1.本发明涉及天然药物化学技术领域，具体涉及一种黑老虎根提取物及其制备方法与在制备具有舒筋止痛作用的药物中的应用。
背景技术：
2.黑老虎根为南方五味子科植物冷饭团的根及蔓茎；是华南、西南及其邻近地区的常用草药。其具有行气散瘀、通络止痛的作用；主治胃痛、风湿痹痛、跌打损伤、骨折、痛经产后瘀血腹痛等。
3.现代药理实验表明，黑老虎根乙醇提取物其具有镇痛、镇静和抗炎作用；但目前对于黑老虎根镇痛作用的物质基础研究有待进一步加强。如何从黑老虎根乙醇提取物开发出镇痛效果更好的提取物有效部位，甚至是新颖的单体化合物，是本领域技术人仍需继续努力的方向。因此，在现有技术的基础上，进一步开发一种具有更好止痛效果的提取物具有重要的应用价值。
技术实现要素：
4.为了克服现有技术中存在的至少之一的技术问题，本发明首先提供了一种黑老虎根提取物；研究表明，由本发明所述方法制备得到的黑老虎根提取物具有优异的止痛作用。
5.本发明所要解决的上述技术问题，通过以下技术方案予以实现：
6.一种黑老虎根提取物的制备方法，其包含如下步骤：
7.(1)取黑老虎根，然后加入有机溶剂进行提取，提取结束后将提取液进行浓缩干燥，得有机溶剂提取物；
8.(2)将有机溶剂提取物先加水混悬，然后用石油醚进行萃取，接着再用乙酸乙酯萃取；将乙酸乙酯萃取部位浓缩干燥后得乙酸乙酯萃取物；
9.(3)将乙酸乙酯萃取物用制备型hplc进行分离，得黑老虎根提取物。
10.本发明为了开发得到具有更加优异止痛效果的黑老虎根提取物；发明人经大量的实验研究表明，在将乙醇提取物经乙酸乙酯萃取后然后再经制备型hplc制备得到的黑老虎根提取物，其止痛效果远远好于黑老虎根醇提物。
11.优选地，步骤(1)中所述的有机溶剂为体积分数为50％～95％的乙醇水溶液。
12.最优选地，步骤(1)中所述的有机溶剂为体积分数为75％的乙醇水溶液。
13.优选地，所述的提取物是指加热回流提取，提取时间为1～3h；
14.优选地，黑老虎根与有机溶剂的用量比为1g:10～20ml。
15.最优选地，黑老虎根与有机溶剂的用量比为1g:15ml。
16.优选地，步骤(2)中有机溶剂提取物、水、石油醚以及乙酸乙酯的用量比为1g:5～10ml:5～10ml:5～10ml。
17.优选地，步骤(3)中制备型hplc的具体条件为：色谱柱为制备型c18色谱柱，检测波
长为250～300nm；以甲醇和水为流动相进行梯度洗脱；收集洗脱部位即得所述的黑老虎根提取物。
18.优选地，所述的梯度洗脱条件为：以甲醇为流动相a，水为流动相b；0～6min，流动相a的体积变化为0～18％；6～25min，流动相a的体积变化为18～35％；收集18.5～22.8min之间洗脱下来的流份，浓缩干燥后即得所述的黑老虎根提取物。
19.发明人在研究中发现：能否制备得到止痛效果更加优异的黑老虎根提取物，制备型hplc的梯度洗脱条件起着决定性作用，不同的洗脱条件制备得到的黑老虎根提取物的止痛作用差别是巨大的；并不是随意的采用制备型hplc的洗脱制备得到的黑老虎根提取物均具有优异的止痛作用，洗脱条件选择不当不但不能制备得到止痛效果更加优异的黑老虎根提取物，甚至镇痛效果更差或者制备得到得黑老虎根提取物根本不具备镇痛作用。发明人经大量的实验研究表明：在本发明上述制备型hplc的梯度洗脱条件下制备得到的黑老虎根提取物，其止痛作用远远高于黑老虎根醇提物，也远远高于在其它制备型hplc梯度洗脱条件下制备得到的黑老虎根提取物。
20.本发明还提供了一种上述制备方法制备得到的黑老虎根提取物。
21.本发明还提供了一种上述黑老虎根提取物在制备药物中的应用；所述的药物为具有止痛或舒经止痛作用的药物。
22.优选地，所述的药物，其剂型为膏剂。
23.有益效果：本发明提供了一种全新的黑老虎根提取物的制备方法；研究表明将黑老虎根乙醇提取物经乙酸乙酯萃取后再经制备型hplc制备得到的黑老虎根提取物，其止痛效果远远好于黑老虎根醇提物。将由该方法制备得到的黑老虎根提取物用于制备止痛或舒经止痛药物，其效果要好于黑老虎根醇提物。
具体实施方式
24.以下结合具体实施例来进一步解释本发明，但实施例对本发明不做任何形式的限定。
25.实施例1黑老虎根提取物的制备
26.(1)取黑老虎根，然后加入体积分数为75％的乙醇加热至沸腾状态提取2h，提取结束后将提取液进行浓缩干燥，得乙醇提取物；黑老虎根与乙醇的用量比为1g:15ml；
27.(2)将乙醇提取物加水混悬，然后用石油醚进行萃取，接着再用乙酸乙酯萃取；将乙酸乙酯萃取部位浓缩干燥后得乙酸乙酯萃取物；其中，乙醇提取物、水、石油醚以及乙酸乙酯的用量比为1g:8ml:8ml:8ml；
28.(3)将乙酸乙酯萃取物用制备型hplc进行分离；其中，制备型hplc的具体条件为：色谱柱为制备型c18色谱柱，检测波长为280nm；以甲醇为流动相a，水为流动相b；0～6min，流动相a的体积变化为0～18％；6～25min，流动相a的体积变化为18～35％；收集18.5～22.8min之间洗脱下来的流份，浓缩干燥后即得所述的黑老虎根提取物。
29.实施例2黑老虎根提取物的制备
30.(1)取黑老虎根，然后加入体积分数为50％的乙醇加热至沸腾状态提取3h，提取结束后将提取液进行浓缩干燥，得乙醇提取物；黑老虎根与乙醇的用量比为1g:20ml；
31.(2)将乙醇提取物加水混悬，然后用石油醚进行萃取，接着再用乙酸乙酯萃取；将
乙酸乙酯萃取部位浓缩干燥后得乙酸乙酯萃取物；其中，乙醇提取物、水、石油醚以及乙酸乙酯的用量比为1g:5ml:5ml:5ml；
32.(3)将乙酸乙酯萃取物用制备型hplc进行分离；其中，制备型hplc的具体条件为：色谱柱为制备型c18色谱柱，检测波长为280nm；以甲醇为流动相a，水为流动相b；0～6min，流动相a的体积变化为0～18％；6～25min，流动相a的体积变化为18～35％；收集18.5～22.8min之间洗脱下来的流份，浓缩干燥后即得所述的黑老虎根提取物。
33.实施例3黑老虎根提取物的制备
34.(1)取黑老虎根，然后加入体积分数为95％的乙醇加热至沸腾状态提取3h，提取结束后将提取液进行浓缩干燥，得乙醇提取物；黑老虎根与乙醇的用量比为1g:10ml；
35.(2)将乙醇提取物加水混悬，然后用石油醚进行萃取，接着再用乙酸乙酯萃取；将乙酸乙酯萃取部位浓缩干燥后得乙酸乙酯萃取物；其中，乙醇提取物、水、石油醚以及乙酸乙酯的用量比为1g:10ml:10ml:10ml；
36.(3)将乙酸乙酯萃取物用制备型hplc进行分离；其中，制备型hplc的具体条件为：色谱柱为制备型c18色谱柱，检测波长为280nm；以甲醇为流动相a，水为流动相b；0～6min，流动相a的体积变化为0～18％；6～25min，流动相a的体积变化为18～35％；收集18.5～22.8min之间洗脱下来的流份，浓缩干燥后即得所述的黑老虎根提取物。
37.对比例1黑老虎根提取物的制备
38.取黑老虎根，然后加入体积分数为75％的乙醇加热至沸腾状态提取2h，提取结束后将提取液进行浓缩干燥，得乙醇提取物即所述的黑老虎根提取物；黑老虎根与乙醇的用量比为1g:15ml；
39.对比例2黑老虎根提取物的制备
40.(1)取黑老虎根，然后加入体积分数为75％的乙醇加热至沸腾状态提取2h，提取结束后将提取液进行浓缩干燥，得乙醇提取物；黑老虎根与乙醇的用量比为1g:15ml；
41.(2)将乙醇提取物加水混悬，然后用石油醚进行萃取，接着再用乙酸乙酯萃取；将乙酸乙酯萃取部位浓缩干燥后得乙酸乙酯萃取物；其中，乙醇提取物、水、石油醚以及乙酸乙酯的用量比为1g:8ml:8ml:8ml；
42.(3)将乙酸乙酯萃取物用制备型hplc进行分离；其中，制备型hplc的具体条件为：色谱柱为制备型c18色谱柱，检测波长为280nm；以甲醇为流动相a，水为流动相b；0～6min，流动相a的体积变化为0～18％；6～25min，流动相a的体积变化为18～35％；收集14.5～18.5min之间洗脱下来的流份，浓缩干燥后即得所述的黑老虎根提取物。
43.对比例2与实施例1的区别在于，制备型hplc梯度洗脱条件不同；对比例2是收集14.5～18.5min之间洗脱下来的流份，而实施例1则是收集18.5～22.8min之间洗脱下来的流份。
44.对比例3黑老虎根提取物的制备
45.(1)取黑老虎根，然后加入体积分数为75％的乙醇加热至沸腾状态提取2h，提取结束后将提取液进行浓缩干燥，得乙醇提取物；黑老虎根与乙醇的用量比为1g:15ml；
46.(2)将乙醇提取物加水混悬，然后用石油醚进行萃取，接着再用乙酸乙酯萃取；将乙酸乙酯萃取部位浓缩干燥后得乙酸乙酯萃取物；其中，乙醇提取物、水、石油醚以及乙酸乙酯的用量比为1g:8ml:8ml:8ml；
47.(3)将乙酸乙酯萃取物用制备型hplc进行分离；其中，制备型hplc的具体条件为：色谱柱为制备型c18色谱柱，检测波长为280nm；以甲醇为流动相a，水为流动相b；0～6min，流动相a的体积变化为0～18％；6～25min，流动相a的体积变化为18～35％；收集10～14min之间洗脱下来的流份，浓缩干燥后即得所述的黑老虎根提取物。
48.对比例3与实施例1的区别在于，制备型hplc梯度洗脱条件不同；对比例3是收集10～14min之间洗脱下来的流份，而实施例1则是收集18.5～22.8min之间洗脱下来的流份。
49.对比例4黑老虎根提取物的制备
50.(1)取黑老虎根，然后加入体积分数为75％的乙醇加热至沸腾状态提取2h，提取结束后将提取液进行浓缩干燥，得乙醇提取物；黑老虎根与乙醇的用量比为1g:15ml；
51.(2)将乙醇提取物加水混悬，然后用石油醚进行萃取，接着再用乙酸乙酯萃取；将乙酸乙酯萃取部位浓缩干燥后得乙酸乙酯萃取物；其中，乙醇提取物、水、石油醚以及乙酸乙酯的用量比为1g:8ml:8ml:8ml；
52.(3)将乙酸乙酯萃取物用制备型hplc进行分离；其中，制备型hplc的具体条件为：色谱柱为制备型c18色谱柱，检测波长为280nm；以甲醇为流动相a，水为流动相b；0～30min，流动相a的体积恒定为35％；收集18.5～22.8min之间洗脱下来的流份，浓缩干燥后即得所述的黑老虎根提取物。
53.对比例4与实施例1的区别在于，制备型hplc梯度洗脱条件不同；对比例4的条件为等梯度洗脱条件，即：0～30min，流动相a的体积恒定为35％；收集18.5～22.8min之间洗脱下来的流份；而实施例1的条件为：0～6min，流动相a的体积变化为0～18％；6～25min，流动相a的体积变化为18～35％；收集18.5～22.8min之间洗脱下来的流份。
54.对比例5黑老虎根提取物的制备
55.(1)取黑老虎根，然后加入体积分数为75％的乙醇加热至沸腾状态提取2h，提取结束后将提取液进行浓缩干燥，得乙醇提取物；黑老虎根与乙醇的用量比为1g:15ml；
56.(2)将乙醇提取物加水混悬，然后用石油醚进行萃取，接着再用乙酸乙酯萃取；将乙酸乙酯萃取部位浓缩干燥后得乙酸乙酯萃取物；其中，乙醇提取物、水、石油醚以及乙酸乙酯的用量比为1g:8ml:8ml:8ml；
57.(3)将乙酸乙酯萃取物用制备型hplc进行分离；其中，制备型hplc的具体条件为：色谱柱为制备型c18色谱柱，检测波长为280nm；以甲醇为流动相a，水为流动相b；0～30min，流动相a的体积恒定为25％；收集18.5～22.8min之间洗脱下来的流份，浓缩干燥后即得所述的黑老虎根提取物。
58.对比例5与实施例1的区别在于，制备型hplc梯度洗脱条件不同；对比例5的条件为等梯度洗脱条件，即：0～30min，流动相a的体积恒定为25％；收集18.5～22.8min之间洗脱下来的流份；而实施例1的条件为：0～6min，流动相a的体积变化为0～18％；6～25min，流动相a的体积变化为18～35％；收集18.5～22.8min之间洗脱下来的流份。
59.对比例6黑老虎根提取物的制备
60.(1)取黑老虎根，然后加入体积分数为75％的乙醇加热至沸腾状态提取2h，提取结束后将提取液进行浓缩干燥，得乙醇提取物；黑老虎根与乙醇的用量比为1g:15ml；
61.(2)将乙醇提取物加水混悬，然后用石油醚进行萃取，接着再用乙酸乙酯萃取；将乙酸乙酯萃取部位浓缩干燥后得乙酸乙酯萃取物；其中，乙醇提取物、水、石油醚以及乙酸
乙酯的用量比为1g:8ml:8ml:8ml；
62.(3)将乙酸乙酯萃取物用制备型hplc进行分离；其中，制备型hplc的具体条件为：色谱柱为制备型c18色谱柱，检测波长为280nm；以甲醇为流动相a，水为流动相b；0～6min，流动相a的体积变化为0～15％；6～25min，流动相a的体积变化为15～30％；收集18.5～22.8min之间洗脱下来的流份，浓缩干燥后即得所述的黑老虎根提取物。
63.对比例6与实施例1的区别在于，制备型hplc梯度洗脱条件不同；对比例6的条件为：0～6min，流动相a的体积变化为0～15％；6～25min，流动相a的体积变化为15～30％；收集18.5～22.8min之间洗脱下来的流份；而实施例1的条件为：0～6min，流动相a的体积变化为0～18％；6～25min，流动相a的体积变化为18～35％；收集18.5～22.8min之间洗脱下来的流份。
64.对比例7黑老虎根提取物的制备
65.(1)取黑老虎根，然后加入体积分数为75％的乙醇加热至沸腾状态提取2h，提取结束后将提取液进行浓缩干燥，得乙醇提取物；黑老虎根与乙醇的用量比为1g:15ml；
66.(2)将乙醇提取物加水混悬，然后用石油醚进行萃取，接着再用乙酸乙酯萃取；将乙酸乙酯萃取部位浓缩干燥后得乙酸乙酯萃取物；其中，乙醇提取物、水、石油醚以及乙酸乙酯的用量比为1g:8ml:8ml:8ml；
67.(3)将乙酸乙酯萃取物用制备型hplc进行分离；其中，制备型hplc的具体条件为：色谱柱为制备型c18色谱柱，检测波长为280nm；以甲醇为流动相a，水为流动相b；0～6min，流动相a的体积变化为0～10％；6～25min，流动相a的体积变化为10～35％；收集18.5～22.8min之间洗脱下来的流份，浓缩干燥后即得所述的黑老虎根提取物。
68.对比例7与实施例1的区别在于，制备型hplc梯度洗脱条件不同；对比例6的条件为：0～6min，流动相a的体积变化为0～10％；6～25min，流动相a的体积变化为10～35％；收集18.5～22.8min之间洗脱下来的流份；而实施例1的条件为：0～6min，流动相a的体积变化为0～18％；6～25min，流动相a的体积变化为18～35％；收集18.5～22.8min之间洗脱下来的流份。
69.实验例小鼠热板止痛实验
70.取km小鼠，放入55℃的热板上，观察小鼠舔足所需时间(即痛阈值)；选取舔足所需时间在15s
±
1s的小鼠作为实验对象。实验分为对照组和实验组，每组20只；实验组小鼠每日早中晚在小鼠脚掌和后腿部位涂抹含有实施例1～3或对比例1～7制备得的黑老虎根提取物的植物油(黑老虎根提取物的质量分数为3％)；对照组不做任何处理；连续涂抹三天后，将小鼠再次放到55℃的热板上测试小鼠舔足所需时间(即痛阈值)。实验结果见表1；其中小鼠舔足所需时间(即痛阈值)的时间越长，说明止痛效果越好。
71.表1.本发明黑老虎根提取物止痛效果测试
[0072] 痛阈值对照组15.2s
±
0.6s实施例1制备得到的黑老虎根提取物34.6s
±
2.5s实施例2制备得到的黑老虎根提取物30.1s
±
1.8s实施例3制备得到的黑老虎根提取物32.5s
±
1.8s对比例1制备得到的黑老虎根提取物20.4s
±
0.8s
对比例2制备得到的黑老虎根提取物18.1s
±
0.6s对比例3制备得到的黑老虎根提取物17.5s
±
0.7s对比例4制备得到的黑老虎根提取物19.7s
±
1.0s对比例5制备得到的黑老虎根提取物21.3s
±
1.2s对比例6制备得到的黑老虎根提取物23.4s
±
1.6s对比例7制备得到的黑老虎根提取物22.7s
±
1.3s
[0073]
从表1实验数据可以看出，实施例1～3制备得到的黑老虎根提取物其痛阈值远远大于对比例1以及对照组；这说明：将乙醇提取物经乙酸乙酯萃取后然后再经本发明所述的制备型hplc梯度洗脱条件制备得到的黑老虎根提取物，其止痛效果远远好于黑老虎根醇提物；具有十分显著的止痛效果。
[0074]
从表1实验数据可以看出，对比例2～4制备的得到的黑老虎根提取物，其痛阈值要小于对比例1；对比例5～7制备的得到的黑老虎根提取物，其痛阈值与对比例1相比提高的不明显，且远远小于实施例1～3。这说明：能否制备得到止痛效果更加优异的黑老虎根提取物，制备型hplc的洗脱条件起着决定性作用，不同的洗脱条件制备得到的黑老虎根提取物的止痛作用差别是巨大的；并不是随意的采用制备型hplc的洗脱制备得到的黑老虎根提取物均具有优异的止痛作用，洗脱条件选择不当不但不能制备得到止痛效果更加优异的黑老虎根提取物，甚至镇痛效果更差。上实验效果表明：在本发明所的制备型hplc的梯度洗脱条件下制备得到的黑老虎根提取物，其止痛效果要远远好于在其它制备型hplc梯度洗脱条件下制备得到的黑老虎根提取物；并且只有在本发明所的制备型hplc的梯度洗脱条件下制备得到的黑老虎根提取物，才能大幅提高黑老虎根醇提物的止痛效果，才具有更加优异的止痛效果；而在其它制备型hplc的洗脱条件下制备得到的黑老虎根提取物并不能大幅提高黑老虎根醇提物的止痛效果，并不具有十分优异的止痛效果。