一种敲低circXPO1的抑制剂及其在制备治疗胶质瘤药物中的应用

一种敲低circxpo1的抑制剂及其在制备治疗胶质瘤药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及分子诊断技术领域，特别涉及一种敲低circxpo1的抑制剂及其在制备治疗胶质瘤药物中的应用。


背景技术：

2.人类胶质细胞瘤(glioma)是中枢神经系统中最常见的原发型恶性肿瘤，占所有恶性原发性脑和中枢神经系统肿瘤的80％。根据组织学形态和分子特征，2016年世界卫生组织(who)重新将胶质细胞瘤分为i-iv型，其中，i型和ii型常被称为低等级胶质细胞瘤(low-grade glioma，lgg)，iii型和iv型包括胶质母细胞瘤(gbm)、间变性星形细胞瘤和间变性少突胶质细胞瘤。由于胶质瘤对药物具有极大耐受性、复发率较高并且严重影响患者的生活质量，相应地也极大地缩短了病人的生存时间，所以iii型和iv型胶质瘤常常被当作研究对象。低等级胶质瘤发病率较低，只占胶质瘤总数的15％，切除、放射性治疗、化学药物治疗等临床治疗方法均有较好的治疗效果，预后较佳，具有十年以上生存期的患者约占47％。恶性胶质细胞瘤是恶性程度极高的脑肿瘤之一，虽然总人口发病率仅为5.55/10万，但患者存活率只有三分之一，未作干预的患者存活时间仅为三个月，治疗后的存活时间为12-15个月，且最长不超过五年。
3.环状rna(circrna)是一类由mrna前体反向剪接产生的共价闭合环状的编码rna，没有3'聚腺苷酸尾巴和5'帽子结构，通常比其同源线性mrna更加稳定，不受rna外切酶影响，其表达具有时间和组织特异性，因此是良好的生物标志物候选分子。circrna分为三类：外显子circrna(ecircrna)，由一个或多个外显子经过反向剪接形成；内含子circrna(cirna)，由内含子形成；外显子-内含子circrna(eicirna)既包括外显子也包括内含子。circrna在多种疾病中差异性表达，并参与生理和病理生理过程的调节。circrnas主要通过结合mirna使其下游靶基因免受mirna降解、结合rna结合蛋白(rbp)、或者通过rna-pol ii调节转录和翻译肽和蛋白质，参与中枢神经系统相关疾病以及肿瘤等过程。circrna生成和功能的研究涉及到了肺癌、乳腺癌、骨肉瘤、胶质瘤等肿瘤领域的方方面面。因此，circrna可以作为治疗肿瘤的手段，进一步推动相关领域的发展。
4.目前研究报道circxpo1的表达与骨肉瘤、肺腺癌、前列腺癌的发生有关，尚未有其对恶性胶质瘤的相关作用的报道。经过我们的长期研究发现circxpo1的抑制剂可以作为一种活性物质，对恶性胶质瘤有一定的治疗作用。


技术实现要素：

5.本发明的第一个目的是针对现有技术的不足，提供一种利用shrna敲低的circxpo1在制备治疗胶质瘤药物或保健品中的应用，shrna的核苷酸序列由正义链和反义链组成：
6.正义链的苷酸序列如seq id no.2所示：5
’‑
gatccgtgcgaagtaatctatgccagccttc
ctgtcagagctggcatagattacttcgcactttttg-3’；
7.反义链的苷酸序列如seq id no.3所示：5
’‑
aattcaaaaagtgcgaagtaatctatgccagctctgacaggaaggctggcatagattacttcgcacg-3’。
8.所述circxpo1基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
9.作为优选，所述胶质瘤为胶质瘤细胞u-87mg或胶质瘤细胞u251。
10.本发明的第二个目的是提供一种利用shrna敲低的circxpo1在制备胶质母细胞瘤活性抑制剂中的应用。
11.本发明的第三个目的是提供一种治疗胶质瘤药物，包括利用shrna敲低的circxpo1。
12.作为优选，所述药物的剂型为医学上认可的任何一种剂型。
13.作为优选，还包括药学上可接受的载体。
14.本发明的第四个目的是提供一种用于敲除circxpo1的抑制剂shrna，干扰circxpo1表达的情况下能够抑制神经胶质瘤的生长，为临床上治疗胶质瘤，提供了一个新的解决方法。所述抑制剂抑制circxpo1的表达，以降低所述circxpo1的表达产物的水平。
15.为了探究circxpo1在神经胶质瘤发生发展中的作用，本发明根据circxpo1的拼接位点设计了一对shrna，利用转染试剂将shrna和scramble(阴性对照)利用慢病毒包装的方法感染u87-mg和u251细胞系来敲低circxpo1的表达。感染72小时收集细胞，利用实时荧光定量pcr技术检测circxpo1的表达水平以检测shrna的转染效率，发现设计的shrna能显著抑制circxpo1的表达水平，并可以抑制神经胶质瘤的活性、增殖和迁移。同时circxpo1的过表达可以促进神经胶质瘤的细胞活性、增殖和迁移等，因此circxpo1对于治疗胶质细胞瘤具有重要的意义。
附图说明
16.图1为circxpo1的环状结构和sanger测序；(a)circxpo1的环状结构及形成示意图，(b)sanger测序结果的峰图，(c)rt-pcr检测circxpo1环状结构及引物特异性，(d)qrt-pcr检测rnase r处理后的circxpo1，(e)qrt-pcr检测rnase r处理后的xpo1的表达水平。
17.图2为circxpo1在正常组织和神经胶质瘤组织及gbm细胞系中的表达水平；(a)qrt-qpcr检测circxpo1在正常脑组织(normal brain)、低级别胶质瘤(lgg)和高级别胶质瘤(gbm)中的表达水平，(b)qrt-qpcr检测circxpo1在u87-mg细胞和u251细胞中表达水平。
18.图3为qrt-pcr检测胶质瘤细胞系中circxpo1的shrna的敲低效率；(a)为circxpo1-sh处理后circxpo1表达水平的变化，(b)为circxpo1-sh处理后xpo1表达水平的变化。
19.图4为cck-8检测circxpo1-sh处理后对u87-mg和u251细胞活性的影响。
20.图5为免疫荧光检测circxpo1-sh处理后对u87-mg和u251的细胞增殖的影响。
21.图6为划痕实验检测circxpo1-sh处理后对u87-mg和u251细胞划痕愈合能力的影响。
22.图7为qrt-pcr检测胶质瘤细胞系中circxpo1的过表达效率。
23.图8为过表达circxpo1后对u87-mg和u251细胞生长、增殖和迁移的影响；(a)为cck-8检测过表达circxpo1后对u87-mg和u251的细胞活力的影响，(b)为免疫荧光检测过表
达circxpo1后对u87-mg和u251的细胞增殖的影响，(c)为过表达circxpo1后对u87-mg和u251细胞划痕愈合能力的影响。
具体实施方式
24.以下结合具体实施方式对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
25.实施例1：sanger测序及rnase r处理证明形成的是环状rna
26.一、实验方法
27.1、rt-pcr获得circxpo1
28.提取gbm细胞系(即u87-mg、u251细胞)总rna，采用trizol试剂(thermofisher scientific)，逆转录后用于rt-pcr分析。引物如(表1)所示。
29.rt-pcr体系：
30.为了证明circxpo1形成的是环状rna而非线性的，将rt-pcr产物回收，送公司进行sanger测序，将测序结果用dnastar软件进行比对。结果显示，circxpo1确实是由母基因xpo1的2、3、4号外显子头尾相接环化形成(图1a、b、c)。
31.2、为了确认circxpo1的环状结构，通过用核酸外切酶(rnase r)处理来评估其稳定性。结果表明，circxpo1对rnase r有抵抗性(图1d)，而xpo1则被rnase r降解消化了(图1e)。综上所述，circxpo1是一种环状且稳定的转录本。
32.表1 circxpo1和xpo1的pcr及qpcr引物序列
[0033][0034]
实施例2：circxpo1在正常组织和神经胶质瘤组织及gbm细胞系中的表达
[0035]
一、实验方法：
[0036]
1、荧光定量pcr检测circxpo1在正常组织和神经胶质瘤组织及gbm细胞系中的表达
[0037]
提取神经胶质瘤组织及gbm细胞系(即u87-mg、u251细胞)总rna，采用trizol试剂(thermo fisher scientific)用于荧光定量pcr(qrt-pcr)分析。扩增反应由cfx96实时pcr检测系统完成(bio-rad公司，hercules，ca，美国)根据操作规范使用sybr green荧光定量
pcr试剂盒。对于circxpo1和xpo1引物(表1)所示，使用法计算相关基因的表达。所有的qrt-pcr实验重复三次，所有的数据使用gapdh作为对照。
[0038]
qrt-pcr体系：
[0039]
二、实验结果
[0040]
分析circxpo1在正常脑组织、低级别胶质瘤组织样品、高级别神经胶质瘤组织样品及相关细胞系(u87-mg和u251)中的表达情况。qrt-pcr结果表明，在高级别gbm组织(图2a)以及几个gbm衍生的细胞系如u87-mg和u251中(图2b)，circxpo1表达上调。
[0041]
实施例3：在u87-mg和u251细胞中使用shrna抑制circxpo1表达
[0042]
一、实验方法
[0043]
1、scramble，circxpo1-sh质粒(gfp共表达)的构建：用的是最常用的干扰质粒构建方法，通过内切酶(biolabs)，酶切shrna序列和p greenpuro载体(生工)，用t4连接酶(碧云天)连接构成质粒。
[0044]
病毒液获得方法：(1)取2个1.5ml离心管，加入30μldmem，30μlfectin(thermofisher)。(2)另取2个1.5ml离心管，加入60μldmem，0.75μgpspax2包装质粒，0.25μg pmd2.g包装质粒，分别加入1μg scramble，circxpo1-sh干扰质粒，然后与步骤(1)离心管的溶液混合，静置20分钟后，分别加入在含10％胎牛血清的dmem培养基中培养的293t细胞液中，24、48小时后，分别取培养液上清。
[0045]
用带有scramble和circxpo1-sh的病毒液感染u87-mg和u251细胞，待在荧光显微镜下观察到细胞感染效率为90％以上后可进行后续实验。
[0046]
2、采用qrt-pcr的方法检测circxpo1-sh的高低效果。
[0047]
qrt-pcr体系：
[0048]
提取scramble和circxpo1-sh感染后的u87-mg和u251细胞得总rna，采用trizol试剂(thermo fisher scientific)用于实时定量pcr(qrt-pcr)分析。扩增反应由cfx96实时pcr检测系统完成(bio-rad公司，hercules，ca，美国)根据操作规范使用sybr green荧光定量pcr试剂盒。对于circxpo1和xpo1引物如(表1)所示，使用法计算相关基因的表达。所有的qrt-pcr实验重复三次，所有的数据使用gapdh作为对照。
[0049]
二、实验结果
[0050]
利用qrt-pcr技术检测circxpo1的表达水平以检测shrna的高低效率，确认
circxpo1-sh下调circxpo1的表达，p value小于0.05。(见图4a)。同时qrt-pcr检测发现shirna并未敲低线性xpo1的表达(见图4b)，说明shrna是特异性敲低circxpo1的表达。
[0051]
实施例4:circxpo1的抑制对gbm细胞活力的影响
[0052]
一、实验方法
[0053]
1、cck-8
[0054]
根据实施例3方法一中的慢病毒感染胶质瘤细胞系(u87-mg和u251)后，将含10％胎牛血清的dmem培养基配置100μl的胶质瘤细胞按照(u87-mg和u251)按照2000个/孔传至96孔板中。分为scramble组和circxpo1-sh组，将培养板在培养箱中37℃、co2浓度5％条件下孵育一段适当的时间(0-7天)，在第1,3,5,7天固定时间对scramble和circxpo1-sh培养板弃去培养基换成含有10％cck8的dmem培养基。将培养板在培养箱内孵育1小时。用酶标仪测定在450nm处的吸光度(od值)。
[0055]
二、实验结果
[0056]
在gbm细胞系u87-mg和u251中检测了circxpo1对gbm细胞活力的影响，发现circxpo1-sh的干扰显著抑制u87-mg和u251细胞活力(图4a)。
[0057]
实施例5:brdu标记法及ki-67染色法分析circxpo1的抑制对gbm细胞增殖的影响
[0058]
一、实验方法
[0059]
1、brdu标记法及ki-67染色法
[0060]
(1)细胞样品的准备：根据实施例3方法一中的慢病毒感染胶质瘤细胞系(u87-mg和u251)
[0061]
(2)加入终浓度为90g/l的brdu(5－溴脱氧尿嘧啶核苷)，于37℃环境中孵育2小时。培养基孵育2小时后，弃培养基，pbs清洗细胞2次，每次5分钟。
[0062]
(3)细胞固定：每孔加入200μl细胞固定液(4％多聚甲醛)室温孵育30分钟，弃固定液。pbs清洗3次，每次5分钟。
[0063]
(4)hcl固定：向步骤2的培养孔中每孔加入足以覆盖细胞的2m的hcl水溶液，于37℃环境中孵育20分钟后，pbs清洗3次，每次5分钟。
[0064]
(5)封闭：用5％的羊血清室温封闭1小时。
[0065]
(6)孵育一抗、二抗：一抗(小鼠brdu单抗和兔ki-67单抗)孵育4℃过夜，pbs洗涤3次后，孵育二抗(goat-anti-mouse igg1(r1),594和goat-anti-rabbitigg,633)1小时，在二抗孵育结束前5分钟按照体积比1:10000的比例加入dapi(4',6－二脒基－2－苯基吲哚)，pbs清洗三次。荧光显微镜下拍照。
[0066]
二、实验结果
[0067]
利用brdu标记法及ki-67染色法检测circxpo1在gbm细胞系(u87-mg和u251)中对gbm细胞增殖的影响，发现circxpo1-sh显著抑制u87-mg和u251细胞中brdu阳性的细胞和ki-67阳性的细胞，及显著抑制u87-mg和u251细胞的增殖(图5)。
[0068]
实施例6:circxpo1干扰对gbm细胞迁移能力的影响。
[0069]
一、实验方法
[0070]
1、细胞迁移实验
[0071]
根据实施例3方法一中的慢病毒感染胶质瘤细胞系(u87-mg和u251)后，待细胞汇合度至80％左右时，更换无血清培养基，细胞血清饥饿24小时后用小号枪头进行划痕实验，
pbs清洗2遍洗去漂浮的细胞，加入无血清的培养基。
[0072]
2、拍照观察
[0073]
在显微镜下每隔24小时对划痕部位拍照，并对划痕宽度进行统计分析。
[0074]
二、实验结果
[0075]
通过伤口愈合测定来研究circxpo1抑制对gbm细胞的迁移的影响。发现circxpo1-sh显著抑制u87-mg和u251细胞的迁移(图6)。
[0076]
实施例7:qrt-pcr检测circxpo1的过表达效果
[0077]
一、实验方法
[0078]
1、载体质粒构建
[0079]
vector，circxpo1-oe质粒(gfp共表达)的构建：用的是最常用的过表达质粒构建方法，通过内切酶(thermo)酶切plc5-cir载体(吉赛生物公司)，用t4连接酶(碧云天)连接构成质粒。将circxpo1全长序列克隆进plc5-cir质粒空载。
[0080]
2、病毒液获得方法
[0081]
(1)取2个1.5ml离心管，加入30μldmem，30μlfectin(thermofisher)。(2)另取2个1.5ml离心管，加入60μl dmem，0.75μg pspax2包装质粒，0.25μg pmd2.g包装质粒，分别加入1μg vector，circxpo1-oe质粒，然后与步骤(1)离心管的溶液混合，静置20分钟后，分别加入在含10％胎牛血清的dmem培养基中培养的293t细胞液中，24、48小时后，分别取培养液上清。用带有vector和circxpo1-oe的病毒液感染u87-mg和u251细胞，待在荧光显微镜下观察到细胞感染效率为90％以上后可进行后续实验。
[0082]
3、采用qrt-pcr的方法检测circxpo1-oe的过表达效果。
[0083]
qrt-pcr体系：
[0084]
提取vector和circxpo1-oe感染后的u87-mg和u251细胞得总rna，采用trizol试剂(thermo fisher scientific)用于实时定量pcr(qrt-pcr)分析。扩增反应由cfx96实时pcr检测系统完成(bio-rad公司，hercules，ca，美国)根据操作规范使用sybr green荧光定量pcr试剂盒。对于circxpo1和xpo1引物如(表1)所示，使用法计算相关基因的表达。所有的qrt-pcr实验重复三次，所有的数据使用gapdh作为对照。
[0085]
二、实验结果
[0086]
利用qrt-pcr技术检测circxpo1的表达水平以检测circxpo1的过表达效率，确认circxpo1-oe上调circxpo1的表达，p value小于0.05。(如图7)。
[0087]
实施例8：过表达circxpo1对gbm细胞活性、增殖和迁移能力的影响。
[0088]
一、实验方法
[0089]
根据实施例4、5、6的方法检测circxpo1对gbm细胞活性、增殖和迁移能力的影响。
[0090]
二、实验结果
[0091]
利用cck-8、brdu标记法、ki-67染色法和划痕实验检测过表达circxpo1对gbm细胞活性、增殖和迁移能力的影响，结果表明过表达circxpo1可以显著提高gbm细胞活性如(图8a)、促进细胞增殖如(图8b)和迁移如(图8c)。