进行辐照，例如对先前已经给予了酞菁染料－靶向性分子偶联物的对象进行辐照。在一些实施方式中，对所述对象进行辐照，例如可以对对象中的肿瘤进行辐照。
[0447]
在一些实施方式中，可以对染料分子、例如含有所述偶联物的细胞施加约5秒～约5分钟的光或激光。例如，在一些实施方式中，施加约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50或55秒、或者上述任意两个数值之间的范围内的所述光或激光，以激活染料分子。在一些实施方式中，施加约1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5分钟或更多、或者上述任意两个数值之间的范围内的光或激光。在一些实施方式中，施加光或激光的时间长度例如可以取决于光或激光的能量、如瓦数。例如，具有更低的瓦数的光或激光可以施加更长的时间，以激活染料分子。
[0448]
在一些实施方式中，可以在所述偶联物给药后约30分钟～约48小时施加光或激光。例如，在一些实施方式中，在所述偶联物给药后约30、35、40、45、50或55分钟、或者在上述任意两个数值之间的范围内施加光或激光。在一些实施方式中，在所述偶联物给药后约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时、或者在上述任意两个数值之间的范围内施加光或激光。在一些实施方式中，在所述偶联物给药后约1～24小时、如约1～12小时、12～24小时、6～12小时、或者可以是给药后超过24小时施加光或激光。在一些实施方式中，在所述偶联物给药后36或48小时施加光或激光。在一些实施方式中，在所述偶联物给药后约12小时、24小时、36小时、72小时或96小时内对所述细胞、增生或肿瘤进行辐照。
[0449]
在一些实施方式中，所述偶联物的染料分子可以在合适的波长下被激活。因此，在一些实施方式中，以治疗剂量的辐照、以约660～710nm、例如660～700nm或670～690nm、如680nm的波长对所述细胞进行辐照。在一些实施方式中，染料分子的激活使得它们具有细胞毒性或能够产生细胞毒性分子。合适的波长包括但不限于：紫外波长、可见波长、红外波长和近红外波长。在一些实施方式中，染料分子在约600nm～800nm或660nm～740nm的波长下被激活并变得具有细胞毒性。在一些实施方式中，染料分子在约或至少约600nm、610nm、620nm、630nm、640nm、650nm、660nm、670nm、680nm、690nm、700nm、710nm、720nm、730nm、740nm、750nm、760nm、770nm、780nm、790nm或800nm、或者在上述任意两个波长之间的范围内的波长下被激活并变得具有细胞毒性。在一些实施方式中，染料分子在小于600nm或大于800nm的波长下被激活。
[0450]
在一些实施方式中，以约600nm～800nm或600nm～740nm、如640nm～760nm、660nm～740nm、680nm～720nm或690nm～710nm范围内的波长对所述肿瘤进行辐照。在一些实施方式中，以690
±
50nm的波长对所述肿瘤进行辐照。
[0451]
用于染料分子激活的合适的波长可以取决于所使用的特定染料分子。
[0452]
在一些实施方式中，以至少或约1j cm-2
(1j/cm2)、例如至少或约10j cm-2
、至少或
约30j cm-2
、至少或约50j cm-2
、至少或约100j cm-2
、或者至少或约500j cm-2
、例如至少约2j cm-2
、5j cm-2
、10j cm-2
、25j cm-2
、50j cm-2
、75j cm-2
、100j cm-2
、150j cm-2
、200j cm-2
、300j cm-2
、400j cm-2
或500j cm-2
的剂量对所述细胞、增生或肿瘤进行辐照。例如，在一些实施方式中，以约1～1000j cm-2
、1～500j cm-2
、10～100j cm-2
或10～50j cm-2
对所述细胞、增生或肿瘤进行辐照。在一些实施方式中，以至少0.5j cm-2
、至少1j cm-2
、至少2j cm-2
、至少3j cm-2
、至少4j cm-2
或至少5j cm-2
的剂量对所述肿瘤进行辐照。在一些实施方式中，以1j cm-2
的剂量对所述细胞、增生或肿瘤进行辐照。在一些实施方式中，以至少约2j/cm纤维长、5j/cm纤维长、10j/cm纤维长、25j/cm纤维长、50j/cm纤维长、75j/cm纤维长、100j/cm纤维长、150j/cm纤维长、200j/cm纤维长、250j/cm纤维长、300j/cm纤维长、400j/cm纤维长或500j/cm纤维长的剂量对所述细胞、增生或肿瘤进行辐照。在一些实施方式中，以至少1j cm-j
或1j/cm纤维长的剂量对所述细胞进行辐照。在一些实施方式中，以约2j cm-2
～约400j cm-2
或约2j/cm纤维长～约500j/cm纤维长的剂量对所述细胞、增生或肿瘤进行辐照。
[0453]
在一些实施方式中，所述肿瘤是浅表肿瘤。在一些实施方式中，以至少约10j/cm2、25j/cm2、50j/cm2、150j/cm2或250j/cm2的剂量对所述肿瘤进行辐照。
[0454]
在一些实施方式中，所述肿瘤是间质肿瘤。在一些实施方式中，以至少约50j/cm纤维长、100j/cm纤维长、200j/cm纤维长或300j/cm纤维长的剂量对所述肿瘤进行辐照。
[0455]
在一些实施方式中，包含酞菁染料－靶向性分子偶联物的组合物的给药后的辐照剂量在660～740nm的波长下为至少1j cm-2
，例如在660～740nm的波长下为至少10j cm-2
、在660～740nm的波长下为至少50j cm-2
、或在660～740nm的波长下为至少100j cm-2
、例如在660～740nm的波长下为1～500 1.0j cm-2
。在一些实施方式中，所述波长为660～710nm。在一些实施方式中，包含酞菁染料－靶向性分子偶联物的组合物的给药后的辐照剂量在680nm的波长下为至少1.0j cm-2
，例如在680nm的波长下为至少10j cm-2
、在680nm的波长下为至少50j cm-2
、或在680nm的波长下为至少100j cm-2
、例如在680nm的波长下为1～500 1.0j cm-2
。在一些实施方式中，实施多次辐照，例如至少2次、至少3次或至少4次辐照，例如2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次或10次单独实施。
[0456]
在一些实施方式中，可以对细胞或对象进行一次或多次辐照。因此，辐照可以在一天内完成，或者可以在多天内以相同或不同剂量重复进行，例如在至少2个不同时间、3个不同时间、4个不同时间、5个不同时间或10个不同时间进行辐照。在一些实施方式中，重复辐照可以在同一天进行、在连续的天内进行、或者每1～3天、每3～7天、每1～2周、每2～4周、每1～2个月或以更长的间隔进行。
[0457]
在一些实施方式中，在所述偶联物的给药之前、之时或之后，所述对象可以接受一种或多种其它疗法。在一些实施方式中，在所述偶联物的给药之前，所述对象接受一种或多种治疗，以去除或减小肿瘤。
[0458]
其它治疗
[0459]
在酞菁染料－靶向性分子偶联物的给药之前、之时或之后，所述对象可以接受一种或多种其它疗法。在一个实施例中，在所述偶联物的给药之前，所述对象接受一种或多种治疗，以去除或减小肿瘤。
[0460]
在一些实施方式中，所述其它药剂或给予的药剂或联合疗法中的其它药剂是未偶联的靶向性分子。在一些实施方式中，所述未偶联的靶向性分子是与所述偶联物的靶向性
分子相同或基本相同的靶向性分子。例如，在一些实施方式中，在所述偶联物的给药之前，给予所述对象所述靶向性分子、例如靶向蛋白质或抗原的未偶联的抗体。在一些实施方式中，所述靶向性分子在所述偶联物给药前最多96小时给药。在一些实施方式中，所述靶向性分子以约10mg/m2～约500mg/m2范围内的剂量给药。例如，所述靶向性分子是西妥昔单抗，且西妥昔单抗在所述偶联物给药前最多96小时给予所述对象。
[0461]
可以与本文所揭示的pit方法组合使用、可以在pit后约8小时内提高肿瘤对其它治疗剂的易感性的这种疗法的例子包括但不限于：用于去除或减小肿瘤的手术治疗如手术切除，冷冻疗法或化疗栓塞，以及抗肿瘤药物治疗，其可以包括放疗剂、抗肿瘤化疗剂、抗生素、烷基化剂和抗氧化剂、激酶抑制剂及其它药剂。在一些实施方式中，其它治疗剂与纳米颗粒偶联。可以使用的其它治疗剂的特别例子包括微管结合剂、dna嵌入剂或交联剂、dna合成抑制剂、dna和/或rna转录抑制剂、抗体、酶、酶抑制剂和基因调节剂。以治疗有效量给予的这些药剂和治疗可以单独或组合使用。这种药剂的治疗方法和治疗剂量是本领域技术人员已知的，并且可由有经验的临床医师确定。
[0462]
在一些实施方式中，微管结合剂是指与微管蛋白相互作用以使微管形成稳定化或不稳定化、从而抑制细胞分裂的药剂。可以与本文所揭示的偶联物疗法结合使用的微管结合剂的例子包括但不限于：紫杉醇、多西他赛、长春碱、长春地辛、长春瑞滨(诺维本)、埃博霉素类、秋水仙碱、多拉司他汀15、诺考达唑、鬼臼毒素和根霉素。也可以使用这种化合物的类似物和衍生物。例如可以使用合适的埃博霉素类或埃博霉素类似物。也可以使用紫杉烷类，例如紫杉醇和多西他赛。
[0463]
本文所揭示的pit方法中可以使用下述类型的化合物：合适的dna和/或rna转录调节剂，包括但不限于：放线菌素d、道诺霉素、多柔比星、以及也适合与本文所揭示的疗法组合使用的其衍生物和类似物。可以给予对象的dna嵌入剂和交联剂，包括但不限于：顺铂、卡铂、奥沙利铂、丝裂霉素类如丝裂霉素c、博来霉素、苯丁酸氮芥、环磷酰胺以及其衍生物和类似物。适合用作治疗剂的dna合成抑制剂，包括但不限于：甲氨蝶呤、5-氟-5
′‑
脱氧尿苷、5-氟尿嘧啶及其类似物。合适的酶抑制剂的例子包括但不限于：喜树碱、依托泊苷、福美坦、曲古抑菌素以及其衍生物和类似物。影响基因调节的合适化合物包括导致一个或多个基因表达的增加或减少的药剂，例如雷洛昔芬、5-氮杂胞苷、5-氮杂-2
′‑
脱氧胞苷、他莫昔芬、4-羟基他莫昔芬、米非司酮以及其衍生物和类似物。激酶抑制剂包括格列卫(gleevac)、易瑞沙(iressa)和特罗凯(tarceva)，其防止生长因子的磷酸化和活化。
[0464]
其它治疗剂、例如可以落入或不落入上述一种或多种分类的抗肿瘤剂也适合与本文所揭示的pit疗法组合施用。例如，这种药剂包括阿霉素、芹菜素、雷帕霉素、2-嘧啶酮-b-核苷(zebularine)、西咪替丁以及其衍生物和类似物。
[0465]
在一些实施方式中，对于接受治疗偶联物组合物的对象，也通过例如静脉内给药给予白细胞介素-2(il-2)。在一些实施方式中，例如以至少500,000iu/kg的剂量以静脉内推注的方式、例如每8小时以超过15分钟的时间、从所述肽给药后的那天开始给予il-2，并持续最多5天。剂量可以根据对象的耐受性而跳过。
[0466]
可以与所述偶联物的给药组合使用的疗法的其它例子包括但不限于：用于去除或减小肿瘤的手术治疗如手术切除，冷冻疗法或化疗栓塞，以及抗肿瘤药物治疗，其可以包括放疗剂、抗肿瘤化疗剂、抗生素、烷基化剂和抗氧化剂、激酶抑制剂及其它药剂。可以使用的
其它治疗剂的特别例子包括微管结合剂、dna嵌入剂或交联剂、dna合成抑制剂、dna和/或rna转录抑制剂、抗体、酶、酶抑制剂、基因调节剂和darpin(预设计锚蛋白重复蛋白(designed ankyrin repeat protein))如单darpin。可以治疗有效量给予的这些药剂和治疗可以单独或组合使用。这种药剂的治疗方法和治疗剂量可由有经验的临床医师确定。
[0467]
在一些实施方式中，在给予本文所揭示的疗法、例如给予酞菁染料－靶向性分子偶联物之前，转移性肿瘤之类的肿瘤的至少一部分已通过例如冷冻疗法手术去除、做过辐照、通过例如化疗栓塞进行过化学治疗、或者它们的组合。例如，具有转移性肿瘤的对象可以在给予本文所揭示的疗法之前将部分或全部的肿瘤手术切除。在一些实施方式中，在用偶联物和辐照治疗后给予一种或多种化疗剂。在一些实施方式中，所述对象具有转移性肿瘤，并且在给予本文所揭示的疗法的同时给予放射疗法、化疗栓塞疗法或两者。
[0468]
iii.定义
[0469]
除非另外定义，否则，本文中所使用的所有本领域术语、注释及其它技术和科学术语或专业术语都意图具有与本发明要求保护的实质性内容的所属领域普通技术人员通常所理解的同样含义。在一些情况下，本文中为了清楚性和/或为了供参考而对具有通常所理解的含义的术语进行定义，本文中所下的这种定义并不一定解释为表示与本领域的通常理解有实质性不同。
[0470]
如本文所用，除非上下文明确有其它的说明，否则单数形式的“一个”、“一种”和“该”包括复数的被谈到事物。例如，“一个”或“一种”是指“至少一个”或“一种或多种”。应理解，本文所述的方面和变化包括“包含”该方面和变化和/或“基本上由该方面和变化构成”。
[0471]
在本文的整个公开内容中，本发明要求保护的实质性内容的各种方面以范围的格式表示。应理解，范围格式的表述只是为了方便和简介，不应解释为对本发明要求保护的实质性内容的范围的不灵活的限定。因此应认为，范围的表述包括本文所具体公开的所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，当提供一个数值范围时，应理解在本发明要求保护的实质性内容中包括该范围上下限之间的每一个中间值，以及在该提到的范围内的任何其它所提到的或中间数值。所述较小范围内可独立地包含这些较小范围的上下限，它们也属于本发明要求保护的实质性内容，除非明确地排除该提到的范围的限值。该提到的范围包含一个或两个限值时，排除这一个或两个限值以外的范围也包括在本发明要求保护的实质性内容中。无论范围的宽度如何，这种解释都适用。
[0472]
如本文所用，术语“约”是指本领域技术人员已知的各数值的常规误差范围。本文中提及“约”一个数值或参数时，包括(并描述)针对该数值或参数本身的实施方式。例如，涉及“约x”的描述包括“x”的描述。
[0473]
如本文所用，“偶联物”是指与一种或多种多肽或化学部分之类的其它分子直接或间接连接的多肽。这种偶联物包括通过化学偶联制备的融合蛋白和通过任意其它方法制备的融合蛋白。例如，偶联物可以指与一种或多种多肽或化学部分之类的其它分子、例如与细胞表面蛋白结合或靶向细胞表面蛋白的靶向性分子直接或间接连接的酞菁染料、如ir700分子。
[0474]
如本文所用，组合物是指包括细胞在内的两种或多种产品、物质或化合物的任意混合物。其可以是溶液、混悬液、液体、粉末、糊料、水性物、非水性物或它们的任意组合。
[0475]
如本文所用，“药物组合物”或“药物制剂”是指一种制备物，其形态能够让其中所
含的活性成分的生物学活性得以起效，并且其中不含对于欲给予该制剂的对象而言具有不可接受的毒性的其它成分。
[0476]
如本文所用，“药学上可接受的载体”是指药物制剂中的除活性成分以外的成分，其对于对象而言是无毒的。药学上可接受的载体包括但不限于：缓冲液、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
[0477]
如本文所用，药盒是包装好的组合，任选地包括其它组分，例如其它的试剂以及该组合或其组分的使用说明书。
[0478]
术语“药品说明书”用于指代药物产品的市售包装中通常包含的说明书，其包括关于适应症、使用、剂量、给药、联合疗法、禁忌症和/或这种药物产品的使用警告的信息。
[0479]
如本文所用，“制品”是制造的产品，并且在一些情况下可以售卖。在一些实施方式中，该术语可以指代容器之类的包装制品中所含的组合物。
[0480]
如本文所用，“疾病或失调”是指由病因或病症导致的生物体内的病理状况，包括但不限于：感染、获得性病症、遗传性病症，并且以可识别的症状为特征。本文感兴趣的疾病和失调是可通过免疫球蛋白进行治疗的疾病和失调。
[0481]
如本文所用，“治疗”患有疾病或病症的对象，是指对象的症状部分或完全缓解、或者在治疗后保持稳定。因此，治疗包括预防、治疗和/或治愈。预防是指防止潜在的疾病和/或防止症状的恶化或疾病的进展。
[0482]
如本文所用，“治疗”指使病症、失调、疾病或其它表征的症状得以减轻或有其它有益改变的任何方式。
[0483]
如本文所用，“治疗有效”是指由对象的治疗产生的效果，其改变、一般是改善或减轻疾病或病症的症状，或者治愈疾病或病症。
[0484]
如本文所用，“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是指药剂、化合物、材料或含有化合物的组合物的至少足以产生治疗效果的量。因此，其是防止、治愈、减轻、阻止或部分阻止疾病或失调的症状所需的量。
[0485]
如本文所用，通过治疗、例如通过给予药物组合物或其它治疗药减轻特定疾病或失调的症状，是指可以归功于或有关于所述组合物或治疗药的给药的任何症状的减轻，无论该症状的减轻是永久的还是暂时的、是持久的还是短暂的。
[0486]
如本文所用，术语“对象”是指动物，包括哺乳动物，例如人。
[0487]
如本文所用，“任选”或“任选地”是指随后描述的事件或情况出现或者不出现，并且该描述包括所述事件或情况发生的实例及不发生的实例。例如，任选取代的基团是指该基团未被取代或被取代。
[0488]
本技术中提到的所有公开出版物、包括专利文献和科技文章和数据库都出于所有目的通过引用全文纳入本文中，相当于所述各单独的公开出版物独立地通过引用纳入本文。如果本文所列的定义与通过引用纳入本文的专利、申请、公开申请或其它公开出版物中所列的定义相反或不一致，则本文所列的定义优先于通过引用纳入本文的定义。
[0489]
本文所用章节标题仅用于组织目的，而不应理解为限制所述的实质性内容。
[0490]
iv.示例性实施方式
[0491]
本发明所提供的实施方式有：
[0492]
1.酞菁染料－靶向性分子偶联物的制造方法，其包括：
[0493]
a)在制造含有与靶向性分子连接的酞菁染料的偶联物的条件下，将所述靶向性分子与所述酞菁染料接触；以及
[0494]
b)在药学上可接受的缓冲液中配制所述偶联物；
[0495]
其中，在各步骤a)～b)中：
[0496]
所述染料和偶联物所暴露的光仅具有约400nm～约650nm范围内的波长，或者
[0497]
所述染料和偶联物所暴露的光仅具有小于500勒克斯的强度。
[0498]
2.酞菁染料－靶向性分子偶联物的制造方法，其包括：
[0499]
a)在制造含有与靶向性分子共价连接的酞菁染料的偶联物的条件下，将靶向性分子与酞菁染料以染料比靶向性分子为约1:1～1000:1的摩尔比接触；以及
[0500]
b)在药学上可接受的缓冲液中将所述偶联物配制成约0.01mg/ml～约200.0mg/ml的浓度；
[0501]
其中，在各步骤a)～b)中：
[0502]
所述染料和偶联物所暴露的光仅具有约400nm～约650nm范围内的波长，或者
[0503]
所述染料和偶联物所暴露的光仅具有小于500勒克斯的强度。
[0504]
3.如实施方式1或2所述的方法，其中，所述偶联物配制成约0.01mg/ml～约200.0mg/ml或约0.5mg/ml～约10.0mg/ml的浓度。
[0505]
4.如实施方式1～3中任一项所述的方法，其中，所述偶联物配制成约0.5mg/ml～约5.0mg/ml的浓度。
[0506]
5.如实施方式1～4中任一项所述的方法，其中，在所述接触步骤之前，在所述染料所暴露的光仅具有约400nm～约650nm范围内的波长、或者所述染料所暴露的光仅具有小于500勒克斯的强度的条件下，将所述酞菁染料溶解于溶剂。
[0507]
6.如实施方式5所述的方法，其中，所述染料以约0.1mg/ml～约100mg/ml范围内的浓度溶解于溶剂。
[0508]
7.如实施方式5或6所述的方法，其中，所述染料以约1mg/ml～约50mg/ml的浓度溶解于溶剂。
[0509]
8.如实施方式1～7中任一项所述的方法，其中，所述酞菁染料在溶剂中的浓度为约10mg/ml。
[0510]
9.如实施方式5～8中任一项所述的方法，其中，所述溶剂选自二甲亚砜(dmso)或dmf和水基溶剂。
[0511]
10.如实施方式5～9中任一项所述的方法，其中，所述溶剂是dmso。
[0512]
11.如实施方式1～10中任一项所述的方法，其中，所述配制步骤包括浓缩所述偶联物。
[0513]
12.如实施方式1～11中任一项所述的方法，其中，所述接触步骤在约4℃～约37℃的温度下进行至少15分钟。
[0514]
13.如实施方式1～12中任一项所述的方法，其中，所述接触步骤进行90分钟～150分钟。
[0515]
14.如实施方式1～13中任一项所述的方法，其中，所述接触步骤在约25℃
±
1.0℃的温度下进行。
[0516]
15.如实施方式1～14中任一项所述的方法，其中，所述酞菁染料与所述靶向性分
子共价或非共价连接。
[0517]
16.如实施方式1～14中任一项所述的方法，其中，所述酞菁染料包含反应性化学基团，且通过将所述酞菁染料与靶向性分子接触，制得的偶联物含有与所述靶向性分子的连接基团共价结合的酞菁染料。
[0518]
17.如实施方式16所述的方法，其中还包括在所述接触步骤之前将所述偶联物骤冷，其中：
[0519]
所述偶联物在所述骤冷步骤中所暴露的光仅具有约400nm～约650nm范围内的波长，或者
[0520]
所述偶联物在所述骤冷步骤中所暴露的光仅具有小于500勒克斯的强度。
[0521]
18.如实施方式1～17中任一项所述的方法，其中，所述配制步骤包括超滤、渗滤或透析。
[0522]
19.如实施方式1～18中任一项所述的方法，其中还包括所述偶联物的无菌过滤。
[0523]
20.如实施方式1～19中任一项所述的方法，其中还包括d)将所述偶联物包装在一个或多个避光容器内，其中，在所述包装步骤中：
[0524]
所述偶联物所暴露的光仅具有约400nm～约650nm范围内的波长，或者
[0525]
所述染料和偶联物所暴露的光仅具有小于500勒克斯的强度。
[0526]
21.酞菁染料－靶向性分子偶联物的制造方法，其包括：
[0527]
a)将酞菁染料以约0.1～100mg/ml的浓度溶解于溶剂；
[0528]
b)在制造含有与靶向性分子连接的酞菁染料的偶联物的条件下，将所述靶向性分子与所述酞菁染料以染料比靶向性分子为1:1～1000:1的摩尔比接触；
[0529]
c)在药学上可接受的缓冲液中将所述偶联物配制成约0.01～约200.0mg/ml的浓度；以及
[0530]
d)将所述偶联物包装在一个或多个避光容器内；
[0531]
其中，在各步骤a)～d)中：
[0532]
所述染料和偶联物所暴露的光仅具有约400nm～约650nm范围内的波长，或者
[0533]
所述染料和偶联物所暴露的光仅具有小于500勒克斯的强度。
[0534]
22.如实施方式21所述的方法，其中，所述酞菁染料与所述靶向性分子共价或非共价连接。
[0535]
23.如实施方式21或22所述的方法，其中，所述酞菁染料包含反应性化学基团，且通过将所述酞菁染料与靶向性分子接触，制得的偶联物含有与所述靶向性分子的连接基团共价结合的酞菁染料。
[0536]
24.如实施方式1～23中任一项所述的方法，其中，在所述方法中，所述染料和偶联物在任何光下的总暴露量不超过5000勒克斯小时、不超过2500勒克斯小时、不超过1000勒克斯小时、不超过500勒克斯小时、不超过250勒克斯小时、不超过100勒克斯小时或不超过80勒克斯小时。
[0537]
25.如实施方式20～24中任一项所述的方法，其中，在所述包装步骤中，所述偶联物在任何光下的总暴露量不超过5000勒克斯小时、不超过2500勒克斯小时、不超过1000勒克斯小时、不超过500勒克斯小时、不超过250勒克斯小时、不超过100勒克斯小时或不超过80勒克斯小时。
[0538]
26.如实施方式1～25中任一项所述的方法，其中，所述染料的最大吸收波长为约600nm～约850nm。
[0539]
27.如实施方式1～26中任一项所述的方法，其中，所述染料的最大吸收波长为约650nm～约850nm。
[0540]
28.如实施方式1～27中任一项所述的方法，其中，所述染料的最大吸收波长为约680nm～约850nm。
[0541]
29.如实施方式1～28中任一项所述的方法，其中，所述酞菁染料包含下式的化合物：
[0542]
其中：
[0543]
l是接头；
[0544]
q是用于将染料与靶向性分子连接的反应性基团；
[0545]
r2、r3、r7和r8各自独立地选自任选取代的烷基和任选取代的芳基；
[0546]
r4、r5、r6、r9、r
10
和r
11
各自独立地选自氢、任选取代的烷基、任选取代的烷酰基、任选取代的烷氧基羰基、任选取代的烷基氨基甲酰基和螯合配体，其中，r4、r5、r6、r9、r
10
和r
11
中的至少一个包含水溶性基团；
[0547]r12
、r
13
、r
14
、r
15
、r
16
、r
17
、r
18
、r
19
、r
20
、r
21
、r
22
和r
23
各自独立地选自氢、卤素、任选取代的烷硫基、任选取代的烷基氨基和任选取代的烷氧基；并且
[0548]
x2和x3各自独立地是c1～c
10
亚烷基，任选地被杂原子隔开。
[0549]
30.如实施方式1～29中任一项所述的方法，其中，所述反应性基团选自胺反应性化学基团、巯基反应性化学基团、活化酯、酰基卤、烷基卤、酸酐、羧酸、碳二亚胺、碳酸酯、氨基甲酸酯、卤代乙酰胺、异氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、亚磷酰胺、铂络合物、磺酸酯和硫氰酸酯。
[0550]
31.如实施方式30所述的方法，其中，所述反应性化学基团是选自马来酰亚胺、卤代乙酰基和吡啶基二硫化物的巯基反应性化学基团。
[0551]
32.如实施方式1～30中任一项所述的方法，其中，所述酞菁染料与所述靶向性分
子的赖氨酸残基共价结合。
[0552]
33.如实施方式32所述的方法，其中，所述反应性基团是作为胺反应性化学基团的n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)酯。
[0553]
34.如实施方式1～30及32～33中任一项所述的方法，其中，所述酞菁染料包含下式的化合物：
[0554][0555]
其中：
[0556]
x1和x4各自独立地是c1～c
10
亚烷基，任选地被杂原子隔开；
[0557]
r2、r3、r7和r8各自独立地选自任选取代的烷基和任选取代的芳基；
[0558]
r4、r5、r6、r9、r
10
和r
11
各自独立地选自氢、任选取代的烷基、任选取代的烷酰基、任选取代的烷氧基羰基、任选取代的烷基氨基甲酰基和螯合配体，其中，r4、r5、r6、r9、r
10
和r
11
中的至少一个包含水溶性基团；并且
[0559]r16
、r
17
、r
18
和r
19
各自独立地选自氢、卤素、任选取代的烷硫基、任选取代的烷基氨基和任选取代的烷氧基。
[0560]
35.如实施方式1～34中任一项所述的方法，其中，所述酞菁染料包含irdye 700dx-nhs(ir700-nhs)。
[0561]
36.如实施方式1～35中任一项所述的方法，其中，所述靶向性分子直接或间接地与抗原或蛋白质结合。
[0562]
37.如实施方式36所述的方法，其中，所述靶向性分子是与第一结合性分子结合的第二结合性分子，所述第一结合性分子能够与所述抗原或蛋白质结合。
[0563]
38.如实施方式36或37所述的方法，其中，所述靶向性分子是第二抗体。
[0564]
39.如实施方式1～38中任一项所述的方法，其中，所述靶向性分子与细胞或病原体表面上的细胞表面靶分子结合。
[0565]
40.如实施方式39所述的方法，其中，所述细胞是干细胞、增殖性细胞、增生中的细胞或被病原体感染的细胞。
[0566]
41.如实施方式39或40所述的方法，其中，所述病原体选自病毒、细菌、真菌、生物
1/kdr、及vegf-3或flt-4)、电压门控离子通道、vpac1、vpac2、维尔姆斯瘤1、y1、y2、y4和y5。
[0576]
51.如实施方式39～50中任一项所述的方法，其中，所述细胞表面靶分子选自her1/egfr、her2/erbb2、cd20、cd25(il-2rα受体)、cd33、cd52、cd133、cd206、cea、ceacam1、ceacam3、ceacam5、ceacam6、癌抗原125(ca125)、甲胎蛋白(afp)、lewis y、tag72、caprin-1、间皮素、pdgf受体、pd-1、pd-l1、ctla-4、il-2受体、血管内皮生长因子(vegf)、cd30、epcam、epha2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、gpa33、粘蛋白、caix、psma、叶酸盐结合蛋白、神经节苷脂(如gd2、gd3、gm1和gm2)、vegf受体(vegfr)、vegfr2、vegf-a、整联蛋白αvβ3、整联蛋白α5β1、erbb3、met、igf1r、epha3、trailr1、trailr2、rankl、fap、生腱蛋白、afp、bcr复合物、cd3、cd18、cd44、ctla-4、gp72、hla-dr 10β、hla-dr抗原、ige、muc-1、nuc242、pem抗原、金属蛋白酶、蝶素(ephrin)受体、蝶素配体、hgf受体、cxcr4、cxcr4、铃蟾肽受体、sk-1抗原、bcr-abl、ret、met、trkb、tie2、alk、ros、eml4-alk、ros1、brafv600e、src、c-kit、pdgfr、mtor、tsc1、tsc2、btk、kit、brca、cdk 4/6、jak1、jak2、braf、flt-3、mek1、mek2和smo。
[0577]
52.如实施方式39～51中任一项所述的方法，其中，所述细胞表面靶分子是her1/egfr、her2、pd-l1、cd25、epcam、epha2、cd206、cd20、cd44、cd133、间皮素、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3或癌胚抗原(cea)。
[0578]
53.如实施方式1～52中任一项所述的方法，其中，所述靶向性分子的至少一部分选自蛋白质、糖蛋白、抗体、抗体片段、抗原、抗原结合片段、肽、多肽、组织归巢肽、小分子、聚合物合成分子、聚合物纳米颗粒、脂质体、酶底物、激素、神经递质、细胞代谢物、病毒颗粒、病毒衣壳、病毒纳米颗粒、细菌颗粒、标记物、细胞、半抗原、亲和素、链霉亲和素、单体链霉亲和素、生物素、碳水化合物、寡糖、多糖、核酸、脱氧核酸、dna片段、rna片段、适体、核苷酸三磷酸、无环鸟苷终止子三磷酸或pna、或它们的组合。
[0579]
54.如实施方式1～53中任一项所述的方法，其中，所述靶向性分子是组织特异性归巢肽。
[0580]
55.如实施方式54所述的方法，其中，所述归巢肽具有seq id no：1～52中任一项所列的氨基酸序列。
[0581]
56.如实施方式1～53中任一项所述的方法，其中，所述靶向性分子是rgd多肽、irgd多肽、lyp-1多肽、cripto-1结合多肽、促生长素抑制素受体结合多肽、抑制素结合多肽、ngr多肽、ingr多肽或可激活细胞穿透肽(acpp)，该可激活细胞穿透肽由聚阳离子细胞穿透肽(cpp)通过可切割接头与中和性聚阴离子连接而构成。
[0582]
57.如实施方式1～53中任一项所述的方法，其中，所述靶向性分子选自促肾上腺皮质激素(acth)、血管紧张素ii、心房钠尿因子(anf)、铃蟾肽、缓激肽、脑源性神经营养因子(bdnf)、骨形态发生蛋白2(bmp-2)、骨形态发生蛋白6(bmp-6)、骨形态发生蛋白7(bmp-7)、降钙素、心肌营养素1(bmp-2)、cd22、cd40、胆囊收缩素(cck)、睫状节神经细胞营养因子(cntf)、ccl1-ccl28、cxcl1-cxcl17、xcl1、xcl2、cx3cl1、cripto1结合肽、血管内皮细胞生长因子(vegf)、表皮生长因子(egf)、内皮素1、内皮素1/3、fas配体、成纤维细胞生长因子1(fgf-1)、成纤维细胞生长因子2(fgf-2)、成纤维细胞生长因子4(fgf-4)、成纤维细胞生长因子5(fgf-5)、成纤维细胞生长因子6(fgf-6)、成纤维细胞生长因子7(fgf-7)、成纤维细胞生长因子10(fgf-10)、flt-3、胃泌素、胃泌素释放肽(grp)、粒细胞集落刺激因子(g-csf)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、胰高血糖素样肽(glp-1)、肝细胞生长因子(hgf)、
α干扰素(ifn-a)、β干扰素(ifn-b)、γ干扰素(ifng)、胰岛素样生长因子1(igf-1)、胰岛素样生长因子2(igf-2)、白细胞介素1(il-1)、白细胞介素2(il-2)、白细胞介素3(il-3)、白细胞介素4(il-4)、白细胞介素5(il-5)、白细胞介素6(il-6)、白细胞介素7(il-7)、白细胞介素8(il-8)、白细胞介素9(il-9)、白细胞介素10(il-10)、白细胞介素11(il-11)、白细胞介素12(il-12)、白细胞介素13(il-13)、白细胞介素15(il-15)、白细胞介素17(il-17)、白细胞介素19(il-19)、黄体生成素(lh)、黄体生成素释放激素(lhrh)、巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)、单核细胞趋化蛋白1(mcp-1)、巨噬细胞炎性蛋白3a(mip-3a)、巨噬细胞炎性蛋白3b(mip-3b)、神经生长因子(ngf)、神经介素b、神经营养因子3(nt-3)、神经营养因子4(nt-4)、神经降压素、神经肽y、催产素、垂体腺苷酸环化酶激活肽(pacap)、血小板衍生生长因子aa(pdgf-aa)、血小板衍生生长因子ab(pdgf-ab)、血小板衍生生长因子bb(pdgf-bb)、血小板衍生生长因子cc(pdgf-cc)、血小板衍生生长因子dd(pdgf-dd)、导蛋白-1(ntn1)、导蛋白-2(ntn2)、导蛋白-4(ntn4)、导蛋白-g1(ntng1)和导蛋白-g2(ntng2)、蝶素a1(efna1)、蝶素a2(efna2)、蝶素a3(efna3)、蝶素a4(efna4)、蝶素a5(efna5)、脑信号蛋白3a(sema3a)、脑信号蛋白3b(sema3b)、脑信号蛋白3c(sema3c)、脑信号蛋白3d(sema3d)、脑信号蛋白3f(sema3f)、脑信号蛋白3g(sema3g)、脑信号蛋白4a(sema4a)、脑信号蛋白4b(sema4b)、脑信号蛋白4c(sema4c)、脑信号蛋白4d(sema4d)、脑信号蛋白4f(sema4f)、脑信号蛋白4g(sema4g)、脑信号蛋白5a(sema5a)、脑信号蛋白5b(sema5b)、脑信号蛋白6a(sema6a)、脑信号蛋白6b(sema6b)、脑信号蛋白6d(sema6d)、脑信号蛋白7a(sema7a)、slit1、slit2、slit3、slit和ntrk样家族成员1(slitrk1)、slit和ntrk样家族成员2(slitrk2)、slit和ntrk样家族成员3(slitrk3)、slit和ntrk样家族成员4(slitrk4)、slit和ntrk样家族成员5(slitrk5)、slit和ntrk样家族成员6(slitrk6)、前列腺素e2(pge2)、rantes、促生长素抑制素-14、促生长素抑制素-28、干细胞因子(scf)、基质细胞衍生因子1(sdf-1)、p物质、促甲状腺激素(tsh)、转化生长因子α(tgf-α)、转化生长因子β(tgf-b)、肿瘤坏死因子α(tnf-α)、凝血酶、血管活性肠肽(vip)、wntl、wnt2、wnt2b/13、wnt3、wnt3a、wnt4、wnt5a、wnt5b、wnt6、wnt7a、wnt7b、wnt7c、wnt8、wnt8a、wnt8b、wnt8c、wntl0a、wntl0b、wnt11、wnt14、wnt15或wnt16、音猬因子、沙漠刺猬因子和印度刺猬因子。
[0583]
58.如实施方式1～53中任一项所述的方法，其中，所述靶向性分子是抗体或抗体片段。
[0584]
59.如实施方式58所述的方法，其中，所述抗体选自西妥昔单抗、帕尼单抗、扎卢木单抗、尼妥珠单抗、曲妥珠单抗、ado-曲妥珠单抗美坦新、托西莫单抗利妥昔单抗(rituxan、mabthera)、替伊莫单抗(zevalin)、达珠单抗(zenapax)、吉姆单抗(mylotarg)、阿仑单抗、cea-扫描fab片段、oc125单克隆抗体、ab75705、b72.3、贝伐单抗阿法替尼、阿西替尼、博舒替尼、卡博替尼、色瑞替尼、克唑替尼、达拉非尼、达沙替尼、埃罗替尼、依维莫司、依鲁替尼、伊马替尼、拉帕替尼、乐伐替尼、尼洛替尼、奥拉帕尼、帕博西尼、帕唑帕尼、帕妥珠单抗、雷莫芦单抗、瑞格非尼、鲁索替尼、索拉非尼、舒尼替尼、坦西莫司、曲美替尼、凡德他尼、维罗非尼、维莫德吉、巴利昔单抗、伊匹单抗、纳武单抗、派姆单抗、mpdl3280a、皮地利珠单抗(pidilizumab)(ct-011)、amp-224、msb001078c和medi4736，或者是其抗原结合片段。
[0585]
60.如实施方式58所述的方法，其中，所述抗体与选自her1/egfr、her2、pd-l1和癌
胚抗原(cea)的细胞表面靶分子结合。
[0586]
61.如实施方式58～60中任一项所述的方法，其中，所述抗体选自西妥昔单抗、帕尼单抗、曲妥珠单抗、bms-935559、medi4736、mpdl3280a和msb0010718c，或者是其抗原结合片段。
[0587]
62.如实施方式1～61中任一项所述的方法，其中，所述染料－靶向性分子偶联物选自西妥昔单抗-ir700、帕尼单抗-ir700、曲妥珠单抗-ir700、bms-935559-ir700、medi4736-ir700、mpdl3280a-ir700和msb0010718c-ir700。
[0588]
63.如实施方式1～62中任一项所述的方法，其中，步骤b)中的所述靶向性分子与所述酞菁染料以染料比靶向性分子为1:1～100:1或1:1～10:1的摩尔比接触。
[0589]
64.如实施方式1～63中任一项所述的方法，其中，染料比靶向性分子的摩尔比至少为约4:1或至少为约10:1。
[0590]
65.如实施方式1～64中任一项所述的方法，其中，所制备的偶联物相对于每一个靶向性分子包含约1～约1000个酞菁染料分子、约1～约10个酞菁染料分子或约2～约5个酞菁染料分子。
[0591]
66.如实施方式1～65中任一项所述的方法，其中，所述偶联物配制成约1.0～约5.0mg/ml的浓度。
[0592]
67.如实施方式1～66中任一项所述的方法，其中，所述药学上可接受的缓冲液是磷酸盐缓冲盐水。
[0593]
68.如实施方式1～67中任一项所述的方法，其中，所述药学上可接受的缓冲液具有约ph 6.0～约ph 8.0的ph，其中所述偶联物在多于3个月的时间内稳定。
[0594]
69.如实施方式68所述的方法，其中，如果所述偶联物与储存前的偶联物相比在多于3个月的时间内保持大于约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高的效价、活性或纯度，则所述偶联物在这段时间内是稳定的。
[0595]
70.如实施方式68所述的方法，其中，如果多于90％的所述偶联物作为主要单体成分存在，则所述偶联物是稳定的。
[0596]
71.如实施方式68～70中任一项所述的方法，其中，所述药学上可接受的缓冲液具有约ph 6.8～约ph 7.4的ph。
[0597]
72.如实施方式1～71中任一项所述的方法，其中，所述染料和偶联物所暴露的光仅具有约425nm～约575nm范围内的波长。
[0598]
73.如实施方式1～72中任一项所述的方法，其中，所述染料和偶联物在所述包装步骤中所暴露的光仅具有小于200勒克斯的强度。
[0599]
74.如实施方式20～73中任一项所述的方法，其中，所述容器确保具有约250nm～约800nm、约250nm～约450nm、约400nm～约800nm、约450nm～约650nm或约600nm～约720nm的波长的光不透过。
[0600]
75.如实施方式74所述的方法，其中，所述容器确保光不透过，使得透光率百分数小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％或小于5％。
[0601]
76.如实施方式20～75中任一项所述的方法，其中，所述容器是绿色、蓝色、琥珀色、半透明、不透明、或用具有小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％或小于5％的透光率的材料覆盖。
[0602]
77.如实施方式20～76中任一项所述的方法，其中，所述容器选自药瓶、管子、注射器、包、袋子和盒子。
[0603]
78.如实施方式20～77中任一项所述的方法，其中，所述避光容器是第一避光容器，且所述方法还包括将所述第一避光容器包装在第二避光容器内。
[0604]
79.如实施方式78所述的方法，其中，所述第二容器确保具有约250nm～约800nm、约250nm～约450nm、约400nm～约800nm、约450nm～约650nm或约600nm～约720nm的波长的光不透过。
[0605]
80.如实施方式78或79所述的方法，其中，所述第二容器确保光不透过，使得透光率百分数小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％或小于5％。
[0606]
81.如实施方式78～80中任一项所述的方法，其中，所述第二容器是绿色、蓝色、琥珀色、半透明、不透明、或用具有小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％或小于5％的透光率的材料覆盖。
[0607]
82.如实施方式78～81中任一项所述的方法，其中，所述第二容器选自药瓶、管子、注射器、包、袋子和盒子。
[0608]
83.如实施方式78～82中任一项所述的方法，其中还包括将所述第二容器包装在第三避光容器内。
[0609]
84.如实施方式83所述的方法，其中，所述第三容器确保具有约250nm～约800nm、约250nm～约450nm、约400nm～约800nm、约450nm～约650nm或约600nm～约720nm的波长的光不透过。
[0610]
85.如实施方式84所述的方法，其中，所述第三容器确保光不透过，使得透光率百分数小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％或小于5％。
[0611]
86.如实施方式84或85所述的方法，其中，所述第三容器是绿色、蓝色、琥珀色、半透明、不透明、或用具有小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％或小于5％的透光率的材料覆盖。
[0612]
87.如实施方式83～86中任一项所述的方法，其中，所述第三容器选自药瓶、管子、注射器、包、袋子和盒子。
[0613]
88.如实施方式1～87中任一项所述的方法，其中，通过所述方法制造的偶联物的量多于约1克、多于约2克、多于约3克、多于约4克、多于约5克或多于约10克。
[0614]
89.如实施方式1～88中任一项所述的方法，其中，所述偶联物用药品生产质量管理规范(gmp)制造。
[0615]
90.一种偶联物，其通过实施方式1～89中任一项所述的方法制造、配制或包装。
[0616]
91.如实施方式90所述的偶联物，其在多于3个月的时间内稳定。
[0617]
92.一种稳定偶联物，含有与靶向性分子连接的酞菁染料，其中，所述偶联物在多于3个月的时间内稳定。
[0618]
93.如实施方式91所述的偶联物或实施方式92所述的稳定偶联物，其中，如果所述偶联物与储存前的偶联物相比在多于3个月的时间内保持大于约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高的效价、活性或纯度，则所述偶联物在这段时间内是稳定的。
[0619]
94.如实施方式91所述的偶联物或实施方式92所述的稳定偶联物，其中，如果多于90％的所述偶联物作为主要单体成分存在，则所述偶联物是稳定的。
[0620]
95.如实施方式94所述的偶联物或稳定偶联物，其中，如果多于95％的所述偶联物作为主要单体成分存在，则所述偶联物是稳定的。
[0621]
96.如实施方式90～95中任一项所述的偶联物或稳定偶联物，其中，所述偶联物在多于6个月或多于12个月的时间内稳定。
[0622]
97.如实施方式90～96中任一项所述的偶联物或稳定偶联物，其中，所述偶联物在低于30℃的温度下稳定。
[0623]
98.如实施方式90～97中任一项所述的偶联物或稳定偶联物，其中，所述酞菁染料包含下式的化合物：
[0624]
其中：
[0625]
l是接头；
[0626]
q是用于将染料与靶向性分子连接的反应性基团；
[0627]
r2、r3、r7和r8各自独立地选自任选取代的烷基和任选取代的芳基；
[0628]
r4、r5、r6、r9、r
10
和r
11
各自独立地选自氢、任选取代的烷基、任选取代的烷酰基、任选取代的烷氧基羰基、任选取代的烷基氨基甲酰基和螯合配体，其中，r4、r5、r6、r9、r
10
和r
11
中的至少一个包含水溶性基团；
[0629]r12
、r
13
、r
14
、r
15
、r
16
、r
17
、r
18
、r
19
、r
20
、r
21
、r
22
和r
23
各自独立地选自氢、卤素、任选取代的烷硫基、任选取代的烷基氨基和任选取代的烷氧基；并且
[0630]
x2和x3各自独立地是c1～c
10
亚烷基，任选地被杂原子隔开。
[0631]
99.如实施方式90～98中任一项所述的偶联物或稳定偶联物，其中，所述酞菁染料包含下式的化合物：
[0632][0633]
其中：
[0634]
x1和x4各自独立地是c1～c
10
亚烷基，任选地被杂原子隔开；
[0635]
r2、r3、r7和r8各自独立地选自任选取代的烷基和任选取代的芳基；
[0636]
r4、r5、r6、r9、r
10
和r
11
各自独立地选自氢、任选取代的烷基、任选取代的烷酰基、任选取代的烷氧基羰基、任选取代的烷基氨基甲酰基和螯合配体，其中，r4、r5、r6、r9、r
10
和r
11
中的至少一个包含水溶性基团；并且
[0637]r16
、r
17
、r
18
和r
19
各自独立地选自氢、卤素、任选取代的烷硫基、任选取代的烷基氨基和任选取代的烷氧基。
[0638]
100.如实施方式90～99中任一项所述的偶联物或稳定偶联物，其中，所述染料的最大吸收波长为约600nm～约850nm、约650nm～约850nm或约680nm～约850nm。
[0639]
101.如实施方式90～100中任一项所述的偶联物或稳定偶联物，其中，所述染料包含irdye 700dx(ir700)。
[0640]
102.如实施方式90～101中任一项所述的偶联物或稳定偶联物，其中，所述靶向性分子与细胞或病原体表面上的细胞表面靶分子结合。
[0641]
103.如实施方式90～102中任一项所述的偶联物或稳定偶联物，其中，所述细胞是干细胞、增殖性细胞、增生中的细胞或被病原体感染的细胞。
[0642]
104.如实施方式102或103所述的偶联物或稳定偶联物，其中，所述病原体选自病毒、细菌、真菌、生物膜或其它原核细胞系统。
[0643]
105.如实施方式102或103所述的偶联物或稳定偶联物，其中，所述细胞是增殖性细胞、癌细胞、增生中的细胞、肿瘤细胞、炎性细胞、神经元或病原体。
[0644]
106.如实施方式105所述的偶联物或稳定偶联物，其中，所述炎性细胞是选自中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞的白细胞。
[0645]
107.如实施方式105所述的偶联物或稳定偶联物，其中，所述神经元是外周神经系统神经元或中枢神经系统神经元。
[0646]
108.如实施方式105或107所述的偶联物或稳定偶联物，其中，所述神经元是选自
温度性伤害感受器、机械性伤害感受器、化学性伤害感受器和多形性伤害感受器的伤害感受器。
[0647]
109.如实施方式102～108中任一项所述的偶联物或稳定偶联物，其中，所述细胞表面靶分子包括抗原、多肽、脂质或碳水化合物、或者它们的组合。
[0648]
110.如实施方式102～109中任一项所述的偶联物或稳定偶联物，其中，所述细胞表面靶分子选自细胞膜磷脂、原核肽聚糖、细菌细胞包膜蛋白、病毒衣壳蛋白、acthr、内皮细胞anxa-1、氨肽酶n、抗-il-6r、alpha-4-整联蛋白、α-5-β-3-整联蛋白、α-5-β-5-整联蛋白、甲胎蛋白(afp)、anpa、anpb、apa、apn、app、1ar、2ar、at1、b1、b2、bage1、bage2、b-细胞受体bb1、bb2、bb4、降钙素受体、癌抗原125(ca 125)、cck1、cck2、cd5、cd10、cd11a、cd13、cd14、cd19、cd20、cd22、cd25、cd30、cd33、cd38、cd45、cd52、cd56、cd68、cd90、cd133、cd7、cd15、cd34、cd44、cd206、cd271、cea(癌胚抗原)、cgrp、趋化因子受体、细胞表面膜联蛋白-1、细胞表面网蛋白-1、cripto-1、crlr、cxcr2、cxcr4、dcc、dll3、e2糖蛋白、egfr、egfrviii、emr1、内皮唾液酸蛋白、ep2、ep4、epcam、epha2、et受体、纤连蛋白、纤连蛋白ed-b、fgfr、卷曲受体(frizzled receptors)、gage1、gage2、gage3、gage4、gage5、gage6、glp-1受体、a族(视紫红质样)的g-蛋白偶联受体、b组(分泌素受体样)的g-蛋白偶联受体、c族(代谢型谷氨酸盐受体样)的g-蛋白偶联受体、gd2、gp100、gp120、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、血凝素、硫酸肝素、her1、her2、her3、her4、hmfg、hpv 16/18和e6/e7抗原、htert、il-2r、il11-r、il-13r、itgam、激肽释放酶-9、lewis y、lh受体、lhrh-r、lpa1、mac-1、mage 1、mage 2、mage 3、mage 4、mart1、mc1r、间皮素、muc1、muc16、neu(细胞表面核仁素)、脑啡肽酶、神经菌毛素-1、神经菌毛素-2、ng2、nk1、nk2、nk3、nmb-r、notch-1、ny-eso-1、ot-r、突变型p53、p97黑色素瘤抗原、ntr2、ntr3、p32(p32/gc1q-r/habp1)、p75、pac1、par1、补缀(patched)(ptch)、pdgfr、pdfg受体、pdt、蛋白酶剪切胶原iv、蛋白水解酶3、抑制素、蛋白酪氨酸激酶7、psa、psma、嘌呤能p2x家族(如p2x1-5)、突变型ras、ramp1、ramp2、ramp3补缀、ret受体、丛蛋白、平滑(smoothened)、sst1、sst2a、sst2b、sst3、sst4、sst5、p物质、tems、t细胞cd3受体、tag72、tgfbr1、tgfbr2、tie-1、tie-2、trk-a、trk-b、trk-c、tr1、trpa、trpc、trpv、trpm、trpml、trpp(如trpv1-6、trpa1、trpc1-7、trpm1-8、trpp1-5、trpml1-3)、tsh受体、vegf受体(vegfr1或flt-1、vegfr2或flk-1/kdr、及vegf-3或flt-4)、电压门控离子通道、vpac1、vpac2、维尔姆斯瘤1、y1、y2、y4和y5。
[0649]
111.如实施方式102～110中任一项所述的偶联物或稳定偶联物，其中，所述细胞表面靶分子选自her1/egfr、her2/erbb2、cd20、cd25(il-2rα受体)、cd33、cd52、cd133、cd206、cea、ceacam1、ceacam3、ceacam5、ceacam6、癌抗原125(ca125)、甲胎蛋白(afp)、lewis y、tag72、caprin-1、间皮素、pdgf受体、pd-1、pd-l1、ctla-4、il-2受体、血管内皮生长因子(vegf)、cd30、epcam、epha2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、gpa33、粘蛋白、caix、psma、叶酸盐结合蛋白、神经节苷脂(如gd2、gd3、gm1和gm2)、vegf受体(vegfr)、vegfr2、vegf-a、整联蛋白αvβ3、整联蛋白α5β1、erbb3、met、igf1r、epha3、trailr1、trailr2、rankl、fap、生腱蛋白、afp、bcr复合物、cd3、cd18、cd44、ctla-4、gp72、hla-dr 10β、hla-dr抗原、ige、muc-1、nuc242、pem抗原、金属蛋白酶、蝶素(ephrin)受体、蝶素配体、hgf受体、cxcr4、cxcr4、铃蟾肽受体、sk-1抗原、bcr-abl、ret、met、trkb、tie2、alk、ros、eml4-alk、ros1、brafv600e、src、c-kit、pdgfr、mtor、tsc1、tsc2、btk、kit、brca、cdk 4/6、jak1、jak2、braf、flt-3、
mek1、mek2和smo。
[0650]
112.如实施方式102～111中任一项所述的偶联物或稳定偶联物，其中，所述细胞表面靶分子是her1/egfr、her2、pd-l1、cd25、epcam、epha2、cd206、cd20、cd44、cd133、间皮素、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3或癌胚抗原(cea)。
[0651]
113.如实施方式90～112中任一项所述的偶联物或稳定偶联物，其中，所述靶向性分子的至少一部分选自蛋白质、糖蛋白、抗体、抗体片段、抗原、抗原结合片段、肽、多肽、组织归巢肽、小分子、聚合物合成分子、聚合物纳米颗粒、脂质体、酶底物、激素、神经递质、细胞代谢物、病毒颗粒、病毒衣壳、病毒纳米颗粒、细菌颗粒、标记物、细胞、半抗原、亲和素、链霉亲和素、单体链霉亲和素、生物素、碳水化合物、寡糖、多糖、核酸、脱氧核酸、dna片段、rna片段、适体、核苷酸三磷酸、无环鸟苷终止子三磷酸或pna、或它们的组合。
[0652]
114.如实施方式90～113中任一项所述的偶联物或稳定偶联物，其中，所述靶向性分子是组织特异性归巢肽。
[0653]
115.如实施方式114所述的偶联物或稳定偶联物，其中，所述归巢肽具有seq id no：1～52中任一项所列的序列。
[0654]
116.如实施方式90～113中任一项所述的偶联物或稳定偶联物，其中，所述靶向性分子是rgd多肽、irgd多肽、lyp-1多肽、cripto-1结合多肽、促生长素抑制素受体结合多肽、抑制素结合多肽、ngr多肽、ingr多肽或可激活细胞穿透肽(acpp)，该可激活细胞穿透肽由聚阳离子细胞穿透肽(cpp)通过可切割接头与中和性聚阴离子连接而构成。
[0655]
117.如实施方式90～113中任一项所述的偶联物或稳定偶联物，其中，所述靶向性分子选自促肾上腺皮质激素(acth)、血管紧张素ii、心房钠尿因子(anf)、铃蟾肽、缓激肽、脑源性神经营养因子(bdnf)、骨形态发生蛋白2(bmp-2)、骨形态发生蛋白6(bmp-6)、骨形态发生蛋白7(bmp-7)、降钙素、心肌营养素1(bmp-2)、cd22、cd40、胆囊收缩素(cck)、睫状节神经细胞营养因子(cntf)、ccl1-ccl28、cxcl1-cxcl17、xcl1、xcl2、cx3cl1、cripto 1结合肽、血管内皮细胞生长因子(vegf)、表皮生长因子(egf)、内皮素1、内皮素1/3、fas配体、成纤维细胞生长因子1(fgf-1)、成纤维细胞生长因子2(fgf-2)、成纤维细胞生长因子4(fgf-4)、成纤维细胞生长因子5(fgf-5)、成纤维细胞生长因子6(fgf-6)、成纤维细胞生长因子7(fgf-7)、成纤维细胞生长因子10(fgf-10)、flt-3、胃泌素、胃泌素释放肽(grp)、粒细胞集落刺激因子(g-csf)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、胰高血糖素样肽(glp-1)、肝细胞生长因子(hgf)、α干扰素(ifn-a)、β干扰素(ifn-b)、γ干扰素(ifng)、胰岛素样生长因子1(igf-1)、胰岛素样生长因子2(igf-2)、白细胞介素1(il-1)、白细胞介素2(il-2)、白细胞介素3(il-3)、白细胞介素4(il-4)、白细胞介素5(il-5)、白细胞介素6(il-6)、白细胞介素7(il-7)、白细胞介素8(il-8)、白细胞介素9(il-9)、白细胞介素10(il-10)、白细胞介素11(il-11)、白细胞介素12(il-12)、白细胞介素13(il-13)、白细胞介素15(il-15)、白细胞介素17(il-17)、白细胞介素19(il-19)、黄体生成素(lh)、黄体生成素释放激素(lhrh)、巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)、单核细胞趋化蛋白1(mcp-1)、巨噬细胞炎性蛋白3a(mip-3a)、巨噬细胞炎性蛋白3b(mip-3b)、神经生长因子(ngf)、神经介素b、神经营养因子3(nt-3)、神经营养因子4(nt-4)、神经降压素、神经肽y、催产素、垂体腺苷酸环化酶激活肽(pacap)、血小板衍生生长因子aa(pdgf-aa)、血小板衍生生长因子ab(pdgf-ab)、血小板衍生生长因子bb(pdgf-bb)、血小板衍生生长因子cc(pdgf-cc)、血小板衍生生长因子dd(pdgf-dd)、导蛋
白-1(ntn1)、导蛋白-2(ntn2)、导蛋白-4(ntn4)、导蛋白-g1(ntng1)和导蛋白-g2(ntng2)、蝶素a1(efna1)、蝶素a2(efna2)、蝶素a3(efna3)、蝶素a4(efna4)、蝶素a5(efna5)、脑信号蛋白3a(sema3a)、脑信号蛋白3b(sema3b)、脑信号蛋白3c(sema3c)、脑信号蛋白3d(sema3d)、脑信号蛋白3f(sema3f)、脑信号蛋白3g(sema3g)、脑信号蛋白4a(sema4a)、脑信号蛋白4b(sema4b)、脑信号蛋白4c(sema4c)、脑信号蛋白4d(sema4d)、脑信号蛋白4f(sema4f)、脑信号蛋白4g(sema4g)、脑信号蛋白5a(sema5a)、脑信号蛋白5b(sema5b)、脑信号蛋白6a(sema6a)、脑信号蛋白6b(sema6b)、脑信号蛋白6d(sema6d)、脑信号蛋白7a(sema7a)、slit1、slit2、slit3、slit和ntrk样家族成员1(slitrk1)、slit和ntrk样家族成员2(slitrk2)、slit和ntrk样家族成员3(slitrk3)、slit和ntrk样家族成员4(slitrk4)、slit和ntrk样家族成员5(slitrk5)、slit和ntrk样家族成员6(slitrk6)、前列腺素e2(pge2)、rantes、促生长素抑制素-14、促生长素抑制素-28、干细胞因子(scf)、基质细胞衍生因子1(sdf-1)、p物质、促甲状腺激素(tsh)、转化生长因子α(tgf-α)、转化生长因子β(tgf-b)、肿瘤坏死因子α(tnf-α)、凝血酶、血管活性肠肽(vip)、wntl、wnt2、wnt2b/13、wnt3、wnt3a、wnt4、wnt5a、wnt5b、wnt6、wnt7a、wnt7b、wnt7c、wnt8、wnt8a、wnt8b、wnt8c、wntl0a、wntl0b、wnt11、wnt14、wnt15或wnt16、音猬因子、沙漠刺猬因子和印度刺猬因子。
[0656]
118.如实施方式90～113中任一项所述的偶联物或稳定偶联物，其中，所述靶向性分子是抗体或抗体片段。
[0657]
119.如实施方式118所述的偶联物或稳定偶联物，其中，所述抗体选自西妥昔单抗、帕尼单抗、扎卢木单抗、尼妥珠单抗、曲妥珠单抗、ado-曲妥珠单抗美坦新、托西莫单抗利妥昔单抗(rituxan、mabthera)、替伊莫单抗(zevalin)、达珠单抗(zenapax)、吉姆单抗(mylotarg)、阿仑单抗、cea-扫描fab片段、oc125单克隆抗体、ab75705、b72.3、贝伐单抗阿法替尼、阿西替尼、博舒替尼、卡博替尼、色瑞替尼、克唑替尼、达拉非尼、达沙替尼、埃罗替尼、依维莫司、依鲁替尼、伊马替尼、拉帕替尼、乐伐替尼、尼洛替尼、奥拉帕尼、帕博西尼、帕唑帕尼、帕妥珠单抗、雷莫芦单抗、瑞格非尼、鲁索替尼、索拉非尼、舒尼替尼、坦西莫司、曲美替尼、凡德他尼、维罗非尼、维莫德吉、巴利昔单抗、伊匹单抗、纳武单抗、派姆单抗、mpdl3280a、皮地利珠单抗(pidilizumab)(ct-011)、amp-224、msb001078c和medi4736，或者是其抗原结合片段。
[0658]
120.如实施方式118或119所述的偶联物或稳定偶联物，其中，所述抗体与选自her1/egfr、her2、pd-l1和癌胚抗原(cea)的细胞表面靶分子结合。
[0659]
121.如实施方式118～120中任一项所述的偶联物或稳定偶联物，其中，所述抗体选自西妥昔单抗、帕尼单抗、曲妥珠单抗、bms-935559、medi4736、mpdl3280a和msb0010718c，或者是其抗原结合片段。
[0660]
122.如实施方式118～121中任一项所述的偶联物或稳定偶联物，其中，所述染料－靶向性分子偶联物选自西妥昔单抗-ir700、帕尼单抗-ir700、曲妥珠单抗-ir700、bms-935559-ir700、medi4736-ir700、mpdl3280a-ir700和msb0010718c-ir700。
[0661]
123.如实施方式90～122中任一项所述的偶联物或稳定偶联物，其中，所述偶联物相对于每一个靶向性分子包含约1～约1000个酞菁染料分子、约1～约10个酞菁染料分子或约2～约5个酞菁染料分子。
[0662]
124.一种组合物，其包含实施方式90～123和234～236中任一项所述的偶联物或
稳定偶联物。
[0663]
125.一种药物组合物，其包含实施方式90～123和234～236中任一项所述的偶联物或稳定偶联物和药学上可接受的赋形剂。
[0664]
126.如实施方式124或125所述的组合物，其在磷酸盐缓冲盐水中配制。
[0665]
127.如实施方式124～126中任一项所述的组合物，其具有高于6.0的ph。
[0666]
128.一种药物组合物，其包含与靶向性分子连接的酞菁染料和药学上可接受的赋形剂，其中：
[0667]
所述组合物具有高于6.0的ph；且
[0668]
所述组合物中的偶联物在多于3个月的时间内稳定。
[0669]
129.如实施方式128所述的药物组合物，其中，如果所述组合物中的偶联物与储存前的偶联物相比在多于3个月的时间内保持大于约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高的效价、活性或纯度，则所述偶联物在这段时间内是稳定的。
[0670]
130如实施方式128所述的药物组合物，其中，如果多于90％的所述偶联物作为主要单体成分存在，则所述组合物中的偶联物是稳定的。
[0671]
131.如实施方式127～130中任一项所述的组合物，其中，ph高于6.0，或者为约ph 6.0～约8.0，包括端值。
[0672]
132.如实施方式124～131中任一项所述的组合物，其中，所述组合物中的偶联物的浓度为约0.01mg/ml～约200mg/ml。
[0673]
133.如实施方式124～132中任一项所述的组合物，其中，所述组合物中的偶联物的浓度为约0.5mg/ml～约10mg/ml。
[0674]
134.如实施方式124～133中任一项所述的组合物，其中，所述组合物中的偶联物的浓度为约1.0～约5.0mg/ml。
[0675]
135.如实施方式124～134中任一项所述的组合物，其中，所述组合物中的偶联物的浓度为约1.8～约2.1mg/ml。
[0676]
136.如实施方式124～135中任一项所述的组合物，其中，所述组合物的体积为约0.5ml～约100ml、约1ml～约50ml或约1ml～约10ml。
[0677]
137.一种容器，其包含实施方式90～123和234～236中任一项所述的偶联物或稳定偶联物或实施方式124～136中任一项所述的组合物。
[0678]
138.如实施方式137所述的容器，其中，所述容器确保具有约500nm～约725nm或约650nm～约725nm的波长的光不透过。
[0679]
139.如实施方式137或138所述的容器，其中，所述容器确保光不透过，使得透光率百分数小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％或小于5％。
[0680]
140.如实施方式137～139中任一项所述的容器，其中，所述容器是绿色、蓝色、琥珀色、半透明、不透明、或用具有小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％或小于5％的透光率的材料覆盖。
[0681]
141.用于保护酞菁染料－靶向性分子偶联物不受光的影响的包装系统，其包括：
[0682]
第一容器，其包含实施方式137～140中任一项所述的容器；以及
[0683]
包含所述第一容器的第二容器，其中，所述第二容器确保具有约250nm～约800nm、约250nm～约450nm、约400nm～约800nm、约450nm～约650nm或约600nm～约720nm的波长的
光不透过。
[0684]
142.如实施方式141所述的包装系统，其中，所述第二容器确保光不透过，使得透光率百分数小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％或小于5％。
[0685]
143.如实施方式141或142所述的包装系统，其中，所述第二容器是绿色、蓝色、琥珀色、半透明、不透明、或用具有小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％或小于5％的透光率的材料覆盖。
[0686]
144.如实施方式141～143中任一项所述的包装系统，其中，所述第一结合性分子和第二容器独立地选自药瓶、管子、注射器、包、袋子和盒子。
[0687]
145.如实施方式141～144中任一项所述的包装系统，其中还包括包含所述第二容器的第三容器，其中，所述第三容器确保具有约250nm～约800nm、约250nm～约450nm、约400nm～约800nm、约450nm～约650nm或约600nm～约720nm的波长的光不透过。
[0688]
146.如实施方式145所述的包装系统，其中，所述第三容器确保光不透过，使得透光率百分数小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％或小于5％。
[0689]
147.如实施方式145或146所述的包装系统，其中，所述第三容器是绿色、蓝色、琥珀色、半透明、不透明、或用具有小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％或小于5％的透光率的材料覆盖。
[0690]
148.如实施方式145～147中任一项所述的包装系统，其中，所述第三容器选自药瓶、管子、注射器、包、袋子和盒子。
[0691]
149.一种药盒，其包括：
[0692]
实施方式137～140中任一项所述的容器或实施方式141～148中任一项所述的包装系统；
[0693]
能够覆盖能进行包含酞菁染料－靶向性分子偶联物的组合物的给药的装置的避光盖；以及
[0694]
任选的使用说明书。
[0695]
150.如实施方式149所述的药盒，其中，所述给药装置是静脉内输液包。
[0696]
151.如实施方式149或150所述的药盒，其中，所述避光盖确保具有约250nm～约800nm、约250nm～约450nm、约400nm～约800nm、约450nm～约650nm或约600nm～约720nm的波长的光不透过。
[0697]
152.如实施方式149～151中任一项所述的药盒，其中，所述避光盖确保光不透过，使得透光率百分数小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％或小于5％。
[0698]
153.如实施方式149～152中任一项所述的药盒，其中，所述避光盖是绿色、蓝色、琥珀色、半透明、不透明、或用具有小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％或小于5％的透光率的材料覆盖。
[0699]
154.包含酞菁染料偶联物的给药用组合物的制备方法，其包括：
[0700]
将实施方式137～140中任一项所述的一个或多个容器或者实施方式141～148中任一项所述的一个或多个包装系统打开；以及
[0701]
将所述一个或多个容器内存在的组合物转移至能进行所述组合物向对象的给药的装置中，其中，
[0702]
所述组合物所暴露的光仅具有约400nm～约650nm范围内的波长，或者
[0703]
所述组合物所暴露的光仅具有小于500勒克斯的强度。
[0704]
155.如实施方式154所述的方法，其中，所述组合物所暴露的光仅具有小于200勒克斯或小于100勒克斯的强度。
[0705]
156.如实施方式154或155所述的方法，其在生物安全柜、生物安全罩或无菌环境中实施。
[0706]
157.如实施方式154～156中任一项所述的方法，其中，所述一个或多个容器均包含治疗有效量的酞菁染料偶联物。
[0707]
158.如实施方式154～157中任一项所述的方法，其中，所述一个或多个容器包括至少约2、4、6、8、10、12、18或24个容器。
[0708]
159.如实施方式154～158中任一项所述的方法，其中：
[0709]
所述方法进行不超过1小时、不超过30分钟或不超过15分钟；或者
[0710]
在所述方法中，所述组合物在任何光下的总暴露量不超过500勒克斯小时、不超过250勒克斯小时、不超过100勒克斯小时、不超过50勒克斯小时或不超过25勒克斯小时。
[0711]
160.如实施方式154～159中任一项所述的方法，其中，所述给药装置是静脉内输液包。
[0712]
161.如实施方式154～160中任一项所述的方法，其中，所述给药装置包括能够覆盖该装置的避光盖。
[0713]
162.如实施方式161所述的方法，其中，所述避光盖确保具有约250nm～约800nm、约250nm～约450nm、约400nm～约800nm、约450nm～约650nm或约600nm～约720nm的波长的光不透过。
[0714]
163.如实施方式161或162所述的方法，其中，所述避光盖确保光不透过，使得透光率百分数小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％或小于5％。
[0715]
164.如实施方式154～163中任一项所述的方法，其中，所述避光盖是绿色、蓝色、琥珀色、半透明、不透明、或用具有小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％或小于5％的透光率的材料覆盖。
[0716]
165.一种避光装置，其包括通过实施方式154～164中任一项所述的方法制备的组合物。
[0717]
166.除去对象中的不希望的细胞或病原体的方法，其包括：
[0718]
(a)将包含来自实施方式165的避光装置的酞菁染料偶联物的组合物给予对象，其中，在给药步骤之前及给药步骤中，所述组合物不暴露在大于500勒克斯的强度的环境光下；以及
[0719]
(b)以660～740nm的波长、以至少1j cm-2
或1j/cm纤维长的剂量对所述不希望的细胞或病原体进行辐照，从而除去对象中的所述不希望的细胞。
[0720]
167.除去样品中的不希望的细胞或病原体的方法，其包括：
[0721]
(a)将包含来自实施方式165的避光装置的酞菁染料偶联物的组合物给予样品，其中，在给药步骤之前及给药步骤中，所述组合物不暴露在大于500勒克斯的强度的环境光下；以及
[0722]
(b)以660～740nm的波长、以至少1j cm-2
或1j/cm纤维长的剂量对所述不希望的细胞或病原体进行辐照，从而除去样品中的所述不希望的细胞。
[0723]
168.除去对象中的不希望的细胞或病原体的方法，其包括：
[0724]
a)给予对象治疗有效量的实施方式90～123和234～236中任一项所述的偶联物或稳定偶联物或实施方式124～136中任一项所述的组合物，其中，在给药步骤之前及给药步骤中，所述偶联物不暴露在大于500勒克斯的强度的环境光下；以及
[0725]
b)以660～740nm的波长、以至少1j cm-2
或1j/cm纤维长的剂量对所述不希望的细胞或病原体进行辐照，从而除去对象中的所述不希望的细胞。
[0726]
169.除去样品中的不希望的细胞或病原体的方法，其包括：
[0727]
a)给予样品治疗有效量的实施方式90～123和234～236中任一项所述的偶联物或稳定偶联物或实施方式124～136中任一项所述的组合物，其中，在给药步骤之前及给药步骤中，所述偶联物不暴露在大于500勒克斯的强度的环境光下；以及
[0728]
b)以660～740nm的波长、以至少1j cm-2
或1j/cm纤维长的剂量对所述不希望的细胞或病原体进行辐照，从而除去样品中的所述不希望的细胞。
[0729]
170.除去对象中的不希望的细胞或病原体的方法，其包括：
[0730]
a)给予对象治疗有效量的偶联物，该偶联物包含与能够与不希望的细胞或病原体结合的靶向性分子连接的irdye 700dx(ir700)，其中，在给药步骤之前及给药步骤中，所述偶联物不暴露在大于500勒克斯的强度的环境光下；以及
[0731]
b)以600～800nm的波长、以至少1j cm-2
或1j/cm纤维长的剂量对所述不希望的细胞或病原体进行辐照，从而除去对象中的所述不希望的细胞或病原体。
[0732]
171.除去样品中的不希望的细胞或病原体的方法，其包括：
[0733]
a)给予样品治疗有效量的偶联物，该偶联物包含与能够与不希望的细胞或病原体结合的靶向性分子连接的irdye 700dx(ir700)，其中，在给药步骤之前及给药步骤中，所述偶联物不暴露在大于500勒克斯的强度的环境光下；以及
[0734]
b)以600～800nm的波长、以至少1j cm-2
或1j/cm纤维长的剂量对所述不希望的细胞或病原体进行辐照，从而除去样品中的所述不希望的细胞或病原体。
[0735]
172.除去对象中的不希望的细胞或病原体的方法，其包括：
[0736]
a)给予对象治疗有效量的第一结合性分子，该第一结合性分子能够与不希望的细胞或病原体结合；
[0737]
b)给予对象偶联物分子，该偶联物分子包含与靶向性分子连接的irdye 700dx(ir700)，其中，所述靶向性分子是能够与所述第一结合性分子结合的第二结合性分子；以及
[0738]
c)以600～800nm的波长、以至少1j cm-2
或1j/cm纤维长的剂量对所述不希望的细胞或病原体进行辐照，从而除去对象中的所述不希望的细胞或病原体。
[0739]
173.如实施方式172所述的方法，其中，所述第一结合性分子在所述偶联物之前给予对象，或者所述第一结合性分子和偶联物同时给予对象。
[0740]
174.除去样品中的不希望的细胞或病原体的方法，其包括：
[0741]
a)给予样品治疗有效量的第一结合性分子，该第一结合性分子能够与不希望的细胞或病原体结合；
[0742]
b)给予样品偶联物分子，该偶联物分子包含与靶向性分子连接的irdye 700dx(ir700)，其中，所述靶向性分子是能够与所述第一结合性分子结合的第二结合性分子；以
及
[0743]
c)以600～800nm的波长、以至少1j cm-2
或1j/cm纤维长的剂量对所述不希望的细胞或病原体进行辐照，从而除去样品中的所述不希望的细胞或病原体。
[0744]
175.如实施方式167、169、171和174中任一项所述的方法，其中，所述样品是血液样品或组织样品。
[0745]
176.如实施方式167、169、171、174和175中任一项所述的方法，其中，所述方法在体外或离体条件下实施。
[0746]
177.如实施方式175所述的方法，其中，所述方法用体外装置实施。
[0747]
178.如实施方式172～177中任一项所述的方法，其中，所述第一结合性分子在所述偶联物之前给予样品，或者所述第一结合性分子和偶联物同时给予样品。
[0748]
179.如实施方式166～178中任一项所述的方法，其中，所述靶向性分子是第二抗体。
[0749]
180.如实施方式166～179中任一项所述的方法，其中，在所述偶联物的给药之前和之时，所述偶联物不暴露在大于500勒克斯的强度的环境光下。
[0750]
181.如实施方式166～180中任一项所述的方法，其中，所述细胞是干细胞、增殖性细胞、增生中的细胞、炎性细胞、负调节免疫细胞(任选地为t细胞)、被病原体感染的细胞、神经元、脂肪细胞或脂细胞。
[0751]
182.如实施方式166～181中任一项所述的方法，其中，所述细胞是癌细胞或肿瘤细胞。
[0752]
183.如实施方式166～182中任一项所述的方法，其中，所述细胞与疾病或病症的病因有关，或者导致或有助于疾病或病症的病因。
[0753]
184.如实施方式183中任一项所述的方法，其中，所述疾病或病症是肿瘤或癌症、感染、炎性疾病或病症、或者神经元性疾病或病症。
[0754]
185.如实施方式183或184所述的方法，其中：
[0755]
所述细胞是神经元，且所述疾病或病症是神经疾病，其任选地是疼痛；
[0756]
所述细胞是脂肪细胞或脂细胞，且所述疾病或病症涉及多余的脂肪；
[0757]
所述细胞是被病原体感染的细胞，且所述疾病或病症是感染；
[0758]
所述细胞是病原体，且所述疾病或病症是感染；
[0759]
所述细胞是炎性细胞，且所述疾病或病症是炎性疾病；
[0760]
所述细胞是免疫细胞，其任选地是调节性t细胞，且所述疾病或病症是肿瘤或癌症；或者
[0761]
所述细胞是肿瘤或癌细胞，且所述疾病或病症是肿瘤或癌症。
[0762]
186.如实施方式166～185中任一项所述的方法，其中，所述细胞存在于与疾病或病症有关的损害的微环境中，或者在增生中。
[0763]
187.如实施方式186所述的方法，其中，所述损害是肿瘤，且所述疾病或病症是肿瘤或癌症。
[0764]
188.如实施方式183～187中任一项所述的方法，其中，所述方法治疗所述疾病或病症。
[0765]
189.除去对象中的被病原体感染的细胞的方法，其包括：
[0766]
a)给予对象治疗有效量的包含与靶向性分子连接的irdye 700dx(ir700)的偶联物分子，其中，所述靶向性分子能够直接或间接地与被病原体感染的细胞结合；以及
[0767]
b)以600～800nm的波长、以至少1j cm-2
或1j/cm纤维长的剂量对所述被病原体感染的细胞进行辐照，从而除去对象中的所述被病原体感染的细胞。
[0768]
190.除去样品中的被病原体感染的细胞的方法，其包括：
[0769]
a)给予样品治疗有效量的包含与靶向性分子连接的irdye 700dx(ir700)的偶联物分子，其中，所述靶向性分子能够直接或间接地与被病原体感染的细胞结合；以及
[0770]
b)以600～800nm的波长、以至少1j cm-2
或1j/cm纤维长的剂量对所述被病原体感染的细胞进行辐照，从而除去样品中的所述被病原体感染的细胞。
[0771]
191.如实施方式190所述的方法，其中，所述样品是血液样品或组织样品。
[0772]
192.如实施方式190或191所述的方法，其中，所述方法在体外或离体条件下实施。
[0773]
193.如实施方式192所述的方法，其中，所述方法用体外装置实施。
[0774]
194.如实施方式189～192中任一项所述的方法，其中，所述病原体是病毒、细菌、真菌、生物膜或其它原核细胞系统。
[0775]
195.如实施方式189～194中任一项所述的方法，其中，在所述偶联物的给药之前和之时，所述偶联物不暴露在大于500勒克斯的强度的环境光下。
[0776]
196.治疗对象中的增生或肿瘤的方法，其包括：
[0777]
a)给予对象治疗有效量的实施方式90～123和234～236中任一项所述的偶联物或稳定偶联物或实施方式124～136中任一项所述的组合物，其中，在给药步骤之前及给药步骤中，所述偶联物不暴露在大于500勒克斯的强度的环境光下；以及
[0778]
b)以660～740nm的波长、以至少1j cm-2
或1j/cm纤维长的剂量对所述增生或所述肿瘤进行辐照，从而治疗对象中的肿瘤。
[0779]
197.治疗样品中的增生或肿瘤的方法，其包括：
[0780]
a)给予样品治疗有效量的实施方式90～123和234～236中任一项所述的偶联物或稳定偶联物或实施方式124～136中任一项所述的组合物，其中，在给药步骤之前及给药步骤中，所述偶联物不暴露在大于500勒克斯的强度的环境光下；以及
[0781]
b)以660～740nm的波长、以至少1j cm-2
或1j/cm纤维长的剂量对所述增生或所述肿瘤进行辐照，从而治疗样品中的肿瘤。
[0782]
198.治疗对象中的增生或肿瘤的方法，其包括：
[0783]
a)给予对象治疗有效量的含有与靶向性分子连接的irdye 700dx(ir700)的偶联物，该靶向性分子将所述偶联物靶向至肿瘤或增生，其中，在给药步骤之前及给药步骤中，所述偶联物不暴露在大于500勒克斯的强度的环境光下；以及
[0784]
b)以600～800nm的波长、以至少1j cm-2
或1j/cm纤维长的剂量对所述增生或肿瘤进行辐照，从而治疗对象中的肿瘤。
[0785]
199.治疗样品中的增生或肿瘤的方法，其包括：
[0786]
a)给予样品治疗有效量的含有与靶向性分子连接的irdye 700dx(ir700)的偶联物，该靶向性分子将所述偶联物靶向至肿瘤或增生，其中，在给药步骤之前及给药步骤中，所述偶联物不暴露在大于500勒克斯的强度的环境光下；以及
[0787]
b)以600～800nm的波长、以至少1j cm-2
或1j/cm纤维长的剂量对所述增生或肿瘤
进行辐照，从而治疗样品中的肿瘤。
[0788]
200.如实施方式197或199所述的方法，其中，所述样品是血液样品或组织样品。
[0789]
201.如实施方式197、199和200中任一项所述的方法，其中，所述方法在体外或离体条件下实施。
[0790]
202.如实施方式201所述的方法，其中，所述方法用体外装置实施。
[0791]
203.如实施方式196～202中任一项所述的方法，该方法用于治疗肿瘤，其中，所述偶联物的靶向性分子将所述偶联物靶向至肿瘤或肿瘤的微环境。
[0792]
204.如实施方式203所述的方法，其中，以600～800nm的波长、以至少1j cm-2
或1j/cm纤维长的剂量对所述肿瘤进行辐照，从而治疗肿瘤。
[0793]
205.如实施方式166～204中任一项所述的方法，其中，所述靶向性分子是抗体、抗原结合片段、蛋白质、糖蛋白、肽、多肽、病毒、病毒衣壳或病毒颗粒。
[0794]
206.如实施方式166～205中任一项所述的方法，其中，所述靶向性分子是抗体或抗体片段。
[0795]
207.如实施方式166～206中任一项所述的方法，其中，给药在荧光灯或led灯下且在不存在直接或间接的日光的条件下实施。
[0796]
208.如实施方式166～207中任一项所述的方法，其中，在给药步骤之前及给药步骤中，所述偶联物在小于500勒克斯的光下的任何暴露的时间少于20分钟、少于15分钟、少于10分钟或少于5分钟。
[0797]
209.如实施方式208所述的方法，其中，所述偶联物所暴露的任何光是具有不大于50勒克斯的强度的光。
[0798]
210.如实施方式196～209中任一项所述的方法，其中，所述肿瘤是癌症。
[0799]
211.如实施方式184、185、187和210中任一项所述的方法，其中，所述癌症是位于头颈、乳腺、肝脏、结肠、卵巢、前列腺、胰腺、脑、宫颈、骨、皮肤、眼、膀胱、胃、食道、腹膜或肺的癌症。
[0800]
212.如实施方式210或211所述的方法，其中，所述癌症是血液癌症。
[0801]
213.如实施方式196～212中任一项所述的方法，其中，所述偶联物靶向存在于肿瘤微环境中的细胞表面上表达的蛋白质。
[0802]
214.如实施方式213所述的方法，其中，所述细胞是肿瘤细胞、免疫细胞或癌症干细胞。
[0803]
215.如实施方式166～214中任一项所述的方法，其中，细胞表面上表达的蛋白质选自acthr、内皮细胞anxa-1、氨肽酶n、抗-il-6r、α-4-整联蛋白、α-5-β-3-整联蛋白、α-5-β-5-整联蛋白、甲胎蛋白(afp)、anpa、anpb、apa、apn、app、1ar、2ar、at1、b1、b2、bage1、bage2、b-细胞受体bb1、bb2、bb4、降钙素受体、癌抗原125(ca 125)、cck1、cck2、cd5、cd10、cd11a、cd13、cd14、cd19、cd20、cd22、cd25、cd30、cd33、cd38、cd45、cd52、cd56、cd68、cd90、cd133、cd7、cd15、cd34、cd44、cd206、cd271、cea(癌胚抗原)、cgrp、趋化因子受体、细胞表面膜联蛋白-1、细胞表面网蛋白-1、cripto-1、crlr、cxcr2、cxcr4、dcc、dll3、e2糖蛋白、egfr、egfrviii、emr1、内皮唾液酸蛋白、ep2、ep4、epcam、epha2、et受体、纤连蛋白、纤连蛋白ed-b、fgfr、卷曲受体(frizzled receptors)、gage1、gage2、gage3、gage4、gage5、gage6、glp-1受体、a族(视紫红质样)的g-蛋白偶联受体、b组(分泌素受体样)的g-蛋白偶联受体、c族(代
谢型谷氨酸盐受体样)的g-蛋白偶联受体、gd2、gp100、gp120、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、血凝素、硫酸肝素、her1、her2、her3、her4、hmfg、hpv 16/18和e6/e7抗原、htert、il-2r、il11-r、il-13r、itgam、激肽释放酶-9、lewis y、lh受体、lhrh-r、lpa1、mac-1、mage 1、mage 2、mage 3、mage 4、mart1、mc1r、间皮素、muc1、muc16、neu(细胞表面核仁素)、脑啡肽酶、神经菌毛素-1、神经菌毛素-2、ng2、nk1、nk2、nk3、nmb-r、notch-1、ny-eso-1、ot-r、突变型p53、p97黑色素瘤抗原、ntr2、ntr3、p32(p32/gc1q-r/habp1)、p75、pac1、par1、补缀(patched)(ptch)、pdgfr、pdfg受体、pdt、蛋白酶剪切胶原iv、蛋白水解酶3、抑制素、蛋白酪氨酸激酶7、psa、psma、嘌呤能p2x家族(如p2x1-5)、突变型ras、ramp1、ramp2、ramp3补缀、ret受体、丛蛋白、平滑(smoothened)、sst1、sst2a、sst2b、sst3、sst4、sst5、p物质、tems、t细胞cd3受体、tag72、tgfbr1、tgfbr2、tie-1、tie-2、trk-a、trk-b、trk-c、tr1、trpa、trpc、trpv、trpm、trpml、trpp(如trpv1-6、trpa1、trpc1-7、trpm1-8、trpp1-5、trpml1-3)、tsh受体、vegf受体(vegfr1或flt-1、vegfr2或flk-1/kdr、及vegf-3或flt-4)、电压门控离子通道、vpac1、vpac2、维尔姆斯瘤1、y1、y2、y4和y5。
[0804]
216.如实施方式166～215中任一项所述的方法，其中，细胞表面上表达的蛋白质选自her1/egfr、her2/erbb2、cd20、cd25(il-2rα受体)、cd33、cd52、cd133、cd206、cea、ceacam1、ceacam3、ceacam5、ceacam6、癌抗原125(ca125)、甲胎蛋白(afp)、lewis y、tag72、caprin-1、间皮素、pdgf受体、pd-1、pd-l1、ctla-4、il-2受体、血管内皮生长因子(vegf)、cd30、epcam、epha2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、gpa33、粘蛋白、caix、psma、叶酸盐结合蛋白、神经节苷脂(如gd2、gd3、gm1和gm2)、vegf受体(vegfr)、vegfr2、vegf-a、整联蛋白αvβ3、整联蛋白α5β1、erbb3、met、igf1r、epha3、trailr1、trailr2、rankl、fap、生腱蛋白、afp、bcr复合物、cd3、cd18、cd44、ctla-4、gp72、hla-dr 10β、hla-dr抗原、ige、muc-1、nuc242、pem抗原、金属蛋白酶、蝶素(ephrin)受体、蝶素配体、hgf受体、cxcr4、cxcr4、铃蟾肽受体、sk-1抗原、bcr-abl、ret、met、trkb、tie2、alk、ros、eml4-alk、ros1、brafv600e、src、c-kit、pdgfr、mtor、tsc1、tsc2、btk、kit、brca、cdk 4/6、jak1、jak2、braf、flt-3、mek1、mek2和smo。
[0805]
217.如实施方式166～216中任一项所述的方法，其中，所述偶联物靶向肿瘤中表达的蛋白质。
[0806]
218.如实施方式166～217中任一项所述的方法，其中，以约600nm～约850nm的波长对所述细胞、增生或肿瘤进行辐照。
[0807]
219.如实施方式166～218中任一项所述的方法，其中，以690
±
50nm或690
±
20nm的波长对所述细胞、增生或肿瘤进行辐照。
[0808]
220.如实施方式166～219中任一项所述的方法，其中，以约2j cm-2
～约400j cm-2
或约2j/cm纤维长～约500j/cm纤维长的剂量对所述细胞、增生或肿瘤进行辐照。
[0809]
221.如实施方式166～220中任一项所述的方法，其中：
[0810]
以至少约2j cm-2
、5j cm-2
、10j cm-2
、25j cm-2
、50j cm-2
、75j cm-2
、100j cm-2
、150j cm-2
、200j cm-2
、300j cm-2
、400j cm-2
或500j cm-2
的剂量对所述细胞、增生或肿瘤进行辐照；或者
[0811]
以至少约2j/cm纤维长、5j/cm纤维长、10j/cm纤维长、25j/cm纤维长、50j/cm纤维长、75j/cm纤维长、100j/cm纤维长、150j/cm纤维长、200j/cm纤维长、250j/cm纤维长、300j/cm纤维长、400j/cm纤维长或500j/cm纤维长的剂量对所述细胞、增生或肿瘤进行辐照。
[0812]
222.如实施方式184～188和196～221中任一项所述的方法，其中，所述疾病或病症是肿瘤，且所述肿瘤是浅表肿瘤。
[0813]
223.如实施方式222所述的方法，其中，以至少约10j/cm2、25j/cm2、50j/cm2、150j/cm2或250j/cm2的剂量对所述肿瘤进行辐照。
[0814]
224.如实施方式184～188和196～221中任一项所述的方法，其中，所述疾病或病症是肿瘤，且所述肿瘤是间质肿瘤。
[0815]
225.如实施方式224所述的方法，其中，以至少约50j/cm纤维长、100j/cm纤维长、200j/cm纤维长或300j/cm纤维长的剂量对所述肿瘤进行辐照。
[0816]
226.如实施方式166～225中任一项所述的方法，其中，在所述偶联物给药后约12小时、24小时、36小时、72小时或96小时内对所述细胞、增生或肿瘤进行辐照。
[0817]
227.如实施方式166～226中任一项所述的方法，其中，所述偶联物以约0.5mg/kg～约100mg/kg或20mg/m2～约4000mg/m2的量给药。
[0818]
228.如实施方式166～227中任一项所述的方法，其中：
[0819]
所述偶联物以至少约或约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg、8.0mg/kg、16.0mg/kg、32.0mg/kg或64mg/kg的量给药；或者
[0820]
所述偶联物以至少约或约20mg/m2、40mg/m2、160mg/m2、320mg/m2、640mg/m2、1280mg/m2或2560mg/m2的量给药。
[0821]
229.如实施方式166～228中任一项所述的方法，其中，在所述偶联物给药前进行所述靶向性分子的给药。
[0822]
230.如实施方式166～229中任一项所述的方法，其中，所述靶向性分子在所述偶联物给药前最多96小时给药。
[0823]
231.如实施方式229或230所述的方法，其中，所述靶向性分子以约10mg/m2～约500mg/m2范围内的剂量给药。
[0824]
232.如实施方式166～231中任一项所述的方法，其中，所述靶向性分子是抗体或抗原结合片段。
[0825]
233.如实施方式232所述的方法，其中，所述抗体是西妥昔单抗。
[0826]
234.一种偶联物，其含有酞菁染料和靶向性分子，其中，所述靶向性分子选自组织特异性归巢肽、rgd多肽、irgd多肽、lyp-1多肽、cripto-1结合多肽、促生长素抑制素受体结合多肽、抑制素结合多肽、ngr多肽、ingr多肽、由聚阳离子细胞穿透肽(cpp)通过可切割接头与中和性聚阴离子连接而构成的可激活细胞穿透肽(acpp)、或选自ado-曲妥珠单抗美坦新、阿法替尼、阿西替尼、博舒替尼、卡博替尼、色瑞替尼、克唑替尼、达拉非尼、达沙替尼、依维莫司、依鲁替尼、伊马替尼、乐伐替尼、尼洛替尼、奥拉帕尼、帕博西尼、帕唑帕尼、雷莫芦单抗、瑞格非尼、鲁索替尼、索拉非尼、舒尼替尼、坦西莫司、曲美替尼、凡德他尼、维罗非尼、维莫德吉、伊匹单抗、纳武单抗、派姆单抗、mpdl3280a、皮地利珠单抗(pidilizumab)(ct-011)、amp-224、msb001078c或medi4736的抗体、或其抗原结合片段。
[0827]
235.如实施方式234所述的偶联物，其中，所述归巢肽具有seq id no：1～52中任一项所列的序列。
[0828]
236.如实施方式234或235所述的偶联物，其中，所述染料是ir700。
[0829]
v.实施例
irdye 700dx的单体形式进行定量。分析结果示于下表1，证明随着曝光时间的增加，样品中存在的聚集体的量显著增加。曝光前和曝光后24小时的透明药瓶中的西妥昔单抗-irdye 700dx样品的示例性的hplc-sec色谱示于图1a和1b。
[0845][0846]
在其它实施例中，将磷酸盐缓冲盐水(pbs，ph＝7.1)中的浓度为5.5mg/ml的西妥昔单抗-irdye 700dx的2ml样品置于两个透明药瓶中。将其中一个药瓶暴露在500勒克斯的强度的白色荧光下，总时间为15和30分钟。将透明药瓶中的另一份2ml样品暴露在绿色led光(ecosmart gp19，家得宝公司(homedepot)，佐治亚州亚特兰大)下，该绿色led光对样品的强度用digi-sense测光仪测得为500勒克斯。曝光后，在15和30分钟的各时间点，从各药瓶中分别取200μl的样品用于hplc-sec分析。下表2中显示受试的各200μl样品中出现的聚集体的相对量的hplc-sec定量。
[0847][0848]
表2中的数据证明，在两个时间点，与在相同强度的绿光下暴露相同时间的样品相比，暴露在白光下的西妥昔单抗-irdye 700dx样品均具有明显更大量的聚集体。
[0849]
实施例3：用于制备偶联药物物质的药品生产质量管理规范(gmp)方法
[0850]
本实施例描述基于药品生产质量管理规范(gmp)制备偶联药物物质的方法，包括最终中间产物的制备和最终中间产物的偶联。为了保证最终产品的药品质量满足要求，在制造过程中采取额外的预防措施来限制染料和偶联物在光下的暴露，因为染料有光敏性。其包括在生产设备中使用低水平的具有425～575nm的波长和小于200勒克斯的强度的绿光。此外，该方法也使用半透明的坛子来进行偶联，用铝箔来包裹偶联器，并且尽可能快地实施有潜在的曝光的步骤。
[0851]
本实施例描述用于制备与西妥昔单抗偶联的irdye 700dx nhs酯以制造西妥昔单抗-irdye 700dx偶联物的方法。可以实施所提供的方法来制备任何药物物质，例如含有与大分子偶联的染料的药物物质，下文中的描述仅为了示例而提供。
[0852]
a.缓冲液的制备
[0853]
使用高纯水(hpw)或注射用水(wfi)来制备缓冲液，并且在储存前通过0.22μm滤器在常温下进行过滤。表3～5显示所制备的缓冲液的工艺流程中的控制和试验，该缓冲液分
别是：偶联缓冲液(100mm磷酸钠，ph 8.65)，猝灭缓冲液(1.0m甘氨酸，ph 9)和最终磷酸盐缓冲盐水(pbs)配制缓冲液(5.60mm na2hpo4，1.058kh2po4，154mm nacl，ph 7.1)。
[0854][0855][0856][0857]
b.染料和西妥昔单抗中间体的制备
[0858]
1.西妥昔单抗的制备
[0859]
在偶联前，将西妥昔单抗药瓶(美国myoderm公司，宾夕法尼亚州诺里斯敦)和无菌异丙醇一起喷雾，并置于层流通风橱中。使用总共423个药瓶来制备药物物质。用电子开瓶器将药瓶打开，用高压蒸气灭菌镊子除去塞子，并将内容物倒入无菌2l petg瓶中。装满后将瓶子盖上。接着，通过0.22μm滤器对西妥昔单抗进行过滤，并合并至50l hyqtainer中。合并的经过滤西妥昔单抗储存于2～8℃。
[0860]
接着，通过超滤/渗滤(uf/df)实施浓缩和缓冲液交换步骤。在使用前进行uf/df装置的清洁。将储存溶液排出，并用至少20l的hpw进行膜冲洗。单元用0.1m naoh冲洗30～40分钟，然后用hpw冲洗。确认清洗液的ph。将系统用100mm磷酸钠、ph 8.65缓冲液平衡。在使用前确认渗出物和滞留物流出物ph和电导率。也实施内毒素试验，系统在内毒素试验的48小时内使用。
[0861]
在uf/df操作前，通过在孵育器内在25℃下放置120～150分钟，将合并的经过滤西妥昔单抗温热。首先将材料浓缩至5mg/ml的目标，接着渗滤至100mm磷酸钠、ph 8.65缓冲液中。实施渗滤直至达到渗出物ph和电导率目标。用缓冲液冲洗系统，将液流加入渗滤滞留物中。在操作过程中监控并记录uf/df系统压力，示于表6。
[0862]
测定经渗滤的西妥昔单抗产品浓度，接着用100mm磷酸钠、ph 8.65缓冲液稀释至目标浓度2mg/ml(1.8～2.4mg/ml)。将产品通过0.22μm滤器进行无菌过滤，并拆分至两个高压蒸气灭菌产品专用的包含无菌搅拌棒的40l坛中，并预加工以便直接进行偶联操作。测定各坛中的西妥昔单抗的重量。
[0863][0864][0865]
2.染料的制备
[0866]
在偶联前，通过以10mg/ml的浓度溶解于无水dmso来制备irdye700dx nhs酯(染料；目录号929-70011；li-cor，内布拉斯加州林肯市)。步骤在绿光下实施(如波长为425～575nm且强度小于200勒克斯)，以保护染料不受被染料强烈吸收的波长的光的影响。
[0867]
c.偶联
[0868]
偶联和猝灭步骤在包含经渗滤的西妥昔单抗的2x 40l坛(包在铝箔中以避光)中
实施。步骤在室温下在绿光下实施(如波长为425～575nm且强度小于200勒克斯)，以保护偶联物不会光降解。
[0869]
为了偶联反应，计算dmso中的irdye 700dx nhs酯的合适的量(基于各坛中的西妥昔单抗的重量，一般为80～120g)，以达到4:1(irdye 700dx nhs酯:西妥昔单抗)的最终摩尔比。通过工艺进程研究可以确认，该比例再加上目标偶联孵育时间会在每一个西妥昔单抗分子中引入2～3个染料残基。将计算出的量的irdye 700dx nhs酯加入含有西妥昔单抗的坛中，在搅拌板上混合10～15分钟。接着，通过将坛子置于25℃孵育器中，使偶联反应进行120分钟。
[0870]
通过以4.2mm的终浓度加入1m甘氨酸并混合10～12分钟来使偶联反应猝灭。将坛子在25℃孵育器内再孵育20～25分钟。表7显示偶联和猝灭步骤的工艺流程中的控制和试验。
[0871][0872]
实施最终uf/df步骤，以将偶联产品交换至最终pbs配制缓冲液中。在使用前进行uf/df系统的清洁。清洁该单元，将部件在浸泡在1.0m naoh中，然后用hpw淋洗。将系统用pbs、ph 7.1平衡，直至渗出物落在规格内。测试渗出物和滞留物的内毒素。
[0873]
将猝灭的偶联物转移至uf/df系统，首先浓缩至8-10l，然后用8～12倍渗滤体积的pbs进行渗滤，以将产品交换至最终配制缓冲液中。确认ph和电导率。用缓冲液冲洗系统，将液流加入最终产品中。根据需要测定蛋白质浓度，进一步用pbs进行稀释，以达到最终目标产品浓度2.0mg/ml(1.8～2.1mg/ml)。
[0874]
通过0.22μm滤器实施最终过滤，将西妥昔单抗-irdye 700dx偶联物药物物质储存在2～8℃下的暗处的50l hyqtainer中，用铝箔覆盖以保护内容物不受光的影响。步骤在室温下在绿光下实施，以保护西妥昔单抗-irdye700dx偶联物。将西妥昔单抗-irdye 700dx偶联物药物物质预加工以便直接进行制造后4周内的药物产品稳定性。在一些情况下，在药物物质制备后约1周内将表格药物产品装瓶。
[0875]
表8显示最终uf/df、过滤和储存的工艺流程中的控制和试验。在一些情况下，需要稀释。
[0876]
[0877][0878]
制备偶联材料后，将样品供至sec-hplc，以测定浓度、染料抗体比(dar)、相同性和纯度。也实施了针对外观、ph、生物负载和内毒素水平的其它试验。表9显示针对示例性批料产品的这些试验的结果，参照药物物质的通用验收标准。
[0879][0880]
实施例4：药物产品的完成和包装
[0881]
制备最终西妥昔单抗-irdye 700dx偶联物药物产品，并用包括半自动无菌填充至无菌去热原的琥珀色玻璃药瓶中的步骤的方法进行包装。将药瓶塞上塞子，密封，然后进行检查。在所有的产品暴露操作中采取预防措施来最大程度减少在光下的暴露，包括在无菌过滤、填充操作和检查过程中使用低强度绿光(如波长为425～575nm且强度小于200勒克斯)。除了在所有的要求一些曝光的步骤中使用低强度绿光外，在所有其它时间用不透明的材料或容器覆盖批量产品和装瓶产品。在整个无菌过滤和填充过程中，对房间、设备和人员实施环境监控。
[0882]
在填充前，适当地对药瓶、塞子和密封件进行清洁和灭菌。玻璃药瓶用高纯水(hpw)和注射用水(wfi)清洁。接着，目测检查药瓶，在进一步制备前将有缺陷的药瓶去除。将药瓶置于架子上，覆盖，然后去热原。密封件用hpw/wfi清洗。药瓶和密封件均在使用前灭菌(高压蒸气灭菌)。塞子是购买的即用品(经清洁和灭菌)。
[0883]
使用0.22μm无菌滤器将西妥昔单抗-irdye 700dx偶联物药物产品无菌过滤，在过滤步骤后对滤器进行完整性试验。接着，将无菌滤液称重以确定要填充的药瓶的大致数量，并在填充前将其在2～8℃下储存过夜，避光。
[0884]
在填充操作前，测试压紧钳。将十个空药瓶塞上塞子并盖紧，并确认压力(20～40psi)。测定五个药瓶的空瓶重量，以确定平均空瓶重量。使用该结果来确定填充好的药瓶的重量范围，假定填充51
±
1ml，西妥昔单抗-irdye 700dx偶联物本体溶液的密度为1g/ml。在填充开始前对三个药瓶进行填充检查，以保证填充好的药瓶重量落在规格内。使用蠕动泵和填充针组件，将经无菌过滤的西妥昔单抗-irdye 700dx偶联物填充至药瓶中。将药瓶塞上塞子，并转移以进行密封和压紧。在填充过程中，针对每个托盘，对包含溶液、塞子和顶封的填充好的药瓶进行药瓶重量的检查，每个托盘检查5个药瓶，每个托盘留取最多30个药瓶。基于填充评价结果的中位数，将填充持续时间设为≤8小时49分钟。将填充好的药瓶置于容器中以保护它们不受光的影响，并储存在2～8℃下。
[0885]
对一个批次中的所有填充好的药瓶进行填充过量、未填充满、缺陷密封及其它缺陷的目测检查，并将所有有缺陷的药瓶从该批次中移除。在贴标签操作前，将药瓶储存在5
±
3℃下，避光。
[0886]
在使用绿光的避光条件下进行药瓶的贴标签。药瓶在环境室温下贴标签，注意避免过度暴露在常温下。贴标签后，将药瓶储存在不透明的箱子中，并恢复至5
±
3℃进行储存。进行第二次100％目测检查，并将所有有缺陷的药瓶去除。在最终的第二包装操作前，将药瓶恢复至5
±
3℃进行储存，避光。
[0887]
第二/第三包装通过将一个单元的药瓶置于一个铝袋内来进行。该袋子提供100％的避光。接着，将包含药瓶的袋子置于纸板箱中，以进行再一次的避光性测定。在分配和临床应用前，将储存在其第二包装内的药瓶保持在5
±
3℃。
[0888]
制备偶联材料后，将样品供至sec-hplc，以测定浓度、染料抗体比(dar)、相同性和纯度。也实施了针对外观、ph、生物负载和内毒素水平的其它试验。表9显示针对示例性批料产品的这些试验的结果，参照药物物质的通用验收标准。
[0889]
制备药物产品后，将样品供至sec-hplc，以测定浓度、染料抗体比(dar)、相同性和纯度。也通过sds-page实施了针对外观、ph、填充体积、无菌性、内毒素水平、颗粒物和纯度的其它试验。表10显示基于这些试验的针对药物产品的通用验收标准。
[0890][0891][0892]
实施例5：使用西妥昔单抗-irdye 700dx偶联物的治疗方法
[0893]
本实施例描述用于通过静脉内给予对象西妥昔单抗-irdye 700dx偶联物来治疗头颈癌的治疗方法，该偶联物例如实施例3所述制备。在光受控的条件下，给予对象160mg/m2的西妥昔单抗-irdye 700dx偶联物，然后用近红外光辐照以诱导光免疫疗法。在一些情况下，给予对象750mg/m2～1250mg/m2范围内的剂量的西妥昔单抗-irdye 700dx偶联物。
[0894]
静脉内(iv)输液包的制备
[0895]
在西妥昔单抗-irdye 700dx偶联物输液前，不将该偶联物暴露在直接或间接的阳光下。使用西妥昔单抗-irdye 700dx偶联物的操作在荧光灯下的房间内进行。不使用钨灯。实现了确保不暴露在环境光下。
[0896]
由含有50ml的2mg/ml西妥昔单抗-irdye 700dx偶联物溶液的药瓶来制备包含偶联物的静脉内(iv)注射包。将各含有偶联物的药瓶的包装打开，将该药瓶的内容物置于无菌iv包内。反复进行打开各单独的药瓶和将内容物置于iv包内的步骤，直至达到所需的输液用偶联物剂量。将各药瓶分别打开，置于iv包内，以减少药物产品在环境室内光下的暴
露。该步骤在少于15分钟内进行。始终用不透明的套筒覆盖iv包，以保护偶联物不曝光。制备后，将iv包储存在2～8℃下。
[0897]
给药
[0898]
在第1天，用2小时的时间通过iv输液将偶联物给予对象。输液过程中，治疗室内的灯光是小于200勒克斯的荧光。房间内的所有窗户都用遮蔽物盖住。给药过程中用不透明的套筒覆盖iv包，以保护偶联物不曝光。所有曝光均限制在少于5分钟。
[0899]
为了诱导光免疫疗法，在偶联物给药后24小时
±
2小时(第2天)进行一次具有690nm的波长的光的光照。
[0900]
对象在第4天回来随访，所有经治疗的肿瘤均出现坏死。对象未表现出副作用，并且未称有任何疼痛。未检测到皮肤光敏性。
[0901]
任选地，在偶联物给药前，用100mg的对对象进行预治疗，其通过30分钟的时间iv输液给药。输液过程中，评估对象对于的可能的输液反应。在100mg的输液后、临西妥昔单抗-irdye 700dx偶联物输液前，用50mg的抗组胺药benadryl(苯海拉明)和10mg的类固醇decadron(地塞米松)通过iv给药对对象进行预治疗，以限制对于西妥昔单抗-irdye 700dx偶联物输液的超敏反应的风险。
[0902]
实施例6：药物产品的ph稳定性
[0903]
为了评价ph、浓度和/或缓冲液配方对偶联物的长期稳定性的影响，以ph 5.5或ph 7.1制备了一系列的四种缓冲液配方，其中以两种浓度——2mg/ml和5mg/ml含有西妥昔单抗-irdye 700dx偶联物，总共为八种缓冲液配方。制备的八种缓冲液配方如下所述：
[0904]
bf#1：[2mg/ml偶联物]hyclone磷酸盐缓冲盐水(1x)，6.7mm po4(ph 7.0～7.2)不含钙、镁(hyclone目录号sh30256)。
[0905]
bf#2：[2mg/ml偶联物]10mm柠檬酸钠，100mm甘氨酸，100mm nacl，0.01％tween 80，ph 5.5
±
0.1。
[0906]
bf#3：[2mg/ml偶联物]20mm柠檬酸钠，120mm氯化钠，2mm edta，0.01％tween 80，ph 5.5
±
0.1。
[0907]
bf#4：[2mg/ml偶联物]20mm柠檬酸钠，4％甘露糖醇，2mm edta，0.01％tween 80，ph 5.5
±
0.1。
[0908]
bf#5：[5mg/ml偶联物]hyclone磷酸盐缓冲盐水(1x)，6.7mm po4(ph 7.0～7.2)不含钙、镁(hyclone目录号sh30256)。
[0909]
bf#6：[5mg/ml偶联物]10mm柠檬酸钠，100mm甘氨酸，100mm nacl，0.01％tween 80，ph 5.5
±
0.1。
[0910]
bf#7：[5mg/ml偶联物]20mm柠檬酸钠，120mm氯化钠，2mm edta，0.01％tween 80，ph 5.5
±
0.1。
[0911]
bf#8：[5mg/ml偶联物]20mm柠檬酸钠，4％甘露糖醇，2mm edta，0.01％tween 80，ph 5.5
±
0.1。
[0912]
本实施例中，如下所述采用诱导强制降解的条件来进行bf#5～bf#8的稳定性。将样品体积分别为750μl的4种配方bf#5～8置于2ml螺旋盖聚丙烯药瓶中，并用铝箔覆盖以保护样品不受光的影响。将四支管子置于45℃水浴中，孵育16小时。接着，将药瓶转移至冰箱，在2～8℃下储存1周时间。将样品从冰箱移出，以5,000x g离心5分钟。通过管子的检查，观
察到在ph5.5缓冲体系中配制的西妥昔单抗-irdye 700dx偶联物的3种样品(bf#6、bf#7和bf#8)在各自的管子底部均具有大量的蓝色沉淀物。但是，在pbs中以ph＝7.1配制的bf#5样品中未见任何肉眼可见的沉淀物。
[0913]
从4种样品分别获得上清液溶液的样品，进行hplc-sec分析以测定各样品中残留的西妥昔单抗-irdye 700dx偶联物的单体形式的浓度。该分析的结果和在投入到强制降解的研究条件之前针对各样品测定的初始浓度一起示于下表11。
[0914][0915]
表11中的数据显示，在ph 5.5缓冲体系中配制的西妥昔单抗-irdye700dx偶联物的所有样品(bf#6、bf#7和bf#8)均显示出偶联物产品的单体形式的浓度的显著降低(20％或更多)。与这些结果相反，bf#5(ph＝7.1)样品显示出很小的浓度变化。这些结果表明，西妥昔单抗-irdye 700dx偶联物药物产品可能在将产品在2～8℃的储存条件下长期保存(如多于6个月)时在ph＝5.5缓冲体系中也不太稳定
[0916]
实施例7：ph＝5.5缓冲体系和ph＝7.1pbs缓冲体系中的西妥昔单抗-irdye 700dx偶联物的长期储存稳定性的比较
[0917]
以两种浓度——2mg/ml和5mg/ml含有偶联物的上述4种缓冲液配方中的西妥昔单抗-irdye 700dx偶联物的样品(bf#1～8)在2～8℃下在15ml聚丙烯管中避光储存12个月。在2～8℃下储存12个月后，目测检查样品中的沉淀物的形成。通过该检查，观察到所有的ph＝5.5的样品(bf#2、bf#3、bf#4、bf#6、bf#7和bf#8)均含有大量的不溶性蓝色物质粘在它们的储存管的底部和侧部。相反，pbs ph＝7.1的缓冲体系(bf#1、bf#5)中的两个样品未见不溶性物质。该发现表示，西妥昔单抗-irdye 700dx偶联物不稳定，并且即使在2～8℃且避光的条件下，在ph《6的缓冲体系中长期储存后也会沉淀相比之下，在ph》6.0、例如约ph 7.1的缓冲液中配制的西妥昔单抗-irdye 700dx偶联物即使在在2～8℃下长期储存最多1年后，也能实现药物产品的稳定。
[0918]
实施例8：不同的抗体:irdye700dx偶联物的细胞杀伤活性和组成的评价
[0919]
进行研究来评价抗体-irdye 700dx偶联物在不同波长的光下的预暴露对可溶性聚集体形成的影响是否不同。将两种不同的抗体——小鼠抗人抗pd-l1(目录号329728，白乐津公司(biolegend)，加利福尼亚州圣迭戈市)和抗-egfr(西妥昔单抗；美国myoderm公司，宾夕法尼亚州诺里斯敦)用irdye 700dx标记，并进行测定来评价在不同波长的光下的预暴露是否影响可溶性聚集体形成。
[0920]
a.抗体偶联
[0921]
两种抗体均采用相同方法与irdye 700dx偶联。对于下述的所有偶联物而言，用于偶联抗体的通用方案与实施例1中描述的西妥昔单抗-irdye700dx的大规模偶联的方案类似。对于使用3mg或更少的蛋白质的小规模的反应体积，对方案进行修改。
[0922]
首先用30,000道尔顿分子量截止离心滤器将抗体溶液(抗-pd-l1抗体或抗-egfr抗体)交换至ph 7的磷酸盐缓冲盐水中，接着通过加入ph＝9的磷酸盐缓冲液将抗体溶液的ph调节至8.5的ph。将冷冻固体分装的irdye 700dx nhs酯(目录号929-70011；li-cor，内布拉斯加州林肯市)在室温下融化，接着用dmso溶解以达到10mg/ml的浓度。在黑暗环境下，接着将溶解的irdye 700dx nhs酯以4(irdye 700dx nhs酯)比1(抗体)的摩尔比加入抗体溶液中。偶联反应在25℃下避光进行2小时。以10mm的终浓度用15分钟的时间加入甘氨酸(ph 8.2)以使反应猝灭。接着，用30,000道尔顿分子量截止离心滤器将抗体偶联物溶液交换至24ml的ph 7的pbs中，以除去游离染料、甘氨酸和甘氨酸-irdye 700dx，并将溶液的ph调回至ph 7。用尺寸排阻色谱来分析抗体偶联物，评价抗体-irdye 700dx浓度、单体纯度、可溶性聚集体百分数和染料抗体比(dar)。
[0923]
b.光预暴露对irdye 700dx偶联物的组成的影响
[0924]
在四种不同条件下，用至少30μl的偶联物，以850μg/ml的抗体偶联物浓度来测试抗体-irdye 700dx偶联物的可溶性聚集体形成。四种处理条件如下所述：(1)在4℃下避光储存的抗体-irdye 700dx偶联物(“4℃”对照)；(2)在卤素灯(目录号pl-800，dj公司(dolan-jenner)，马萨诸塞州巴克斯柏路)下以2500勒克斯暴露24小时的、置于透明玻璃hplc管中的抗体-irdye 700dx偶联物(“白光”)；(3)在卤素灯下以2500勒克斯暴露24小时的、置于包在铝箔中以避免曝光的透明玻璃hplc管中的抗体-irdye 700dx偶联物(“无光”，用作聚集体形成中的热量加热效应的对照)；以及(4)置于透明玻璃hplc管中并在绿色led灯(目录号green-ecs gp19 ecosmart)下以2500勒克斯暴露24小时的抗体-irdye 700dx偶联物(“绿光”)。在各处理条件下24小时后，通过尺寸排阻色谱评价单体纯度和可溶性聚集体形成。
[0925]
抗-pd-l1-irdye 700dx偶联物的结果示于表12。如表所示，储存在4℃下的抗-pd-l1-irdye 700dx偶联物(dar～3)显示出低可溶性聚集体形成(《1.5％)和高单体纯度(》96％)，通过280nm吸收和690nm吸收测得。抗-pd-l1-irdye 700dx偶联物在2500勒克斯的来自卤素灯的白光下的暴露导致可溶性聚集体形成的显著增加(～30％)和单体纯度的相应降低(～65％)，通过280nm吸收和690nm吸收测得。暴露在来自卤素灯的2500勒克斯白光的热量加热效应下、但用铝箔避免光照射的抗-pd-l1-irdye 700dx与4℃的对照样品相比，未诱导出任何可溶性聚集体形成的增加。抗-pd-l1-irdye700dx偶联物在来自绿色led灯的光下的暴露导致可溶性聚集体形成的极少的增加(～5％)，与暴露在白光下的抗-pd-l1-irdye 700dx相比可溶性聚集体形成的量明显更少。
[0926][0927]
西妥昔单抗-irdye 700dx偶联物的结果示于表13。储存在4℃下的西妥昔单抗-irdye 700dx偶联物(dar～3)未发生任何可检测的可溶性聚集体形成(～0％)且具有高单体纯度(～100％)，通过280nm吸收和690nm吸收测得。西妥昔单抗-irdye 700dx偶联物在2500勒克斯的来自卤素灯的白光下的暴露导致可溶性聚集体形成的显著增加(～40％)和单体纯度的相应降低(～55％)，通过280nm吸收和690nm吸收测得。暴露在来自卤素灯的2500勒克斯白光的热量加热效应下、但用铝箔避免光照射的西妥昔单抗-irdye700dx与4℃的对照样品相比，未诱导出任何可溶性聚集体形成的增加。西妥昔单抗-irdye 700dx偶联物在来自绿色led灯的光下的暴露导致可溶性聚集体形成的极少的增加(～4％)，与暴露在白光下的西妥昔单抗-irdye700dx相比可溶性聚集体形成的量明显更少。
[0928][0929]
实施例9：在白色荧光和绿色led灯下的预暴露持续时间以及其对西妥昔单抗-irdye 700dx可溶性聚集体形成和pit效价的影响
[0930]
进行以下研究来评价西妥昔单抗-irdye 700dx偶联物在不同波长的光下的预暴露以及暴露的不同持续时间对可溶性聚集体形成以及药理学活性的影响是否不同。
[0931]
如实施例1所述偶联西妥昔单抗-irdye 700dx。对以下14种不同条件进行评价：将样品在25℃下在500勒克斯的白色荧光灯下以不同的持续时间、即24小时、12小时、6小时、3小时、1.5小时和45分钟曝光；将样品在25℃下在500勒克斯的绿色led灯(目录号green-ecs gp19 ecosmart)下以不同的持续时间、即24小时、12小时、6小时、3小时、1.5小时和45分钟曝光；将样品在25℃下暴露在无光条件下；以及将样品在4℃下暴露在无光条件下。24小时、12小时、6小时、3小时、1.5小时、45分钟的曝光的持续时间分别对应于12,000勒克斯小时、6,000勒克斯小时、3,000勒克斯小时、1,500勒克斯小时、750勒克斯小时或375勒克斯小时。针对每一种条件，将30μl的偶联物置于透明hplc药瓶中，每种样品的抗体偶联物浓度为2mg/ml，并且将样品暴露在各种光照条件下。
[0932]
通过监控可溶性聚集体形成和pit杀伤活性来评价在白光或绿光下暴露不同的持续时间后的西妥昔单抗-irdye 700dx偶联物的稳定性。
[0933]
1.聚集体形成
[0934]
用hplc尺寸排阻色谱来分析西妥昔单抗-irdye 700dx，评价单体纯度和可溶性聚集体形成。作为西妥昔单抗-irdye 700dx暴露在白光、绿光或无光下的勒克斯小时数的函数，测定可溶性聚集体形成百分数。
[0935]
如图2a所示，西妥昔单抗-irdye 700dx在500勒克斯的白色荧光下的暴露持续时间对于可溶性聚集体的形成有直接影响。西妥昔单抗-irdye700dx在白色荧光下的暴露导
致可溶性聚集体形成的迅速增加，即使仅在白光下暴露375勒克斯小时(500勒克斯下45分钟)后，也可见大于5.0％的可溶性聚集体形成，且该可溶性聚集体形成随着在白色荧光灯下暴露的持续时间的增加而增加。暴露在绿光下的西妥昔单抗-irdye 700dx中可溶性聚集体形成仍略有增加，只是速度比暴露在白光下时慢很多；即使在绿光下暴露12,000勒克斯小时(500勒克斯下24小时)后，聚集体形成的百分数也不大于5.0％。该结果显示，与绿光相比，随着暴露在白光下的时间的增加，西妥昔单抗-irdye 700dx可溶性聚集体的形成更剧烈。避免任何曝光时，在4℃或25℃下孵育后，在样品中均可见小于1％的可溶性聚集体形成。
[0936]
2.pit杀伤
[0937]
为了评价预暴露在不同的光照条件下的西妥昔单抗-irdye 700dx的pit杀伤活性，将bxpc3细胞(#crl-1687，atcc，弗吉尼亚州马纳萨斯)在4℃下在存在或不存在1微克/毫升(μg/ml)西妥昔单抗-irdye 700dx的条件下在补充有10％fbs和1％青霉素/链霉素的rpmi-1640培养基(完全培养基)中孵育1小时，接着用完全培养基清洗一次，以除去未结合的西妥昔单抗-irdye 700dx。接着，用690nm激光以32j/cm2的光剂量照射细胞，或者将细胞避光(0j/cm2)。
[0938]
用celltox green(目录号g8731，普洛麦格公司(promega)，威斯康星州麦迪逊)荧光染色来测定不同治疗方案对细胞死亡的效果。celltox green是非穿透性荧光染料，在与dna结合后发出更强的荧光。所以，只有具有受损的质膜的细胞才会显示出强烈的celltox green染色。光处理后，将所有细胞在用补充有10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的rpmi-1640(完全培养基)稀释的1x celltox green试剂中孵育。将不包含任何细胞的孔也在用完全培养基稀释的1x celltox green试剂中孵育，以在荧光信号检测过程中提供背景扣除孔。光处理24小时后，用荧光板读数仪测定celltox green荧光信号。接着，用去污剂裂解细胞，在37℃下孵育30分钟，在裂解后再次测定celltox green荧光信号。算出裂解前和裂解后的每个孔的扣除了背景(完全培养基中的不含细胞的1x celltox green)的celltox green信号的比值，并将该比值乘以100，从而算出死细胞百分数。
[0939]
如图2b所示，在所有在pit治疗过程中暴露在0j/cm2的光下的样品中均未观察到对细胞死亡的影响，这就表示，尽管在白光下预暴露后可溶性聚集体有所增加，但该可溶性聚集体在没有光辐照的情况下是没有细胞毒性的。相比之下，在随后用690nm激光以32j/cm2的光剂量进行辐照的样品中观察到细胞杀伤，尽管在白光下暴露更长时间的西妥昔单抗-irdye 700dx的作用下细胞杀伤的程度显著降低。如图所示，预暴露在3,000勒克斯小时(500勒克斯下6小时)或更高的白色荧光下的西妥昔单抗-irdye 700dx在pit活性方面显示出小于90％或更小的效果。但是，暴露在所有各勒克斯小时剂量的绿光下的西妥昔单抗-irdye 700dx均未对pit效价造成任何影响，这就表示，在绿光下的预暴露基本上不会对光活化杀伤活性造成影响。
[0940]
聚集体形成对pit活性的影响示于图2c。如图所示，作为针对各样品分别测得的可溶性聚集体百分数的函数，将用于评价白光和绿光暴露的所有西妥昔单抗-irdye 700dx治疗方案的pit效价(死细胞百分数)绘制成图。该结果显示，西妥昔单抗-irdye 700dx的大于15％的可溶性聚集体形成导致pit效价的显著降低。
[0941]
实施例10：与酞菁染料的间接偶联对pit杀伤性和pit特异性的影响
[0942]
进行以下研究来评价与细胞表面分子直接结合的抗体是否需要与irdye 700dx之类的酞菁光敏剂直接偶联才能介导pit杀伤活性。
[0943]
a.针对细胞靶向性抗体的第二抗体与irdye 700dx的偶联
[0944]
作为将靶向(例如癌细胞上的)细胞表面分子的靶向性抗体与irdye 700dx直接偶联的替代方案，将与靶向性抗体结合的抗人igg第二抗体与irdye700dx偶联。具体来说，将affinipure驴抗人igg的fcγ片段特异性(dxhu)抗体(目录号709-005-098，杰克逊免疫研究实验室(jackson immunoresearch laboratories)，宾夕法尼亚州西树丛)用irdye 700dx标记，以评价第二抗体-irdye 700dx对第一抗体的非共价标记能否用于pit介导的杀伤。用于将dxhu抗体与irdye 700dx偶联的方案与实施例8中使用的抗体偶联方案基本相同。
[0945]
除了首先将细胞在4℃下在存在或不存在抗-egfr抗体西妥昔单抗(美国myoderm公司，宾夕法尼亚州诺里斯敦)的条件下在补充有10％fbs和1％青霉素/链霉素的rpmi-1640培养基(完全培养基)中孵育1小时外，用与实施例9中描述的方法类似的方法来评价bxpc3细胞的pit杀伤。接着，将细胞用完全培养基清洗一次，在4℃下在存在或不存在用完全培养基稀释的irdye 700dx偶联(dxhu irdye 700dx)第二抗体的条件下孵育30分钟，然后用完全培养基清洗一次。作为对照，将bxpc3细胞与西妥昔单抗-irdye700dx一起孵育，其中西妥昔单抗与irdye 700dx直接偶联。接着，为了诱导细胞杀伤，用690nm激光以16j/cm2的光剂量照射细胞，或者将细胞避光(“无光”)。如实施例9所述用celltox green评价细胞死亡。
[0946]
如图3所示，依次用西妥昔单抗和驴抗人irdye 700dx第二抗体标记并用光处理的bxpc3细胞显示出～90％的细胞死亡。在细胞未暴露在690nm的光处理下时，用第一抗体和第二抗体进行的相同处理未导致细胞死亡。仅用第二抗体进行处理的细胞的光照射未引起细胞死亡，因为在没有和靶向细胞表面抗原的人源第一抗体一起预孵育的情况下，dxhu irdye 700dx第二抗体不与细胞直接结合。通过依次暴露在抗体下而诱导出的细胞杀伤的程度甚至略高于和用irdye 700dx直接标记的西妥昔单抗一起孵育过的bxpc3细胞中的细胞杀伤的程度。仅用培养基单独处理而未和西妥昔单抗或dxhu irdye 700dx一起孵育的bxpc3细胞的光处理导致～10％的基础细胞死亡水平，这与未用光辐照(无光处理)的细胞中的背景细胞死亡相近。因此，该结果显示，与癌细胞直接结合的抗体并不需要与irdye 700dx之类的酞菁光敏剂直接偶联才能介导pit杀伤活性。由第二抗体偶联irdye700dx介导的抗癌抗体的间接标记也能诱导有效的pit杀伤活性。
[0947]
b.针对生物素化细胞靶向性抗体的单体链霉亲和素与irdye 700dx的偶联
[0948]
在另一研究中，检测了用生物素化抗-egfr抗体(生物素化西妥昔单抗)以及单体链霉亲和素偶联的irdye 700dx一起依序孵育的细胞的pit杀伤活性。另外还检测了单体链霉亲和素-irdye 700dx在白光下的预暴露对pit杀伤活性的影响。
[0949]
1.偶联
[0950]
a.生物素与西妥昔单抗的偶联
[0951]
为了将抗egfr抗体西妥昔单抗与生物素偶联，使用30,000道尔顿分子量截止离心滤器(目录号ufc903024，默克－密理博公司(merck-millipore)，爱尔兰科克)，将以2mg/ml的浓度溶于ph 7.2的pbs来供应的5ml体积的抗-egfr抗体(西妥昔单抗；美国myoderm公司，
宾夕法尼亚州诺里斯敦)浓缩至2ml的体积(5mg/ml)将该溶液用100mm na2hpo4(ph 8.9)稀释至5ml，达到5ml的终体积和～8.5的ph。
[0952]
根据生产商的使用说明书(目录号21327，赛默飞世尔公司(thermo scientific)，伊利诺斯州罗克福德)，使用ez-连接磺基-nhs-lc-生物素(琥珀酰亚胺基-6-[生物素-氨基]己酸酯)来标记抗体。具体来说，将2mg的磺基-nhs-生物素样品(so
3-生物素-nhs酯，目录号1854200，赛默飞世尔公司(thermo scientific))在室温下融化，接着用去离子(di)水溶解，使浓度达到10mg/ml。将130μl体积的溶解的so
3-生物素-nhs酯以20(so
3-生物素-nhs酯)比1(西妥昔单抗抗体)的摩尔比加入西妥昔单抗抗体溶液中。在25℃下避光进行2小时的偶联反应，然后加入过量的甘氨酸来猝灭反应15分钟。接着，用30,000道尔顿分子量截止离心滤器将西妥昔单抗－生物素偶联物溶液交换至10倍当量偶联体积的ph 7.2的pbs中，以除去游离染料、甘氨酸和甘氨酸-irdye 700dx，并将ph调回至ph 7.2。
[0953]
用尺寸排阻色谱(se-hplc)来分析西妥昔单抗－生物素偶联物，评价单体西妥昔单抗－生物素纯度、可溶性聚集体百分数和反应产物残留杂质水平。偶联物的生物素比抗体的平均摩尔比(bar)用皮尔斯色谱用生物素定量试验(pierce colorimetric biotin quantification assay)(目录号128005，赛默飞世尔公司(thermo scientific)，伊利诺斯州罗克福德)根据供应商的使用说明书来测定。结果列于表14。
[0954][0955]
b.单体链霉亲和素与irdye 700dx的偶联
[0956]
用于将工程改造单体链霉亲和素2(msa2)(目录号ebu001/2，起发公司(kerafast)，马萨诸塞州波士顿)与irdye 700dx偶联的通用方案与实施例8所述的用于抗体偶联的方案基本相同，除了在偶联前先用3,000道尔顿分子量截止离心滤器将msa2溶液交换至ph 7的磷酸盐缓冲盐水中。为了偶联，接着将溶解的irdye 700dx nhs酯以2(irdye 700dx nhs酯)比1(单体链霉亲和素)的摩尔比加入msa2溶液中。基本上如实施例8所述进行偶联反应后，用10,000道尔顿分子量截止离心滤器将单体链霉亲和素偶联物溶液交换至24ml的ph 7的pbs中，以除去游离染料、甘氨酸和甘氨酸-irdye 700dx，并将ph调回至ph 7。
[0957]
2.pit杀伤
[0958]
将生物素化西妥昔单抗和单体链霉亲和素-irdye 700dx一起以20(单体链霉亲和素-irdye 700dx)比1(1μg/ml生物素化西妥昔单抗)的摩尔比在室温下预孵育1小时。将bxpc3细胞在rpmi培养基或完全培养基中在37℃下仅孵育1小时，所述rpmi培养基补充有10％fbs和1％青霉素/链霉素(完全培养基)且含有1μg/ml的预先与单体链霉亲和素-irdye 700dx复合的生物素化西妥昔单抗。接着，将细胞用完全培养基清洗一次。将细胞避光(光剂量0j/cm2)或用690nm激光以不同的光放射量(2j/cm2、8j/cm2、32j/cm2或64j/cm2)照射。如实施例9所述用celltox green评价细胞死亡。
[0959]
如图4a所示，预先与单体链霉亲和素-irdye 700dx(msa irdye700dx)复合的生物素化西妥昔单抗对bxpc3细胞的光依赖性pit杀伤活性是光剂量依赖性的。在仅和完全培养基一起孵育的细胞中未观察到光依赖性杀伤活性。
[0960]
为了确认该效果的特异性，在未偶联的西妥昔单抗或未偶联的单体链霉亲和素的存在下评价预先与单体链霉亲和素-irdye 700dx复合的生物素化西妥昔单抗的效果，以评价该效果能否被竞争下来。在一种条件下，首先将bxpc3细胞和100μg/ml的未偶联的西妥昔单抗或单独的完全培养基一起在37℃下预孵育1小时。接着将细胞清洗一次。接着，将和未偶联的西妥昔单抗一起预孵育的细胞和含有1μg/ml的预先与2μg/ml单体链霉亲和素-irdye 700dx复合的生物素化西妥昔单抗的完全培养基一起孵育。在另一种条件下，将仅和完全培养基一起预孵育过(而未和未偶联的西妥昔单抗一起预孵育过)的细胞和1μg/ml的生物素化西妥昔单抗一起孵育，该生物素化西妥昔单抗预先在10倍过量的未偶联的单体链霉亲和素的存在下进行过复合(用20μg/ml的未偶联的单体链霉亲和素和2μg/ml的单体链霉亲和素-irdye 700dx进行的复合)。此外，将和细胞培养基一起预孵育过(而未和未偶联的西妥昔单抗一起预孵育过)的细胞和单独的2μg/ml单体链霉亲和素-irdye 700dx或完全培养基一起在37℃下仅孵育1小时接着，将细胞用完全培养基清洗一次。
[0961]
图4b所示的结果证明，预先与单体链霉亲和素-irdye 700dx(msa irdye 700dx)复合的生物素化西妥昔单抗的pit介导杀伤对于和与irdye700dx连接的西妥昔单抗结合的细胞具有特异性。在和预先与单体链霉亲和素-irdye 700dx复合的生物素化西妥昔单抗一起孵育前预先暴露在100μg/ml的未偶联的西妥昔单抗下时，在bxpc3细胞中未观察到光依赖性的pit杀伤。该结果也显示，pit杀伤依赖于irdye 700dx偶联单体链霉亲和素和生物素化抗体的连接，因为未观察到和预先与相对于单体链霉亲和素-irdye 700dx过量10x摩尔的未偶联的单体链霉亲和素复合的生物素化西妥昔单抗一起孵育的bxpc3细胞的光依赖性pit杀伤。另外，该结果证明，在仅和单体链霉亲和素-irdye 700dx一起孵育而不存在生物素化西妥昔单抗的细胞或在单独的培养基中孵育的bxpc3细胞中，未观察到bxpc3细胞的光依赖性pit杀伤。
[0962]
3.光预暴露对组成和活性的影响
[0963]
也评价了使用暴露在不同类型的光下的单体链霉亲和素-irdye 700dx对细胞的间接杀伤效果。将30微升的单体链霉亲和素-irdye 700dx偶联物(dar 1.35)以865μg/ml的单体链霉亲和素偶联物浓度加入各个透明hplc药瓶中。测试了以下条件：(1)将单体链霉亲和素-irdye 700dx偶联物置于包在铝箔中以避免曝光的透明玻璃hplc管中，在卤素灯下以2500勒克斯暴露24小时(“无光”，作为热量加热效应的对照)；(2)将单体链霉亲和素-irdye 700dx偶联物置于透明玻璃hplc管中，在卤素灯下以2500勒克斯暴露24小时(“白光”)；(3)将单体链霉亲和素-irdye 700dx偶联物置于透明玻璃hplc管中，在绿色led灯下以2500勒克斯暴露24小时(“绿光”)。
[0964]
如上所述，针对bxpc3细胞，评价由在不同条件下预暴露的单体链霉亲和素-irdye 700dx和与生物素化西妥昔单抗复合的单体链霉亲和素-irdye 700dx诱导的细胞杀伤。因此，如上所述，所有的bxpc3细胞处理都是和完全培养基或含有预先与单体链霉亲和素-irdye 700dx复合的生物素化西妥昔单抗的完全培养基一起孵育，其中，所述单体链霉亲和素-irdye700dx在不同波长的光下经过预暴露。
[0965]
如图4c所示，结果表明，单体链霉亲和素-irdye 700dx在白光下的预暴露抑制pit杀伤活性的潜力。将细胞和预先与用铝箔保护其不曝光的单体链霉亲和素-irdye 700dx复合的生物素化西妥昔单抗一起孵育时，观察到预期的bxpc3细胞的光依赖性杀伤。相比之
下，将细胞和预先与在来自卤素灯的白光下以2500勒克斯暴露24小时的单体链霉亲和素复合的生物素化西妥昔单抗一起孵育时，未观察到bxpc3细胞的光依赖性杀伤。该结果显示，将bxpc3细胞和预先与在来自绿色led灯的绿光下以2500勒克斯暴露24小时的单体链霉亲和素-irdye 700dx复合的生物素化西妥昔单抗一起孵育时，由曝光引起的pit杀伤性的丧失有所减少，尽管在该实验中，即使在将irdye 700dx偶联物预暴露在绿光下时pit杀伤性仍有一些降低。在仅和完全培养基一起孵育的bxpc3细胞中未观察到光依赖性pit杀伤。
[0966]
实施例11：抗-epcam抗体-irdye 700 dx偶联物对pit杀伤性的影响
[0967]
进一步进行额外的研究来评价与irdye 700dx之类的酞菁光敏剂偶联的抗小鼠cd326(epcam)(目录号118202，白乐津公司(biolegend)，加利福尼亚州圣迭戈市)对细胞杀伤性的影响。该抗体靶向另一种替代的细胞表面分子epcam。为了制备抗-epcam-irdye 700dx，如实施例8所述进行偶联。
[0968]
为了评价抗-epcam-irdye 700dx偶联物的pit杀伤活性，将4t1细胞和rpmi培养基或完全培养基中在37℃下仅孵育1小时，所述rpmi培养基补充有10％fbs和1％青霉素/链霉素(完全培养基)且含有更高浓度的上述抗-epcam-irdye 700dx。接着，将细胞用完全培养基清洗一次。接着，用690nm激光以0或32j/cm2的光放射量照射细胞。如实施例9所述用celltox green评价细胞死亡。
[0969]
如图5a所示，结果显示，以和抗-epcam-irdye 700dx一起孵育并以32j/cm2照射的4t1细胞以抗体剂量依赖性方式被杀伤。在任何抗体浓度下，在没有光照射的情况下均未观察到显著的细胞死亡。
[0970]
为了确认细胞杀伤的特异性，用过量摩尔的未偶联的抗-epcam抗体孵育4t1细胞，以阻断抗-epcam-irdye 700dx偶联物与细胞表面的结合。具体来说，将10、1或0.1μg/ml的未偶联的抗-epcam抗体或单独的完全培养基在37℃下孵育1小时。在不清洗细胞的情况下，将抗-epcam-irdye700dx加入4t1细胞中，使终浓度达到0.1μg/ml，并在37℃下孵育1小时。如上所述，通过用690nm激光以32j/cm2的光剂量进行照射来诱导细胞杀伤，并用celltox green测定细胞杀伤。
[0971]
结果示于图5b，该结果显示抗epcam-irdye 700dx pit杀伤活性的特异性。该结果显示，与未经过阻断步骤的4t1细胞相比，在和抗-epcam-irdye 700dx一起孵育前和未偶联的抗-epcam抗体一起预孵育的4t1细胞在32j/cm2的激光照射暴露后显示出明显更少的细胞死亡，这就证明，抗-epcam与细胞的结合以及与irdye 700dx的偶联对于基于光免疫疗法的杀伤而言是必需的。
[0972]
实施例12：西妥昔单抗-irdye 700dx对表达fc受体的靶细胞的pit杀伤
[0973]
进行以下研究来评价抗体-irdye 700dx药物偶联物是否能与fc受体(fcr)结合、以及采用近红外(～690nm)光的激活是否能导致fcr+细胞杀伤。fcr常见于多种免疫细胞，如单核细胞、巨噬细胞和髓源抑制性细胞(mdsc)。发现这些细胞在实体肿瘤中的作用是有害的且具有肿瘤促进性。人单核细胞系thp1表达表面fc受体，被用作本试验的模式细胞系统。
[0974]
将在完全rpmi 1640培养基中生长的thp1细胞(atcc，tib-202)以每孔5000个细胞、100μl总体积铺在96孔组织培养板上，过夜使其贴壁。用台盼蓝排除法检验铺板前的细胞活力，有》95％的细胞是活的。将细胞分成以下三组(均一式三份)：(1)单独的thp1细胞
(未处理)；(2)用药物西妥昔单抗-irdye 700dx以500ng/ml进行处理的thp1细胞；以及(3)首先和fc受体阻断溶液(目录号564220，bd公司，新泽西州富兰克林湖)以1微克(μg)/孔在室温下一起孵育20分钟、然后用药物西妥昔单抗-irdye 700dx(500ng/ml，避光孵育器中37℃1小时)处理的thp1细胞。
[0975]
为了诱导杀伤，对各组的细胞以32j/cm2的剂量施加690nm激光。对照是指与上述组相对应但未用光处理的孔。基本上如实施例9所述用celltox green评价细胞杀伤性。将celltox green染料(1x)加入孔中，将细胞在避光孵育器中37℃孵育24小时。将染料也加入仅含有100μl培养基的两个孔中，用于后续的背景扣除。孵育后，迅速将组织培养板在板读数仪上读数。接着，通过加入5μl的稀释裂解溶液(普洛麦格公司(promega)，目录号g1821)对细胞实施裂解，也包括仅含有培养基的对照孔。稀释通过以40％(裂解溶液):60％(培养基)的比例向裂解溶液中加入培养基来进行。接着，再次对板进行读数，以获得100％细胞死亡的相关数值。对于每次读数，将上述两个背景孔取平均，将它们的数值从所有其它孔中扣除。为了算出每个孔的细胞死亡百分数，将来自第一次读数的扣除了背景的数值除以第二次读数的数值(裂解后)并乘以100。
[0976]
如图6所示，结果显示，西妥昔单抗-irdye 700dx对thp1细胞的fc受体特异性杀伤。在施加了32j/cm2光的药物处理thp1细胞的组中观察到最大杀伤。杀伤的百分数值是相对于光处理且药物处理的thp1细胞而言的。因此，该结果显示，抗体介导的杀伤可通过与细胞表面上的靶分子特异性结合、在一些情况下还通过抗体与fcr的结合来介导。
[0977]
实施例13：细胞杀伤活性的评价以及白光暴露对非抗体分子:irdye700dx dx偶联物的细胞杀伤活性的影响
[0978]
进行以下研究来评价非抗体蛋白质、小蛋白质和病毒是否能与irdye700dx之类的酞菁染料偶联来靶向细胞杀伤。如下所示，结果显示，其它各种非抗体分子介导细胞杀伤，其依赖于近红外光(如约690nm光)的激活、与细胞的结合和/或大分子偶联物在白光下的预暴露的影响。
[0979]
a.非抗体蛋白质:ir700偶联物
[0980]
将人重组表皮生长因子(egf)(目录号01-401，emd密理博公司(emd millipore)，马萨诸塞州比尔里卡)与irdye 700dx偶联，并进行测定来评价其杀伤活性以及在不同波长的光下的预暴露是否影响可溶性聚集体形成。
[0981]
1.egf偶联
[0982]
用于将人重组egf用irdye 700dx标记的方案与实施例8中描述的抗体偶联用的方案基本相同，除了在偶联前先用3,000道尔顿分子量截止离心滤器将egf溶液交换至ph 7的磷酸盐缓冲盐水中。为了偶联，接着将溶解的ir700 nhs酯以4(ir700 nhs酯)比1(egf)的摩尔比或1.2(ir700 nhs酯)比1(egf)的摩尔比加入egf溶液中。如a部分所述进行偶联反应后，用3,000道尔顿分子量截止离心滤器将egf偶联物溶液交换至6倍当量偶联体积的ph 7的pbs中，以除去游离染料、甘氨酸和甘氨酸-ir700，并将ph调回至ph7。
[0983]
2.egf-ir700光依赖性杀伤活性
[0984]
在a431细胞中评价egf-ir700细胞杀伤性。实验前一天，将a431细胞以5000个细胞每孔接种于白色透明底96孔板中。翌日，将a431细胞用补充有1％青霉素/链霉素的emem(无血清培养基)清洗三次。接着，将a431细胞用无血清培养基清洗一次，然后和含有1μg/ml的
egf-irdye 700dx的无血清培养基一起或仅和无血清培养基一起在4℃下孵育1小时。作为用于评价活性的特异性的对照，在一种条件下，在和1μg/ml的egf-irdye 700dx一起孵育前，将a431细胞和在无血清培养基中稀释的100μg/ml的未偶联的西妥昔单抗一起在4℃下预孵育1小时。接着，将细胞用无血清培养基清洗一次。
[0985]
接着，为了诱导ir700依赖性杀伤，用690nm激光以32j/cm2的光剂量照射细胞，或者将细胞避光(“无光”)。如实施例9所述用celltox green评价细胞死亡。从所有孔扣除来自无光且只有无血清培养基的对照的死亡细胞百分数，除以由32j/cm2下的egf-irdye 700dx减去无光且只有无血清培养基的对照而得的值，并乘以100，从而算出标准化的死亡细胞百分数。
[0986]
如图7a所示，结果显示，egf-irdye 700dx介导的细胞杀伤是光依赖性杀伤，其中只在用光处理细胞以激活细胞杀伤活性时观察到杀伤。a431细胞在和1μg/ml egf-irdye 700dx一起孵育前在100μg/ml的未偶联的西妥昔单抗下的预暴露阻断了光依赖性细胞杀伤。仅和培养基一起孵育的a431细胞未显示出任何的光诱导杀伤。
[0987]
3.光预暴露对光活化活性的影响
[0988]
也在a431细胞中评价egf-irdye 700dx在白光和绿光下的预暴露对光活化细胞杀伤的影响的比较。将egf-irdye 700dx预暴露在不同类型的光下，评价光处理对光活化杀伤活性的影响。将5微升的egf-irdye 700dx偶联物(dar 2)以1.14mg/ml的egf-irdye 700dx浓度加入各个透明hplc药瓶中。测试了以下条件：(1)在4℃下避光储存的抗体-irdye 700dx偶联物(“4℃”，用作对照)；(2)在卤素灯下以2500勒克斯暴露24小时的、置于透明玻璃hplc管中的抗体-irdye 700dx偶联物(“白光”)；(3)在卤素灯下以2500勒克斯暴露24小时的、置于包在铝箔中以避免曝光的透明玻璃hplc管中的抗体-irdye 700dx偶联物(“无光”，用作聚集体形成中的热量加热效应的对照)；以及(4)置于透明玻璃hplc管中并在绿色led灯下以2500勒克斯暴露24小时的抗体-irdye 700dx偶联物(“绿光”)。
[0989]
为了评价细胞杀伤活性，将a431细胞用无血清培养基清洗两次，在单独的无血清培养基中在4℃下孵育1小时。接着，将细胞用无血清培养基清洗一次，和单独的无血清培养基、或者含有1μg/ml的egf-irdye 700dx的无血清培养基(“无光”)、含有1μg/ml的预暴露在白光下的egf-irdye700dx的无血清培养基(“2500勒克斯白光”)、或含有1μg/ml的预暴露在绿光下的egf-irdye 700dx的无血清培养基(“2500勒克斯绿光”)一起在4℃下孵育1小时。接着，将细胞用无血清培养基清洗一次。
[0990]
为了诱导细胞杀伤，将细胞避光(光剂量0j/cm2)或用690nm激光以不同的光放射量(8j/cm2、32j/cm2或64j/cm2)照射。
[0991]
如图7b所示，egf-irdye 700dx光依赖性杀伤活性对白光下的预暴露敏感。和被保护不曝光但未被保护不受来自卤素灯的2500勒克斯24小时的白光的热量加热的egf-irdye 700dx一起孵育的a431细胞显示出光依赖性杀伤。和在来自卤素灯的白光下以2500勒克斯暴露24小时的egf-irdye700dx一起孵育的a431细胞不再显示出光依赖性杀伤活性。和在来自绿色led灯的绿光下以2500勒克斯暴露24小时的egf-irdye 700dx一起孵育的a431细胞显示出与“无光”egf-irdye 700dx相当的光依赖性杀伤活性。仅和无血清培养基一起孵育的a431细胞未显示出光依赖性杀伤活性。
[0992]
b.霍乱毒素b-ir700偶联物
700dx偶联物置于包在铝箔中以避免曝光的透明玻璃hplc管中，在卤素灯下以2500勒克斯暴露24小时(“无光”，用作聚集体形成中的热量加热效应的对照)；(2)将霍乱毒素b-irdye700dx偶联物置于透明玻璃hplc管中，在卤素灯下以2500勒克斯暴露24小时(“白光”)；(3)将霍乱毒素b-irdye 700dx偶联物置于透明玻璃hplc管中，在绿色led灯下以2500勒克斯暴露24小时(“绿光”)。
[1004]
如上所述在bxpc3细胞中评价由在不同条件下预暴露的霍乱毒素b-irdye 700dx诱导的细胞杀伤。因此，如上所述，所有的bxpc3细胞处理都是和单独的无血清培养基或含有在不同波长的光下经过预暴露的霍乱毒素b-irdye 700dx的无血清培养基一起孵育。
[1005]
如图8c所示，霍乱毒素b-irdye 700dx介导的光依赖性杀伤活性对白光下的预暴露敏感。和被保护不曝光但未被保护不受来自卤素灯的2500勒克斯24小时的白光的热量加热的霍乱毒素b-irdye 700dx一起孵育的bxpc3细胞显示出光依赖性杀伤。和在来自卤素灯的白光下以2500勒克斯暴露24小时的霍乱毒素b-irdye 700dx一起孵育的bxpc3细胞不再显示出光依赖性杀伤活性。和在来自绿色led灯的绿光下以2500勒克斯暴露24小时的霍乱毒素b-irdye 700dx一起孵育的bxpc3细胞显示出的光依赖性杀伤活性略有降低，但比暴露在白光下的霍乱毒素b-irdye 700dx处理的细胞的光依赖性杀伤活性的降低少得多。仅和无血清培养基一起孵育的bxpc3细胞未显示出光依赖性杀伤活性。
[1006]
c.流感病毒-ir700
[1007]
进行以下研究来评价病毒颗粒是否能与irdye 700dx之类的酞菁染料偶联以产生光活化细胞杀伤。也评价在白光下的预暴露对病毒-ir700偶联物的光活化杀伤的影响。
[1008]
1.流感病毒(x-31)偶联
[1009]
将冷冻固体分装的irdye 700dx nhs酯(目录号929-70011；li-cor，内布拉斯加州林肯市)在室温下融化，接着用dmso溶解以达到10mg/ml的浓度。在黑暗环境下，将10μg的irdye 700dx nhs酯加入65,536ha效价单位的流感a x-31、a/aichi/68(h3n2)保藏物(目录号10100375，查尔斯河实验室(charles river laboratories)，马萨诸塞州威明顿)中，在台式漩涡搅拌器可以实现的最低设定下在25℃下放置2小时。将100μl的病毒溶液上样至预先用磷酸盐缓冲盐水平衡的nap 5重力流柱(目录号17-0853-02，ge医疗生命科学公司(ge healthcare life sciences)，宾夕法尼亚州匹兹堡)，从而用重力流柱将病毒偶联物从游离染料中分离。加入650μl的磷酸盐缓冲盐水后，弃去流穿液。将额外的400μl磷酸盐缓冲盐水上样至柱，收集含有偶联病毒的流穿液。在使用病毒进行实验前，将病毒偶联物溶液用0.2μm孔径pvdf滤器过滤，以除去所有不溶性聚集体。
[1010]
2.流感病毒(x-31)-irdye 700dx杀伤活性
[1011]
将vero细胞和流感病毒(x-31)-ir700一起孵育，以评价与流感病毒(x-31)-ir700关联的细胞是否易于在光辐照后发生杀伤。将vero细胞用补充有1％青霉素/链霉素的emem培养基(无血清培养基)清洗四次。将1200μl的无血清培养基与400μl的纯化流感病毒(x-31)-irdye 700dx流穿液(如上所述制备)混合，然后用0.2μm孔径pvdf滤器过滤，以除去所有聚集体，从而制成病毒接种培养基。将100μl的病毒接种培养基或100μl的无血清培养基加入细胞中，在4℃下孵育1小时。接着，将细胞用100μl的无血清培养基清洗一次。
[1012]
将与病毒关联的细胞或对照vero细胞避光(光剂量0j/cm2)或用690nm激光以不同的光放射量(2j/cm2、8j/cm2、32j/cm2或96j/cm2)照射。如实施例9所述用celltox green评
价细胞死亡。
[1013]
如图9a所示，用流感病毒(x-31)-irdye 700dx接种的vero细胞以光剂量依赖性方式被杀伤。在不含病毒的完全培养基中孵育的vero细胞未显示出光依赖性杀伤。
[1014]
3.光预暴露对偶联物活性的影响
[1015]
在三种不同的曝光条件下测试流感病毒(x-31)-irdye 700dx在光下的预暴露对光活化光依赖性杀伤活性的影响，包括在不同波长的白光和绿光下的比较。将约130ul的流感病毒(x-31)-irdye 700dx流穿液加入各个透明hplc药瓶中，在暴露于以下条件后进行测试：(1)将流感病毒(x-31)-irdye700dx偶联物置于包在铝箔中以避免曝光的透明玻璃hplc管中，在卤素灯(目录号pl-800，dj公司(dolan-jenner)，马萨诸塞州巴克斯柏路)下以2500勒克斯暴露18小时(“无光”，作为热量加热效应的对照)；(2)将流感病毒(x-31)-irdye 700dx偶联物置于透明玻璃hplc管中，在卤素灯下以2500勒克斯暴露18小时(“白光”)；(3)将流感病毒(x-31)-irdye 700dx偶联物置于透明玻璃hplc管中，在绿色led灯(目录号green-ecs gp19 ecosmart)下以2500勒克斯暴露18小时(“绿光”)。
[1016]
用690nm激光以96j/cm2的光剂量照射后，如上所述评价由在不同条件下预暴露的流感病毒(x-31)-irdye 700dx对vero细胞的接种诱导的细胞杀伤。因此，所有的vero细胞处理都是和单独的无血清培养基或含有在不同波长的光下经过预暴露的流感病毒(x-31)-irdye 700dx的无血清培养基一起孵育。
[1017]
如图9b所示，流感病毒(x-31)-irdye 700dx介导的光依赖性杀伤活性对白光下的预暴露敏感。和用铝箔保护不曝光(“无光”)的流感病毒(x-31)-irdye 700dx一起孵育的vero细胞显示出光依赖性杀伤。然而，与用被保护不曝光的“无光”流感病毒(x-31)-irdye 700dx处理的细胞相比，在和在来自卤素灯的白光下以2500勒克斯暴露18小时的流感病毒(x-31)-irdye 700dx一起孵育的vero细胞中，细胞杀伤的程度降低。相比之下，用在来自绿色led灯的绿光下以2500勒克斯暴露18小时的流感病毒(x-31)-irdye 700dx接种的vero细胞显示出与被保护不曝光的“无光”流感病毒(x-31)-irdye 700dx相同的光活化杀伤活性。仅和无血清培养基一起孵育的vero细胞未显示出光依赖性杀伤活性。
[1018]
实施例14：其它分子:ir700 dx偶联物的细胞杀伤活性的评价
[1019]
进行研究来评价能与非蛋白质表面分子结合的其它非抗体irdye 700dx偶联物的细胞杀伤活性。在一个示例性的其它研究中，评价与irdye700dx偶联的西洋接骨木凝集素(sna；也称为接骨木凝集素、ebl)(目录号l-1300，载体实验室(vector labs)，加利福尼亚州伯林格姆)的效果，以评价其杀伤活性。sna与细胞上的糖蛋白上的alpha(2,6)-连接的唾液酸特异性结合。也使用尺寸排阻色谱来评价sna-ir700的光诱导聚集，但在本示例性的实验中，对暴露在白光和绿光下的sna-ir700偶联物的尺寸排阻色谱没有影响。
[1020]
1.接骨木凝集素(sna)偶联
[1021]
用于将sna用irdye 700dx标记的方案与实施例8中描述的抗体偶联用的方案基本相同。
[1022]
2.sna-ir700光依赖性杀伤活性
[1023]
为了评价sna-ir700是否能在光辐照后引发细胞杀伤，在bxpc3细胞中评价细胞杀伤。将bxpc3细胞从细胞培养板上洗下，将含有补充有10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的rpmi培养基(完全培养基)的细胞培养基换成补充有1％bsa和1％青霉素/链霉素的rpmi培
养基(结合培养基)。将bxpc3细胞转移至仅含有结合培养基或以～2.5的染料抗体比(dar)含有10μg/ml的sna-irdye 700dx的结合培养基的独立的管中，在4℃下孵育1小时。接着，将细胞转移至预先涂有200μg/ml的未偶联的sna(在37℃下进行1小时涂布处理，并用无血清培养基清洗3次)以阻断sna-irdye 700dx与板的非特异性结合的板上。
[1024]
为了诱导ir700依赖性杀伤，将细胞避光(光剂量0j/cm2)或用690nm激光以不同的光放射量(8j/cm2、32j/cm2或96j/cm2)照射。如实施例9所述用celltox green评价细胞死亡。
[1025]
如图10a所示，和sna-irdye 700dx一起孵育的bxpc3细胞显示出光依赖性杀伤。用不含ir700偶联物的完全培养基处理的bxpc3细胞未显示出光依赖性杀伤。
[1026]
为了评价细胞杀伤的特异性，将bxpc3细胞用唾液酸酶a处理，该唾液酸酶a将sna的受体上的alpha(2,6)-连接的唾液酸切下。将bxpc3细胞从组织培养瓶上洗下，用10％福尔马林固定20分钟。接着，将细胞用pbs清洗3次，用单独的1x反应缓冲液(由5x glyco唾液酸酶a-51反应缓冲液稀释，目录号gk80045，普迈公司(prozyme))、含有0.025u唾液酸酶a的1x反应缓冲液、或含有0.075u唾液酸酶a的1x反应缓冲液在37℃下处理2小时。接着，将细胞用pbs清洗三次，然后和单独的pbs或含有10μg/ml的sna-irdye 700dx的pbs一起在4℃下孵育1小时。
[1027]
孵育后，将细胞用pbs清洗三次，用dapi核染染色，然后铺在96孔板上，在落射荧光显微镜下成像。选择至少10个区域，并进行成像以检测dapi核染信号和sna-irdye 700dx荧光信号。为了比较受试组的荧光强度，从同一图像内的所有其它像素中扣除给定图像的最小像素强度，从而进行背景扣除。将dapi核染信号阈值化，用作各细胞的代表性区域。接着，使用分隔好的dapi图像来确定各个独立细胞的区域，这些独立细胞将在用于检测sna-irdye 700dx的频道内进行平均荧光强度的定量。因为sna-irdye700dx染色是弥散的膜染色、并且使用的是落射显微镜，所以由通过dapi核染定义的遮蔽区测得的平均荧光信号可以用作每个细胞的sna-irdye700dx染色的代表性的平均荧光强度。针对每种处理条件对100个细胞收集平均荧光强度，并绘制成盒须图。
[1028]
用唾液酸酶a处理细胞后的受试组的荧光强度结果示于图10b。结果显示，唾液酸酶a处理的剂量依赖性增加导致样品中的sna-irdye 700dx染色的相应减弱。未用sna-irdye 700dx对bxpc3细胞进行染色时，唾液酸酶a处理的剂量依赖性增加未导致来自用于检测sna-irdye 700dx的频道的荧光的任何变化。
[1029]
实施例15：细菌病原体的ir700偶联物介导的pit杀伤
[1030]
进行以下研究来评价与irdye 700dx之类的酞菁光敏剂直接偶联的抗体是否能通过与细菌细胞表面上展示的蛋白质结合来杀伤细菌细胞。蛋白质a是金黄色葡萄球菌(s.aureus)的细胞表面上展示的蛋白质，与抗体的fc区结合。
[1031]
在这些研究中，使用基本上如实施例1所述偶联的西妥昔单抗-ir700。金黄色葡萄球菌获自美国典型培养物保藏中心(atcc)id 6538。金黄色葡萄球菌在脑心浸液(bhi)琼脂板上生长以供菌落挑选和计数，或者在bhi肉汤(完全培养基)中生长以供扩增。
[1032]
为了评价细菌细胞诱导的pit杀伤，将金黄色葡萄球菌和100μg/ml的西妥昔单抗-irdye 700dx一起在室温下孵育1小时。接着，用690nm激光以0或300j/cm2照射细胞。通过在以下条件下计数bhi琼脂板上的菌落形成单位(cfu)来测定剩余的活细菌细胞数。作为对
照，在仅和西妥昔单抗-irdye700dx一起孵育处理而未进行激光照射的细胞、仅进行激光照射的细胞或未处理的细胞中也评价活细菌细胞数。将活cfu百分数标准化为未处理的细菌细胞。
[1033]
结果示于图11，其显示，在存在与蛋白质a结合的抗体-ir700偶联物的情况下，可以出现金黄色葡萄球菌的pit介导的细胞杀伤。与其它三组相比，只有和西妥昔单抗-irdye 700dx一起孵育、然后进行激光照射的细菌细胞出现了统计学上显著的cfu降低。
[1034]
实施例16：病毒病原体的ir700偶联物介导的pit杀伤
[1035]
进行以下研究来评价是否可以通过用酞菁标记的抗病毒抗体对病毒颗粒进行pit来抑制病毒感染。一个示例性的研究如下所述进行：使用流感病毒作为特例，其中，针对用小鼠抗流感病毒a(h3n2)包被的流感病毒颗粒和山羊抗小鼠fab-irdye 700dx抗体进行间接pit治疗。因为用第二抗体-irdye 700dx偶联物对第一未偶联抗体进行间接标记可以诱导与直接偶联的第一抗体类似的pit杀伤，所以这一发现可以推广至直接偶联的抗病毒-irdye 700dx抗体。因此，这些结果证明，pit治疗可以引起病毒感染的抑制。
[1036]
基本上如实施例8所述将affinipure fab片段山羊抗小鼠igg1特异性(gtxms fab)抗体(目录号115-007-185，杰克逊免疫研究实验室(jackson immunoresearch laboratories)，宾夕法尼亚州西树丛)与ir700偶联，除了先用10,000道尔顿分子量截止离心滤器将gtxms fab抗体溶液交换至ph 7的磷酸盐缓冲盐水中、然后通过添加ph＝9磷酸盐缓冲液将抗体溶液ph调节至8.5的ph。将冷冻固体分装的irdye 700dx nhs酯(目录号929-70011；li-cor，内布拉斯加州林肯市)在室温下融化，接着用dmso溶解以达到10mg/ml的浓度。在黑暗环境下，接着将溶解的ir700 nhs酯以2(ir700 nhs酯)比1(抗体)的摩尔比加入抗体溶液中。偶联反应在25℃下避光进行2小时。以10mm的终浓度用15分钟的时间加入甘氨酸(ph 8.2)以使反应猝灭。接着，用10,000道尔顿分子量截止离心滤器将抗体偶联物溶液交换至24ml的ph 7的pbs中，以除去游离染料、甘氨酸和甘氨酸-ir700 dx，并将ph调回至ph 7。
[1037]
为了pit，通过在黑暗下将1μg的小鼠抗人流感a(h3n2)(f49)(目录号m146，宝公司(takara)，日本东京葛饰区)与1μg的gtxms fab-irdye 700dx在25℃下混合5分钟，从而将流感病毒a与ir700间接连接，然后在黑暗下和16,384ha效价单位的流感a x-31、a/aichi/68(h3n2)保藏物(目录号10100375，查尔斯河实验室(charles river laboratories)，马萨诸塞州威明顿)一起在25℃下孵育30分钟。加入约875μl的补充有1％青霉素/链霉素的emem(无血清培养基)，加工孵育后的病毒用0.2μm孔径pvdf滤器过滤，以除去所有不溶性聚集体(病毒接种培养基)。孵育以一式两份实施。对于两份样品中的一份，将抗体－病毒溶液暴露在144j/cm2的690nm光下，而另一份样品避光。
[1038]
评价pit处理病毒对vero细胞的感染性。在用小鼠抗流感病毒a(h3n2)和gtxms fab-irdye 700dx标记流感病毒(x-31)前24小时，将125,000个vero细胞铺在6孔板上。在接种细胞后以及用小鼠抗流感病毒(h3n2)抗体和gtxms fab-irdye 700dx标记流感病毒(x-31)后第二天，将细胞用无血清培养基清洗四次。接着，将细胞和100μl的经光处理的病毒接种培养基、未经光处理的病毒接种培养基或无血清培养基一起在37℃下孵育1小时。接着，将培养基换成补充有0.3％牛血清白蛋白(bsa)和1％青霉素/链霉素的emem。病毒接种后14小时，将细胞用胰蛋白酶消化，重悬于补充有10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的emem中，
并置于eppendorf管。接着，将细胞用10％福尔马林固定20分钟，随后用磷酸盐缓冲盐水(pbs，ph 7)清洗3次。对于每个清洗步骤，将细胞以1500rpm离心3分钟，除去上清液，将细胞团块用1ml的pbs重悬。
[1039]
接着，将细胞和“封闭缓冲液”一起在25℃下孵育30分钟，该“封闭缓冲液”含有补充有3％牛血清白蛋白(无igg、无蛋白酶)(目录号001-000-162，杰克逊免疫研究实验室(jackson immunoresearch laboratories)，宾夕法尼亚州西树丛)和0.08％皂苷的pbs。接着，将细胞和在封闭缓冲液中稀释的1:2000小鼠(igg2a)抗流感病毒a核蛋白抗体[aa5h](目录号ab20343，艾博抗公司(abcam)，英国剑桥)一起在25℃下孵育1小时10分钟。随后，通过将细胞以1500rpm离心3分钟来将细胞用封闭缓冲液清洗3次，除去上清液，将细胞团块用100μl的封闭缓冲液重悬，并在下一次清洗前将细胞在25℃下孵育至少5分钟。将第一抗体洗去后，将细胞和在封闭缓冲液中稀释的1:250alexafluor 488-偶联的affinipure山羊抗小鼠igg fcgamma 2a亚类特异性抗体(目录号115-545-206，杰克逊免疫研究实验室(jackson immunoresearch laboratories)，宾夕法尼亚州西树丛)一起在25℃下孵育30分钟。接着，将细胞用每次清洗量为100μl的封闭缓冲液清洗3次，每次清洗步骤至少5分钟，然后用pbs再清洗3次。接着，将细胞点样在96孔板上，用荧光显微镜(evos，生命技术公司(life technologies))成像。随机选择至少12个随机的感兴趣区域，得到亮场图和相应的荧光图，用gfp激发和发射灯管拍摄。用亮场图得到细胞的总数，用荧光图检测核蛋白表达的存在，检测结果是细胞已被流感病毒感染。
[1040]
评价用抗ha包被的流感病毒颗粒和山羊抗小鼠irdye 700dx(gtxms fab-irdye 700dx)在690nm光下的暴露对病毒感染性的影响。图12的结果显示，使用预先与gtxms fab-irdye 700dx复合的小鼠抗流感病毒(h3n2)的流感病毒颗粒的pit消除了流感病毒感染。和用预先复合的小鼠抗流感病毒(h3n2)包被的病毒以及未暴露在690nm光下的gtxms fab-irdye 700dx一起孵育的vero细胞导致强烈的病毒感染，由约97.4％的vero细胞因流感病毒核蛋白表达而染色。与之形成鲜明对比的是，和用小鼠抗流感病毒(h3n2)包被的pit处理病毒以及gtxms fab-irdye 700dx一起孵育的vero细胞显示出病毒感染的显著减少，只有1.8％的vero细胞因流感病毒核蛋白表达而染色。
[1041]
实施例17：被病原体感染的细胞的ir700偶联物介导的pit杀伤
[1042]
进行以下研究来评价被病毒感染的细胞是否能用pit选择性地治疗，该pit采用的是用酞菁染料(如irdye 700dx)通过直接偶联进行标记或用第二抗体偶联物进行间接标记的抗病毒抗体。示例性的数据包括使用采用小鼠抗流感病毒(h3n2)抗体和山羊抗小鼠-irdye 700dx第二抗体的间接pit对被流感病毒感染的细胞实施pit。
[1043]
在本研究中，基本上如实施例8所述进行affinipure fab片段山羊抗小鼠igg1特异性(gtxms fab)抗体与irdye 700dx的偶联。
[1044]
在用pit治疗病毒或细胞前，用流感病毒感染vero细胞。将约5,000个vero细胞铺在96孔透明底黑色板上。细胞接种后第二天，将细胞用100μl的补充有1％青霉素/链霉素的emem(无血清培养基)清洗四次，接着和含有每孔327.68ha效价单位的流感a x-31、a/aichi/68(h3n2)(目录号10100375，查尔斯河实验室(charles river laboratories)，马萨诸塞州威明顿)的无血清培养基一起孵育。接着，将细胞和病毒接种培养基或无血清培养基一起在37℃下孵育90分钟，然后将病毒接种培养基换成补充有0.3％牛血清白蛋白(bsa)和
1％青霉素/链霉素的emem。
[1045]
接着，在病毒接种后14小时，将被病毒感染的细胞用小鼠抗流感病毒(h3n2)抗体和山羊抗小鼠-irdye 700dx第二抗体标记。简而言之，将细胞和用补充有10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的emem(完全培养基)稀释的1μg/ml的小鼠抗人流感a(h3n2)(f49)(目录号m146，宝公司(takara)，日本东京葛饰区)一起在4℃下孵育1小时。接着，将细胞用完全培养基清洗一次，然后和在完全培养基中稀释的5μg/ml的gtxms-irdye 700dx一起在4℃下孵育1小时。接着，将细胞用100μl的完全培养基清洗一次。为了诱导pit，用690nm激光以64j/cm2照射细胞，或者将细胞避光(“无光”)。
[1046]
用celltox green试剂评价细胞死亡。光处理后，将所有细胞和在完全培养基中稀释的1x celltox green试剂一起在37℃下孵育15分钟，接着用荧光显微镜(evos，生命技术公司(life technologies))成像。针对至少三个不同孔，随机选择每个孔的至少5个随机的感兴趣区域，得到亮场图、采用cy5激发和发射灯管的抗流感病毒荧光图、以及采用gfp激发和发射灯管的celltox green荧光图。接着，对细胞进行抗流感病毒染色的评分，作为细胞被病毒感染的指示。对于被病毒感染的细胞，接着对细胞进行是否被celltox green染色的评分。
[1047]
如图13所示，结果显示，在依次用小鼠抗流感病毒(h3n2)和山羊抗小鼠irdye 700dx(gtxms-irdye 700dx)标记、然后进行光辐照的、被流感病毒感染的vero细胞中观察到pit诱导的细胞死亡。观察到的细胞死亡的程度是光依赖性的，因为在没有光处理的情况下仅观察到可以忽略的细胞死亡。
[1048]
实施例18：神经元的ir700偶联物介导的pit杀伤
[1049]
进行以下研究来评价神经元是否能通过使用irdye 700dx偶联物的pit被杀伤。使用与irdye 700dx偶联的霍乱毒素b亚基对背根神经节(drg)神经元实施pit。690nm激光的辐照导致完全的细胞死亡，在基于发光的细胞毒性试验中测得。未施加光的情况下，未观察到显著的细胞死亡。该发现证明，pit可以是用于杀伤神经元的有效的治疗，更广义地说，是用于杀伤非癌细胞、包括原代细胞的有效的治疗。
[1050]
由龙沙公司(lonza)(目录号r-edrg-515，龙沙沃克斯维尔公司(lonza walkersville,inc.)，马里兰州沃克斯维尔)以冷冻保存的形式获得大鼠胚胎drg，保存在液氮中直至使用。按照龙沙公司(lonza)的封闭溶液配制和制作方法，将黑壁96孔板用每孔50μl的含有30μg/ml聚-d-赖氨酸(西格玛奥德里奇公司(sigma aldrich)，目录号p0899，密苏里州圣路易斯)和2μg/ml层粘连蛋白(西格玛奥德里奇公司(sigma aldrich)，l2020，密苏里州圣路易斯)的pbs在室温下涂布1小时。将涂布溶液吸除，将板晾干1小时(在生物安全柜中开盖)，立即用于细胞接种。严格按照由龙沙公司(lonza)提供的使用说明书进行细胞的融化和铺板。培养基始终是补充有2mm的l-谷氨酰胺、50μg/ml的庆大霉素、37ng/ml的两性霉素和2％的nsf-1的pnbm，但后者在每次使用前新鲜加入。这些成分是试剂盒(目录号cc-4461，龙沙公司(lonza)，瑞士巴塞尔)的一部分。此外，在使用时也新鲜加入神经生长因子(ngf，目录号n2513，西格玛公司(sigma)，密苏里州圣路易斯)至100ng/ml。为了铺细胞，将0.25ml药瓶融化，用3.75ml的培养基逐滴稀释，并将200μl的混悬液接种至孔中。将细胞在37℃和5％co2下孵育4小时，将培养基换成也含有有丝分裂抑制剂5-氟-2
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脱氧尿苷(7.5μg/ml终浓度，目录号f-0503，西格玛公司(sigma)，密苏里州圣路易斯)和尿苷(17.5μ
irdye 680rd和西妥昔单抗-irdye 700dx+irdye 680rd偶联物对可溶性聚集体形成和荧光漂白显示出不同的敏感性。所提供的数据支持了本发明要求偶联物避光以保证产品制造中的一致性。具体来说，对于抗体-irdye 700dx偶联物之类的大分子irdye 700dx偶联物而言，单体纯度和药理学活性的分数是必需的，变化可对光活化杀伤活性造成显著影响。
[1069]
本发明不局限于本文所述的实施方式的范围，这些描述旨在简单说明本发明的一些方面，任何功能等同的实施方式也在本发明范围内。对本领域技术人员来说，根据上述的说明和启示，本文所描述的组成和方法以外的本发明的组成和方法的各种变化是显而易见的，并且同样意图落入本发明范围内。这种变化或其它实施方式可以在不背离本发明真实范围和构思的情况下实施。
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序列
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