一种包含葡聚糖和小分子透明质酸钠的皮下组织填充剂及其在美容产品中的用途的制作方法

1.本发明属于化妆品技术领域，具体涉及一种包含葡聚糖和小分子透明质酸钠的皮下组织填充剂及其在美容产品中的用途。


背景技术：

2.面部年轻化作为整形外科中的重要探索方向，一直是整个行业发展的重点领域，为此也探索出多种整形手术方式改善面部皱纹和皮肤凹陷。近年来基于材料科学的快速发展，组织工程学和再生医学得到了快速发展，而各类材料也充分影响各个医学领域。医疗美容作为近十年内快速发展的医疗学科，带来的经济效益不可低估，而填充类材料是与医疗美容邻域最注重的方向之一。
3.透明质酸钠(ha)材料在过去十年中受到广泛应用，在面部注射整形中展现出较好的填充效果。但ha在注射过程中也同样伴随着血管栓塞、丁达尔现象和需要定期注射等各种短板。针对这样的不足之处，相关研究及生产企业通过增加交联的程度来增加ha在皮下组织的弹性模量(参见，例如，li j,guan s,su j,et al.the developmentof hyaluronic acids used for skin tissue regeneration[j].currdrug deliv,2021,18(7):836-46)。但经过十余年的研究后，ha 材料本身的潜能已经被充分发掘，为此急需一种新的替代材料来优化或改良ha的不足。
[0004]
葡聚糖作为一种来自于植物和藻类的多糖类物质，在促进烧伤创面愈合、促进毛发生长和代血浆等多种用途广泛应用。基于对ha的相关研究和随着组织工程学与再生医学的发展，发明了葡聚糖透明质酸钠凝胶微球等材料，已在多个实验中被用于膀胱镜下作为黏膜植入填充剂治疗膀胱输尿管反流等疾病，起到了相比于单纯注射透明质酸钠凝胶更好的疗效。且经过研究发现，葡聚糖交联后该材料性质更稳定，可以在简单的搅拌后维持稳定的粒度大小。但是，葡聚糖透明质酸钠凝胶微球存在制备工艺复杂，价格昂贵，容易引起不良反应等缺陷，且目前尚无将葡聚糖透明质酸钠凝胶微球用于皮下组织填充剂方面的报道。
[0005]
本发明人首次尝试将葡聚糖和小分子透明质酸钠复合物用于皮下组织填充，进而开发出了一种安全、有效、使用方便的皮下组织填充剂美容产品，填补了相关领域的空白。


技术实现要素：

[0006]
本发明克服了目前市场上单纯透明质酸皮下组织填充材料存在的缺陷，提供了一种一种安全、有效、使用方便的包含葡聚糖和小分子透明质酸钠皮下组织填充剂及其在美容产品中的用途。
[0007]
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
[0008]
在第一个方面中，本发明提供了一种皮下组织填充剂，所述皮下组织填充剂包含葡聚糖和小分子透明质酸钠，其中在所述皮下组织填充剂中，ha起溶液作用将葡聚糖均匀
悬浮于其中，使两者结合形成稳定内植入材料。
[0009]
作为可选的方式，在上述皮下组织填充剂中，所述葡聚糖和所述小分子透明质酸钠的重量比为5：1-1：5。
[0010]
优选地，所述葡聚糖和所述小分子透明质酸钠的重量比为5：1、 4：1、3：1、2：1、1：1、1：2、1：3、1：4或1：5。
[0011]
作为可选的方式，在上述皮下组织填充剂中，所述小分子透明质酸钠的分子量小于1万道尔顿。
[0012]
作为可选的方式，在上述皮下组织填充剂中，所述皮下组织填充剂由注射用葡聚糖复合物和注射用小分子透明质酸钠凝胶制成。
[0013]
作为可选的方式，在上述皮下组织填充剂中，所述葡聚糖复合物由葡聚糖和多肽制成。优选地，所述多肽包含胶原肽。
[0014]
作为可选的方式，在上述皮下组织填充剂中，所述葡聚糖复合物由葡聚糖、胶原肽、棕榈酰五肽和乙酰基四肽制成。
[0015]
作为可选的方式，在上述皮下组织填充剂中，所述皮下组织填充剂由心辰葡聚多肽金舱和心辰精舱注射用透明质酸钠凝胶制成。
[0016]
作为可选的方式，在上述皮下组织填充剂中，所述心辰葡聚多肽金舱和所述心辰精舱注射用透明质酸钠凝胶的体积比为5：1-1：1。
[0017]
优选地，所述心辰葡聚多肽金舱和所述心辰精舱注射用透明质酸钠凝胶的体积比为5：1、4：1、3：1、2：1或1：1。
[0018]
更优选地，所述心辰葡聚多肽金舱和所述心辰精舱注射用透明质酸钠凝胶的体积比为3：1。
[0019]
作为可选的方式，所述葡聚糖和小分子透明质酸钠直接作为混合物在所述皮下组织填充剂中，或者，在使用前将所述葡聚糖和所述小分子透明质酸钠用三通管混合对冲制成所述皮下组织填充剂。
[0020]
例如，将3ml注射用葡聚糖复合物(如心辰葡聚多肽金舱)与 1ml注射用小分子透明质酸钠凝胶(如心辰精舱注射用透明质酸钠凝胶)在室温下充分混合至质地均匀，以获得所述皮下组织填充剂。
[0021]
在第二个方面中，本发明提供了上述第一个方面所述的皮下组织填充剂在美容产品中的用途。
[0022]
作为可选的方式，在上述用途中，所述美容产品用于改善组织轮廓缺陷，使皮肤下陷区域恢复。
[0023]
作为可选的方式，在上述用途中，所述美容产品用于面部皮肤填充，以改善面部皱纹、凹陷和疤痕。
[0024]
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0025]
本发明人首次将葡聚糖和小分子透明质酸钠复合物用于皮下组织填充，进而开发出了一种安全、有效、使用方便的皮下组织填充剂美容产品，填补了相关领域的空白。实验结果表明，本发明包含葡聚糖和小分子透明质酸钠的皮下组织填充剂于大鼠皮下组织中再生能力和皮下组织中支撑能力优于单纯注射葡聚糖复合物或透明质酸钠，且未见明显不良并发症发生。
附图说明
[0026]
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
[0027]
图1：材料注射入大鼠深部皮下组织28天后肉眼观。其中，图1a左侧为小分子透明质酸钠注射部位；图1a右侧为葡聚糖复合物注射部位；图1b为交联透明质酸钠注射部位；图1c为小分子透明质酸钠和葡聚糖复合物混合配方注射部位。
[0028]
图2：植入28天深部皮下组织背面肉眼观。其中：图2a左侧为葡聚糖复合物注射部位；图2a右侧为小分子透明质酸钠注射部位；图2b左侧为小分子透明质酸钠和葡聚糖复合物混合配方注射部位；图2b右侧为交联透明质酸钠注射部位。
[0029]
图3：注射用小分子透明质酸钠凝胶he染色镜下观。其中，图 3a为7天组；图3b为14天组；图3c为28天组。
[0030]
图4：注射用葡聚糖复合物he染色镜下观。其中，图4a为7天组；图4b为14天组；图4c为28天组。
[0031]
图5：注射用交联透明质酸钠凝胶he染色镜下观。其中，图5a 为7天组；图5b为14天组；图5c为28天组。
[0032]
图6：注射用葡聚糖复合物和小分子透明质酸钠复合物he染色镜下观。其中，图6a为7天组；图6b为14天组；图6c为28天组。
具体实施方式
[0033]
下面参照具体的实施例对本发明做进一步说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明的范围。
[0034]
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买得到的常规产品。
[0035]
下面实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售产品。
[0036]
实施例：
[0037]
考察葡聚糖和小分子透明质酸钠复合物对深部皮下组织学的影响
[0038]
1.材料与方法
[0039]
1.1主要实验材料
[0040]
注射材料主要包括注射用葡聚糖复合物(商品名：心辰葡聚多肽金舱，3ml：30000u)(广州小蛮腰医疗器械有限公司)，主要成分为葡聚糖，辅以多肽类物质；注射用小分子透明质酸钠凝胶(商品名：心辰精舱注射用透明质酸钠凝胶，1ml)(广州小蛮腰医疗器械有限公司)，主要成分为低交联度透明质酸钠凝胶；注射用交联透明质酸钠凝胶(商品名：舒颜，1ml)，主要成分为注射用交联透明质酸钠凝胶。注射用葡聚糖复合物和小分子透明质酸钠复合物配置方法为3 ml葡聚糖复合物溶液与注射用小分子透明质酸钠凝胶1ml室温下充分混合至质地均匀。
[0041]
1.2动物模型
[0042]
选取spf级wistar大鼠9只，周龄6周，体重200
±
20g。分笼饲养，维持饲养条件为室
温(25
±
2)℃，维持相对湿度(50
±
5)％， 12h明暗交替，自由摄食、饮水，根据分组结果(详见1.3.2)饲养分别7天、14天和28天。
[0043]
1.3实验方法
[0044]
1.3.1实验设计
[0045]
取实验大鼠9只随机分组后，按照注射部位规定间隔距离选择大鼠背部两侧深部皮下组织进行注射，根据各注射部位分别注入不同交联剂或纯实验试剂。根据试验周期分别于7天、14天和28天进行各指标观察及检测，观察各项植入物与周围组织的相容性、排异性、胶原增生能力和引起的免疫反应，评估各项植入物在不同植入时间段的变化情况。
[0046]
1.3.2实验分组
[0047]
将符合实验标准的spf级wistar大鼠9只按照体重顺序编号，根据随机数生成将大鼠随机分为3组，每组3只。三组大鼠为t1、 t2和t3组，对应饲养周期分别为7天、14天和28天，以验证不同时间长度的各项材料在大鼠深部皮下组织的变化过程。
[0048]
1.3.3注射方式及取材方式
[0049]
大鼠于术前12小时禁食，4小时禁饮，称重后根据体重采用7％水合氯醛(0.03ml/kg体重)进行腹腔注射麻醉。麻醉妥当后对大鼠背部局部注射部位皮肤进行备皮，按照无菌原则用75％医酒精擦拭局部进行常规消毒。注射部位进针点间距大于3cm，利用36g注射针头斜面朝上刺入表皮，直至皮下组织深层(进针深度约1cm)，回抽无血液后进行注射，每个部位注射剂量为1ml，注射后予以适度按摩。
[0050]
按照实验分组部分将大鼠分为t1、t2、t3组，分别常规饲养7 天、14天和28天后，采用脊髓脱臼法处死大鼠。剔除大鼠背部毛发，对75％酒精消毒后的注射区域用手术刀切开皮肤全层，蚊式钳钝性分离注射材料局部团块及周围组织，用组织剪剪取残余的皮下组织。取下的组织样本先用相机拍照，记录整体形态。
[0051]
1.3.4局部组织he染色
[0052]
将生理盐水清洗过后的皮肤组织标本浸泡于4％多聚甲醛中固定24小时，流水缓慢冲洗4-8小时以洗去固定用甲醛。将包埋块放入70％乙醇过夜后，依次置入80％、90％、100％a和100％b乙醇溶液浸泡各1小时。二甲苯溶液a和二甲苯溶液b各浸泡30min，直至组织块呈现棕黄色或暗红色透明状，置入60℃水浴机石蜡缸a、b、 c各1.5小时。包埋块和包埋模具放入包埋仪b中至少30min。用莱卡切片机切片厚度为4μm，45℃下摊片，烤片机75℃烤片60min。
[0053]
将石蜡切片放入染色盒，用二甲苯a、b、c各脱蜡5min(可根据实际情况适当延长脱蜡时间以使组织上的蜡完全脱掉为止)。用 100％、95％、80％、70％每次5min，入蒸馏水2次，每次5min。苏木素溶液染核1min后流水冲洗干净，0.1％盐酸酒精分化10s，入蒸馏水放置10min。0.5％伊红溶液染色1min后流水冲洗干净，入蒸馏水3min，取出玻片放在通风橱里晾干。用中性树胶对晾干的组织切片进行封片。对取出组织进行编号，在光学显微镜下观察组织样本 1.3.5检测指标及观察
[0054]
①
一般情况
[0055]
大鼠经常规饲养，观察大鼠日常行为习惯和进食水等有无异常，注射后动态观察上述行为是否发生改变，观察背部皮肤注射区域皮肤隆起情况，观察局部毛发生长情况，有无皮肤破溃、水肿、红斑等不良反应发生。
[0056]
②
肉眼及显微镜下观察
[0057]
大鼠处死并取出皮下组织标本后，肉眼观察染色后的植入材料的形态及分布情况。将标本玻片放置于光学显微镜(40x)下进行观察，并采集图片。仔细观察标本周围新生血管细胞生成情况、周围组织炎性细胞浸润情况、注射材料随时间延长后的均匀度及形态变化情况。根据镜下观察到结果做好记录并采集关键图片。
[0058]
2.结果
[0059]
2.1大鼠生长情况
[0060]
小分子透明质酸钠注射部位(图1a左侧)28天后大鼠背部注射部位皮肤表面可见一处隆起，肉眼下与周围组织无明显分界。皮肤表面未见明显红肿，局部无溃疡或流脓破溃。可触及深部皮下组织一类圆形质韧团块状，与周围组织紧密相连，活动度有限且不易推动，材料团块周围皮温与正常皮肤部位未有明显差异。葡聚糖复合物注射部位(图1a右侧)28天后在大鼠背部肉眼下未见明显团块状占位，未见明显红肿等炎性表现，皮肤无流脓破溃。可触及深部皮下组织质地变韧，程度相较7天及14天组实验显著增厚，变韧部位与周围皮肤无明显分界，皮温与周围组织相同。交联透明质酸钠注射部位(图 1b)28天后在大鼠背部肉眼观下可见注射局部一处隆起，周围皮肤未见明显红肿或脓点等炎性病变。触及质地稍韧，与周围组织连接紧密，活动度低且不易推动。局部团块体积相较7天和14天实验组呈进行性减小，皮温同周围皮肤。小分子透明质酸钠和葡聚糖复合物混合配方注射部位(图1c)28天后于大鼠背部肉眼观下可见一占位性团块，与周围组织无明显分界，无明显红肿，无脓点。深压触摸过程中可触及团块边缘，质地稍软，体积相较14天组大鼠稍有回落，与周围组织无明显分界，不易推动，表面光滑。团块表面皮温与周围组织相同。
[0061]
2.2植入物皮下生长情况
[0062]
小分子透明质酸钠注射部位(图2a右侧)28天后可见一处扁平片状团块，已被周围组织严密包裹，周围组织血管未见明显新生与扩张。注射团块与周围组织紧密相连，无明显分界，注射材料体积较前进行性减小。葡聚糖复合物注射部位(图2a左侧)28天后可见材料团块与周围深部组织紧密相连，有模糊分界。团块周围局部可见血管包裹，周围组织质地变韧，体积较前无明显变化。交联透明质酸钠注射部位(图2b右侧)28天后可见材料团块局部占位显著，与周围组织分界清楚，周围血管未见明显新生与扩张。材料团块体积较前进行性减小，但减小程度较轻。小分子透明质酸钠和葡聚糖复合物混合配方注射部位(图2b左侧)28天后可见团块与周围组织紧密相连，周围毛细血管包绕，与周围组织模糊分界。周围组织质地变韧，体积较前变化不明显。
[0063]
2.3葡聚糖和透明质酸钠复合物he染色镜下观
[0064]
如图3a-3c所示，光镜下可见，注射小分子透明质酸钠7天组大鼠深部皮下组织内有显著免疫细胞聚集，无明显组织坏死或感染灶，透明质酸钠团块在染色中易被冲洗造成脱失。14天实验组可在皮下组织内清晰见到团块占位，周围组织胶原和腺体增生活跃，材料与周围组织交界部位形成质密囊状包裹，质密包裹层及周围组织中免疫细胞浸润明显，团块中间部位在染色过程中脱失。28天组可见透明质酸钠团块囊状包裹层较前进行性增厚，中间部位仍有材料脱失。形成与团块伴行的新生血管网，周围组织胶原及腺体增生更加活跃，免疫细胞数量较前明显减少。
[0065]
如图4a-4c所示，镜下可见葡聚糖复合物注射7天组深部皮下组织多种免疫细胞浸
润，腺体增生活跃，未见明显感染坏死征象。14 天实验组可见深部皮下组织内胶原增生较前增加，周围组织中巨噬细胞、中性粒细胞和成纤维细胞富集，胶原层进行性增厚，伴有毛囊结构增生。28天实验组可见深部皮下组织胶原及腺体增生活跃，伴有较多新生血管穿插于其中，免疫细胞数量较前明显下降。
[0066]
如图5a-5c所示，注射交联透明质酸钠7天后，镜下可见深部皮下组织免疫细胞聚集，未见明显感染坏死灶。14天实验组可见材料团块形成质密囊状包裹，囊壁包裹层及周围相连皮下组织免疫细胞浸润明显，厚度较薄，团块中心部位材料因水流冲洗所致材料脱失明显。 28天实验组可在皮下组织内见到透明质酸钠材料团块占位，内部间隔处已可观察到均匀胶原生成所致红染，局部可见新生小血管生成。
[0067]
如图6a-6c所示，注射葡聚糖复合物和小分子透明质酸钠复合物 7天后皮下组织可见显著免疫细胞聚集，未见明显感染坏死或脓肿形成。14天组可见材料团块于深部组织下附着紧密，材料内部免疫细胞广泛浸润，稍有染色过程中洗脱，脱失程度明显少于其他对照材料。周围组织内同样有免疫细胞富集，伴有显著毛囊结构增生，胶原蛋白、腺体和新生血管增生。28天实验组见材料团块内部间隔处已可观察到胶原生成所致红染，局部可见新生小血管生成，形成与团块伴行的周围新生血管网。周围组织胶原及腺体增生更加活跃，免疫细胞数量较前明显减少。
[0068]
3.结论和讨论
[0069]
本实验通过单纯注射两种不同交联度的透明质酸钠凝胶和单纯注射葡聚糖复合物作为研究对照，同时对比注射低交联度的透明质酸钠和葡聚糖复合物作为实验对象，控制变量下在不同的时间点观察材料在大鼠皮下组织的变化。研究可以观测到，实验时间为7天时，各注射部位均未见明显的感染或坏死情况，免疫细胞开始在各项植入物的周围聚集。总体来说各项植入物产生的再生过程因时间较短，没有观察到显著的区别。
[0070]
实验时间为14天时可以观察到各项植入物的显著区别，其中小分子透明质酸钠(心辰精舱注射用透明质酸钠凝胶)团块在he染色下可以观察到，材料与团块周围紧密相连的成纤维细胞及其形成纤维包裹，为材料不易扩散及位移提供了力学上的支撑，弹性模量仅次于交联透明质酸钠材料，且周围已经开始形成新生血管包绕。到了28 天时材料团块已经开始经过脱水和透明质酸酶代谢，体积显著减小，但弹性模量较前未有显著变化。
[0071]
同样的纤维包裹在交联透明质酸钠中也有表现，但其形成的厚度更厚，材料团块的弹性模量高于本次实验的其他材料。体积相较于小分子透明质酸钠而言，28天后交联透明质酸钠体积少量减小，考虑与材料的交联程度相关。
[0072]
单纯注射葡聚糖复合物(心辰葡聚多肽金舱)表现出最低的弹性模量，相比于其他其占位填充作用的注射材料，其再生过程时间较长，且自身再生胶原成为为主，弹性模量无法比拟透明质酸钠。但其引起腺体活跃和胶原显著再生，较于各类透明质酸钠更加明显，且实验组观测到葡聚糖复合物对毛发再生的影响明显。
[0073]
在混合葡聚糖(心辰葡聚多肽金舱)和小分子透明质酸钠(心辰精舱注射用透明质酸钠凝胶)复合配方材料中，14天表现出相较于另外两种透明质酸钠更好的再生能力，且团块内部浸润的成纤维细胞已浸及深部。直至28天时间均未见到透明质酸钠材料类似的脱失过程，经过染色后可观察到材料团块内已开始形成均匀红染，考虑与胶原及纤维增生相关。混合配方材料表现出葡聚糖复合物的相似再生能力的特点，同时也有透明质酸钠优异的支
撑能力。
[0074]
上述混合配方展现出较多优势，其原因根据实验结果有多种推测，主要以两种材料各自优势互相结合的同时，ha起溶液作用将葡聚糖均匀悬浮于其中，使两者结合形成稳定内植入材料。对于免疫细胞浸润于植入材料中的程度与材料弹性模量增加有强相关性，考虑成纤维细胞引起的胶原增生在材料团块内部中也有发生，通过本次实验已经可以明显观测到胶原蛋白及纤维生成过程发生于材料团块内部。葡聚糖与小分子透明质酸钠复合配方材料体积总体未见明显回落，其原因在配置葡聚糖溶液过程中使用生理盐水予以溶解，后混以透明质酸钠注射入皮下组织。伴随葡聚糖溶液的脱水代谢过程，同一时间透明质酸钠吸水特性使注射团块本身体积不易产生较大变化，组织占位能力相较无明显回落过程，周围组织无需代偿明显的水肿或脱水作用。该组合配方同时展现出其他配方或材料不具备的精确增生特性，主要表现在解剖观下材料团块本身与周围组织紧密相连，不易被推动。并且葡聚糖与小分子透明质酸钠复合配方材料在支撑能力强的前提下，与周围组织的连接部位并不会表现出凹陷或明显的交界，这与材料团块周围的胶原增生有关。最后，葡聚糖与小分子透明质酸钠复合配方材料不仅在周围组织促进胶原生成，且对比7天和14天组实验，周围组织有更多的新生血管包绕，因葡聚糖能刺激包括血管生成因子在内的多种细胞因子。故可以推断周围血管数量的增加与材料团块本身有显著的相关性，混合配方能够促进周围血管增生及胶原再生。
[0075]
综上所述，葡聚糖与小分子透明质酸钠复合配方材料于大鼠皮下组织中再生能力和皮下组织中支撑能力优于单纯注射葡聚糖复合物或透明质酸钠，且未见明显不良并发症发生。
[0076]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。