一种多孔块状异种骨修复材料的极短流程免煅烧制备方法

1.本发明属于一种生物医学材料的制备方法，具体涉及一种多孔块状异种骨修复材料的极短流程免煅烧制备方法。


背景技术：

2.目前，外伤、肿瘤、炎症以及老龄化引起的骨组织缺损是目前临床医学亟待解决的难题，而骨移植是临床医生治疗骨不连、骨缺损以及进行关节融合的重要手段。理想的骨修复材料一般需要具备良好的生物相容性、合适的孔隙率、良好的骨诱导性和骨传导性、较好的力学性能以及良好的降解性和合适的降解速率。
3.骨修复材料一般可分为自体骨、同种异体骨、人工合成骨和异种骨。自体骨不会发生免疫排斥反应且成骨效果最好，但来源有限。同种异体骨存在一定疾病传播的概率和免疫原性风险。人工合成骨安全且产量丰富，但其骨传导性和诱导性较低。异种骨因其来源丰富且具有天然三维多孔结构和一定的成骨诱导性受到广泛关注，但由于其抗原与人体差别较大，直接植入会产生严重免疫反应。
4.制备异种骨修复材料的目的是去除异种骨中脂肪、蛋白质、细胞等有机成分，保留三维多孔的骨基质支架。目前使用频率最高的方法是高温煅烧法和化学溶液浸泡法。煅烧法是指将异种骨原料在高于300℃的温度下加热，通过碳化、氧化作用彻底去除异种骨中的有机质，但其脆性较大，并且高温会使异种骨的结晶度上升，使其生物活性和降解性降低，这种变化在600℃～700℃以上时最为显著。化学溶液浸泡法中常用于脱脂脱蛋白溶液有三氯甲烷、甲醇、乙醚、丙酮等有机溶剂，这些溶剂均有毒有害，清洗不彻底会产生一定的细胞毒性，植入人体后易引发炎症、畸形等不良反应，有的甚至会致癌，因此通常需要进行长时间多次的清洗，生产周期较长。
5.目前已有多种异种骨移植材料实现了商品化，例如骨粉是瑞士geistlich公司研发的一种以牛骨为生物来源完全脱脂脱蛋白的骨移植材料，其具体的制备工艺没有公开说明，但可知的是生产过程中不涉及高温处理，应为化学溶液浸泡工艺，所得人工骨结晶度低、co
32-含量高，因而相比其他高温煅烧的异种骨移植材料具有更高的生物活性。
6.aarthy等人(aarthy s，thenmuhil d，dharunya g，et al.exploring the effect of sintering temperature on naturally derived hydroxyapatite for bio-medical applications[j].journal of materials science materials in medicine，2020，30(2)：21-27.)发现将山羊骨粉压坯在1100℃～1400℃烧结时，随着煅烧温度升高，样品硬度增加，但晶粒尺寸增大，结晶度升高，其生物活性和降解性愈加偏离骨缺损修复的使用要求。
[0007]
曹凯等人(曹凯，舒勇，韩智敏，等.过氧化氢-乙醚法制备脱蛋白骨的理化性质研究[j].南昌大学学报(医学版)，2008，48(1)：5-8.)使用过氧化氢-乙醚溶液处理大白兔干骺端松质骨，处理后的兔松质骨蛋白脱除彻底，但乙醚是一种有毒溶剂，一定程度上具有引
起细胞毒性和免疫炎症的风险。
[0008]
barakat等人(barakat n a m，khalil k a，sheikh f a，et al.physiochemical characterizations of hydroxyapatite extracted from bovine bones by three different methods：extraction of biologically desirable hap[j].materials science and engineering：c，2008，28(8)：1381-1387.)将牛皮质骨使用丙酮和乙醚浸泡，再将其与25％的naoh溶液在250℃下进行碱热处理得到异种骨骨粉。但因制备过程中涉及了丙酮和乙醚这两种有毒溶剂，后续需要对制备出的骨粉进行长时间数次的清洗，生产周期近一个月。
[0009]
南京航空航天大学的武鑫在申请号为cn201810203907.6的专利中提出一种多孔块状异种骨修复材料的制备方法，在传统化学溶液浸泡法的基础上进行改进，将哺乳动物的松质骨经过氧化氢溶液和强碱溶液处理后，再与碱性液体和去离子水在反应釜中进行多次碱热、水热处理，最后再进行低温煅烧和辐照灭菌。过程中未使用有毒有害溶剂，但制备过程繁琐，处理周期在一周左右，骨块抗压强度较低。且其中的低温煅烧工序在一定程度上也会增加材料的脆性，并导致结晶度升高，生物活性降低。


技术实现要素：

[0010]
发明目的：本发明的目的在于提供一种多孔块状异种骨修复材料的极短流程免煅烧制备方法，该方法步骤简单、无有毒溶剂、无需煅烧参与且能得到低结晶度、高co
32-含量的抗压强度高的多孔块状异种骨修复材料。
[0011]
技术方案：本发明所述的多孔块状异种骨修复材料的极短流程免煅烧制备方法，该制备方法包括以下步骤：
[0012]
(1)用水冲洗块状松质骨，然后再用水反复超声清洗，直至无可见骨髓、神经组织；
[0013]
(2)将清洗后的松质骨用过氧化氢溶液浸泡，完成后取出用水进行超声清洗；
[0014]
(3)使用强碱溶液处理过氧化氢溶液浸泡后的松质骨，处理完成后取出用水进行超声清洗；
[0015]
(4)将步骤(3)处理后的松质骨与弱碱性溶液置于承压密闭容器中，在120～240℃下保温1～6小时，冷却降至室温；
[0016]
(5)将承压密闭容器中的松质骨取出，用水反复进行超声清洗，清洗后干燥，得到所述多孔块状异种骨修复材料。
[0017]
所述的多孔块状异种骨修复材料的极短流程免煅烧制备方法，步骤(1)中，所述块状松质骨的体积为0.1～10cm3。
[0018]
所述的多孔块状异种骨修复材料的极短流程免煅烧制备方法，步骤(1)中，所述用水冲洗是用高压水枪冲洗。
[0019]
所述的多孔块状异种骨修复材料的极短流程免煅烧制备方法，步骤(2)中，所述过氧化氢溶液的质量分数为10％～50％，松质骨与过氧化氢溶液体积比为1∶20～1∶60，浸泡时间为4～16小时。
[0020]
所述的多孔块状异种骨修复材料的极短流程免煅烧制备方法，步骤(3)中，所述强碱溶液为氢氧化钠或氢氧化钾以及它们的混合溶液，溶液浓度为0.25mol/l～1mol/l，样品与溶液体积比为1∶20～1∶60，浸泡时间为6～48小时。
[0021]
所述的多孔块状异种骨修复材料的极短流程免煅烧制备方法，步骤(4)中，所述弱碱性溶液为碳酸氢钠溶液、碳酸钠溶液、碳酸氢钾溶液、碳酸钾溶液中的一种或几种的混合溶液，溶液ph为7.5～9.5，松质骨与弱碱性溶液体积比为1∶20～1∶60。
[0022]
所述的多孔块状异种骨修复材料的极短流程免煅烧制备方法，步骤(4)中，所述承压密闭容器为反应釜。
[0023]
所述的多孔块状异种骨修复材料的极短流程免煅烧制备方法，在所述步骤(5)中，超声清洗时长为5～20min，直至清洗后的水ph＜7.5，清洗后干燥温度为30～60℃，干燥时长为4～24小时。
[0024]
多孔块状异种骨修复材料，该多孔块状异种骨修复材料由所述的制备方法制得。
[0025]
本发明的块状松质骨可取自常见的哺乳动物，如猪、牛、羊、马、兔等。
[0026]
有益效果：本发明与现有技术相比，具有如下优点：(1)本发明中所需原料价格低廉且来源广泛，生产成本低，制备过程所用到的设备简单，步骤简便，生产周期极短，适合大批量生产。(2)制备过程中无有毒溶剂参与，不会产生细胞毒性。(3)制备出的骨修复材料呈现与人骨相似的天然多孔结构，抗压强度高。(4)制备过程不涉及高温处理，得到的骨修复材料晶粒尺寸及结晶度低于骨粉。(5)制备出的骨修复材料中co
32-未被破坏，掺杂方式为a型、b型混合掺杂，生物活性和降解性更高，成分与人骨更为接近。(6)本发明优化了碱热处理工艺，并在碱热处理后引入超声清洗工序，可省去多道水热和煅烧处理工序。在保证了制品质量的前提下，用浸泡+碱热+超声清洗工艺取代了多道次碱热+水热+低温煅烧工艺，工艺步骤极大简化，生产周期大幅缩短，生产效率极大提高，且制备过程无有毒溶剂参与，得到的异种骨修复材料保留了完整的天然多孔结构，抗压强度较高，保持在0.4mpa以上，骨块有机物脱除彻底，结晶度低而co
32-含量高，可用于口腔颌面外科骨缺损的修复。
附图说明
[0027]
图1为使用本发明方法制备的多孔块状异种骨修复材料的宏观图片；
[0028]
图2为使用本发明方法制备的多孔块状异种骨修复材料的扫描电子显微镜图片；
[0029]
图3为使用本发明方法(不同参数)制备的多孔块状异种骨修复材料的孔隙率；
[0030]
图4为使用本发明方法(不同参数)制备的多孔块状异种骨修复材料的抗压强度；
[0031]
图5为使用本发明方法制备的多孔块状异种骨修复材料以及骨粉的x射线衍射曲线；
[0032]
图6为使用本发明方法(不同参数)制备的多孔块状异种骨修复材料的x射线衍射曲线；
[0033]
图7为使用本发明方法制备的多孔块状异种骨修复材料以及骨粉的傅里叶变换红外光谱图；
[0034]
图8为使用本发明方法(不同参数)制备的多孔块状异种骨修复材料的傅里叶变换红外光谱图；
[0035]
图9为使用本发明方法(不同参数)制备的多孔块状异种骨修复材料以及骨粉的n元素及co
32-含量。
具体实施方式
[0036]
实施例1
[0037]
步骤一：松质骨的提取及预处理
[0038]
1)将市场上购买来的成年牛脊椎在关节处切开，用医用小刀将骨上粘连的肉与筋膜去除并清洗干净擦干备用；
[0039]
2)使用锯骨机去除脊椎骨中皮质骨及筋膜部分，剩下的松质骨部位选择成分均匀处切割成20mm
×
20mm
×
20mm的块状；
[0040]
3)使用高压水枪对切割后的块状松质骨进行冲洗，初步去除松质骨内部可见的血管、骨髓、神经等组织，然后再用去离子水进行超声清洗20分钟，反复清洗三遍以上，清洗完成后保存于4℃的冰箱中备用。
[0041]
步骤二：初步去抗原松质骨制备
[0042]
1)将预处理后骨块与40％过氧化氢溶液一起放入烧杯中，在25℃恒温避光环境下浸泡8小时，浸泡完成后取出用去离子水进行超声清洗，每次20分钟，重复三次；
[0043]
2)配制0.75mol/l氢氧化钠溶液，将经过氧化氢溶液处理后的松质骨样品与氢氧化钠溶液一起放入烧杯中，在25℃恒温环境下浸泡12小时，浸泡完成后取出用去离子水进行超声清洗，每次20分钟，多次重复直至清洗液ph＜7.5，清洗完成后保存于4℃的冰箱中备用。
[0044]
步骤三：多孔块状异种骨修复材料的制备
[0045]
1)配制碳酸钠溶液，ph为9～9.2；
[0046]
2)将初步去抗原松质骨样品与碳酸钠溶液一起放入反应釜中在200℃下进行碱热处理，料液比1∶50，碱热溶液不超过反应釜体积的三分之二，处理时间5小时。
[0047]
3)反应釜冷却至室温后取出松质骨用去离子水超声清洗，每次20分钟，多次重复至清洗液ph＜7.5，清洗后在60℃下烘干24小时即得到所述多孔块状异种骨修复材料，宏观图片见图1，显微镜图片见图2。
[0048]
孔隙率测试：
[0049]
1)在室温条件下，称取样品的重量为m1；
[0050]
2)将样品置于体积为v0的去离子水中，并连烧杯一起放入超声清洗机中处理15分钟，功率设定为80％，将松质骨孔隙中的空气完全排出，此时记烧杯中水的体积为v1；
[0051]
3)将样品从烧杯中取出，用无尘布小心擦拭表面的水分，称取重量为m2，从而可根据式1得到样品的孔隙率，每次测5个样品，取平均值。
[0052]
式1：
[0053]
式中，ε为材料孔隙率，ρ为水的密度，取ρ＝1g/cm3。
[0054]
如图3所示，最终测得实施例1样品平均孔隙率为74.11％。合适的孔隙率和孔径大小有利于于细胞的粘附与增殖、血管和神经的长入、细胞代谢产物的排出以及营养和氧气的交换。目前对于骨移植材料最合适的孔隙率还没有定论，但一般认为孔隙率在65％～80％的骨移植材料植入人体后更容易使骨组织和血管长入，并且材料的比表面积更高，生物降解性也更好。
[0055]
抗压强度测试：
[0056]
选用sans-cmt5105型号的万能试验机对样品的抗压强度进行测试。开始测试前先
将样品置于万能试验机平台上，端部保证平整，骨小梁生长方向与平台垂直，机器向下施加垂直压力，测试过程中横梁移动速度为0.5mm/s，变形测量精度为0.01mm，每组测试5个样品，样品抗压强度按照式2计算。
[0057]
式2：
[0058]
式中，σb为样品抗压强度(mpa)；
[0059]fmax
为最大破坏载荷(n)；
[0060]
a为样品初始横截面积(mm2)。
[0061]
如图4所示，最终测得实施例1样品平均抗压强度为0.52mpa。在进行骨缺损修复时，针对不同的缺损部位，其强度也有不同的要求。申请号为cn201810203907.6的专利制得的多孔块状异种骨修复材料虽保留松质骨三维结构，但强度遭到严重破坏，脆性较大，对其进行抗压强度测试，平均抗压强度约为0.1mpa。而本发明所制备的骨修复材料在彻底去除有机物的同时，保留了松质骨完整的三维多孔结构和更高的抗压强度。
[0062]
x射线衍射分析：
[0063]
使用ultima iv型x射线衍射仪对样品和进行分析，采用cu靶，扫描角度为5
°
～90
°
，扫描速度为5
°
/min，测试完成后将得到的xrd图谱与标准卡片对比。
[0064]
实施例1样品的x射线衍射曲线见图5，经与标准卡片jcpds9-432对比确定为纯羟基磷灰石，与骨粉曲线对比，实施例1样品峰强更低而峰宽更宽，可以判断其晶粒尺寸和结晶度均小于骨粉。
[0065]
傅里叶变换红外光谱分析：
[0066]
使用magna-ir550型傅里叶变换红外光谱分析仪来对样品的基团和成分进行分析。将kbr与待测样品以1∶100的比例混合研磨并烘干，装入模具并用压片机压片，然后将得到的薄片放入红外光谱分析仪中进行测试。波数范围为500cm-1
～4000cm-1
，将得到的图谱与标准图谱比较以确定样品的成分与分子结构。
[0067]
实施例1样品的红外光谱图见图7，通过与羟基磷灰石图谱对比发现出现了明显的羟基磷灰石特征峰，1401cm-1
～1486cm-1
之间co
32-的吸收谱带出现明显分裂，呈现两个吸收峰，它区别于碳酸盐中的单峰，是co
32-进入羟基磷灰石的重要标志，证明了经过碱热处理后的松质骨样品中的co
32-并未被分解，成分与骨磷灰石更为接近。
[0068]
n含量及co
32-含量检测：
[0069]
1)使用kn680型凯氏定氮仪对样品中n元素残留量进行检测；
[0070]
2)使用cs844型碳硫分析仪对样品中c元素的含量进行检测，从而得出和co
32-的含量。
[0071]
本发明较cn201810203907.6的专利改进了测量n元素的仪器设备，最终检测结果如图9所示，实施例1样品的n元素含量为0.11％低于(0.16％)，表明蛋白质类有机物去除干净，而co
32-含量为6.66％高于(6.03％)，co
32-含量高时，造成的晶格畸变使得羟基磷灰石的结晶度较低，溶解度较高，生物活性和降解性更好。
[0072]
实施例2
[0073]
步骤一：松质骨的提取及预处理
[0074]
4)将市场上购买来的成年猪脊椎在关节处切开，用医用小刀将骨上粘连的肉与筋
膜去除并清洗干净擦干备用；
[0075]
5)使用锯骨机去除脊椎骨中皮质骨及筋膜部分，剩下的松质骨部位选择成分均匀处切割成15mm
×
15mm
×
15mm的块状；
[0076]
6)使用高压水枪对切割后的块状松质骨进行冲洗，初步去除松质骨内部可见的血管、骨髓、神经等组织，然后再用去离子水进行超声清洗15分钟，反复清洗三遍以上，清洗完成后保存于4℃的冰箱中备用。
[0077]
步骤二：初步去抗原松质骨制备
[0078]
3)将预处理后骨块与30％过氧化氢溶液一起放入烧杯中，在25℃恒温避光环境下浸泡12h，浸泡完成后取出用去离子水进行超声清洗，每次15分钟，重复三次；
[0079]
4)配制0.25mol/l氢氧化钾溶液，将经过氧化氢溶液处理后的松质骨样品与氢氧化钾溶液一起放入烧杯中，在25℃恒温环境下浸泡48小时，每12小时更换氢氧化钾溶液，浸泡完成后取出用去离子水进行超声清洗，每次15分钟，多次重复直至清洗液ph＜7.5，清洗完成后保存于4℃的冰箱中备用。
[0080]
步骤三：多孔块状异种骨修复材料的制备
[0081]
1)配制碳酸氢钾溶液，调节溶液ph为8.8～9；
[0082]
2)将初步去抗原松质骨样品与碳酸氢钾溶液一起放入反应釜中在160℃下进行碱热处理，料液比1∶20，碱热溶液不超过反应釜体积的三分之二，处理时间3小时。
[0083]
3)反应釜冷却至室温后取出松质骨用去离子水超声清洗，每次15min，多次重复至清洗液ph＜7.5，清洗后在60℃下烘干24小时即得到所述多孔块状异种骨修复材料。
[0084]
孔隙率测试：
[0085]
操作步骤同实施例1，如图3所示，最终测试平均孔隙率为69.78％。
[0086]
抗压强度测试：
[0087]
操作步骤同实施例1，如图4所示，最终测试平均抗压强度为0.43mpa。
[0088]
x射线衍射分析：
[0089]
操作步骤同实施例1，衍射曲线见图6。
[0090]
傅里叶变换红外光谱分析：
[0091]
操作步骤同实施例1，红外光谱图见图8。
[0092]
n含量及co
32-含量检测：
[0093]
操作步骤同实施例1，如图9所示，n元素含量为0.14％，co
32-含量为6.78％。
[0094]
实施例3
[0095]
步骤一：松质骨的提取及预处理
[0096]
7)将市场上购买来的成年羊脊椎在关节处切开，用医用小刀将骨上粘连的肉与筋膜去除并清洗干净擦干备用；
[0097]
8)使用锯骨机去除脊椎骨中皮质骨及筋膜部分，剩下的松质骨部位选择成分均匀处切割成8mm
×
8mm
×
8mm的块状；
[0098]
9)使用高压水枪对切割后的块状松质骨进行冲洗，初步去除松质骨内部可见的血管、骨髓、神经等组织，然后再用去离子水进行超声清洗30分钟，反复清洗三遍以上，清洗完成后保存于4℃的冰箱中备用。
[0099]
步骤二：初步去抗原松质骨制备
[0100]
5)将预处理后骨块与20％过氧化氢溶液一起放入烧杯中，在25℃恒温避光环境下浸泡14小时，浸泡完成后取出用去离子水进行超声清洗，每次10分钟，重复三次；
[0101]
6)配制0.5mol/l氢氧化钠溶液，将经过氧化氢溶液处理后的松质骨样品与氢氧化钠溶液一起放入烧杯中，在25℃恒温环境下浸泡24小时，每12小时更换氢氧化钠溶液，浸泡完成后取出用去离子水进行超声清洗，每次10分钟，多次重复直至清洗液ph＜7.5，清洗完成后保存于4℃的冰箱中备用。
[0102]
步骤三：多孔块状异种骨修复材料的制备
[0103]
4)配制饱和碳酸氢钠溶液，溶液ph为8.3；
[0104]
5)将初步去抗原松质骨样品与饱和碳酸氢钠溶液一起放入反应釜中在220℃下进行碱热处理，料液比1∶40，碱热溶液不超过反应釜体积的三分之二，处理时间2小时。
[0105]
6)反应釜冷却至室温后取出松质骨用去离子水超声清洗，每次10分钟，多次重复至清洗液ph＜7.5，清洗后在60℃下烘干24小时即得到所述多孔块状异种骨修复材料。
[0106]
孔隙率测试：
[0107]
操作步骤同实施例1，如图3所示，最终测试平均孔隙率为72.46％。
[0108]
抗压强度测试：
[0109]
操作步骤同实施例1，如图4所示，最终测试平均抗压强度为0.47mpa。
[0110]
x射线衍射分析：
[0111]
操作步骤同实施例1，衍射曲线见图6。
[0112]
傅里叶变换红外光谱分析：
[0113]
操作步骤同实施例1，红外光谱图见图8。
[0114]
n含量及co
32-含量检测：
[0115]
操作步骤同实施例1，如图9所示，n元素含量为0.1％，co
32-含量为6.43％。