一种DNA-Ag@Pd双金属纳米簇的制备方法及其用途

一种dna-ag@pd双金属纳米簇的制备方法及其用途
技术领域
1.本发明涉及一种dna-ag@pd双金属纳米簇的制备方法及其用途，属于纳米生物医学技术领域。


背景技术：

2.近年来，多模式治疗为实现肿瘤诊疗一体化提供了可能。nir-ii光热治疗可以通过nir-ii激光触发进行高效的光热治疗，而且由于光热效应对肿瘤部位温度的提升可以促进催化h2o2分解、提高
·
oh的产率，达到nir-ii光热治疗/化学动力学协同增强治疗的目的。金属纳米簇(ncs)是由几个到几百个金属原子组成的一种新型的极小尺寸的纳米材料，近些年由于其优异的物理和化学特性而受到极大的关注。dna分子由于具有易修饰、碱基配对可编程性、良好的生物相容性和靶向性等优势已作为稳定配体参与到金属纳米簇的合成及组装中，即能够高效地调控金属纳米簇的合成，以形成dna模板化的金属纳米簇。由于dna 模板化的金属纳米簇结合了金属纳米簇优异的光电性能、催化活性以及dna分子良好的生物相容性和靶向性，使其在生物传感和肿瘤治疗应用中具有重要意义。另一方面，由于单金属纳米材料的影响，dna模板化的纳米簇在光热治疗和光声成像方面应用受限，且极小尺寸的贵金属纳米材料的光声应用狭窄。但伴随着近些年双金属及多金属纳米簇被广泛研究，实现以dna模板化的双金属纳米簇用于肿瘤的多模式成像治疗是很有研究价值的。


技术实现要素：

3.发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明采用dna作为模板设计合成 ag@pd双金属纳米簇，通过核酸序列的设计可以赋予dna功能化的ag@pd ncs (dna-ag@pd ncs)肿瘤靶向功能，结合其nir-ii光热/化学动力学协同增强治疗可以实现精确肿瘤治疗的目的。
4.一种dna-ag@pd双金属纳米簇的制备方法，其包括如下步骤：
5.s1、将dna模板链加入到柠檬酸盐缓冲液中，混匀后，加入硝酸银，避光孵育；
6.s2、在步骤s1中得到的产物中加入na2pdcl4溶液，混匀后，在低温下，加入新制的nabh4溶液，进行还原反应；
7.s3、将步骤s2得到的产物进行避光孵育后，进行离心分离，收集上清液，得到所述dna-ag@pd双金属纳米簇。
8.作为优选方案，所述柠檬酸盐缓冲液的ph值为7.0，dna模板链和柠檬酸盐的摩尔比为1:400。
9.作为优选方案，步骤s1中的孵育温度为4℃。
10.作为优选方案，步骤s2中所述的低温为4℃。
11.作为优选方案，步骤s3中的孵育温度为4℃。
12.一种由前述的制备方法得到的dna-ag@pd双金属纳米簇。
13.一种如前述的dna-ag@pd双金属纳米簇在光热材料中的用途。如可作为具有光热治疗功能的纳米试剂，具有良好的光热性能、化学动力学特性。
14.本发明中的原料均市售可得。
15.其中nabh4、agno3购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。na2pdcl4购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。柠檬酸盐缓冲溶液购自浙江联硕生物科技有限公司。dna购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
16.本发明中的dna模板化的银@钯核壳纳米簇相对于传统的金属纳米簇材料，由于dna分子具有易修饰、碱基配对可编程性、良好的生物相容性和靶向性等优势，作为稳定配体参与到金属纳米簇的合成及组装。材料结合了金属纳米簇优异的光电性能、催化活性以及dna分子良好的生物相容性和靶向性，使其在生物传感和肿瘤治疗应用中具有重要意义。
17.本发明中的dna-ag@pd ncs具有良好的近红外ii区光热性能以及优异的化学动力学特性，可实现近红外ii区(nir-ii)光热和化学动力学协同治疗。通过对dna-ag@pd ncs进行1270nm激光照射，光热转化效率可达到59.32％。 dna-ag@pd ncs在体外具有良好的生物相容性以及光热治疗效果，能够有效地杀死癌细胞。另外，由于尺寸小和双金属间存在协同效应使其表现出优异的催化活性，可催化肿瘤环境中的h2o2分解生成高细胞毒性的
·
oh使细胞凋亡，用于肿瘤微环境中的化学动力学治疗，并且能够进一步实现nir-ii区光热增强化学动力学协同治疗的效果。
18.本发明设计的dna模板有良好的尺寸调控和肿瘤细胞靶向性，该核酸序列的设计可以赋予dna功能化的ag@pd ncs(dna-ag@pd ncs)肿瘤靶向功能。 dna-ag@pd ncs具有良好的近红外ii区光热性能以及优异的化学动力学特性，结合其nir-ii光热/化学动力学协同增强治疗可以实现精确肿瘤治疗的目的。
19.本发明制备的dna-ag@pd ncs在nir-ii 1270nm处，其光热转化效率为 59.32％，消光系数为0.36l g-1
cm-1
。在nir-ii 1270nm激光功率密度为1w/cm2时，240μg l-1
的材料在激光照射10min后升温到53℃左右，达到了可以杀死细胞的温度。在0.75w cm-2
的功率密度下，7min内即可升温到48℃以杀死癌细胞。dna-ag@pd ncs有着优异的化学动力学性能，可以催化过氧化氢分解生成
·
oh，且在ph＝5.0的条件下催化性能最佳。经过nir-ii激光照射后， dna-ag@pd ncs可以将nir-ii的激光能量转化为局部热，光热效应加速了h2o2的催化，提高了dna-ag@pd ncs的化学动力学治疗性能。
20.综上所述，该材料表现出良好的光热和化学动力学治疗效果。两者在生物检测与治疗中具有出色的应用潜力，对于dna纳米技术在生物传感和肿瘤诊疗中的应用研究具有积极的推动作用。
附图说明
21.图1为本发明中实施例1制备的dna-ag@pd ncs的tem图；
22.图2为本发明中实施例1制备的单颗粒dna-ag@pd ncs的hrtem图；
23.图3为本发明中实施例1制备的dna-ag@pd ncs和dna-ag ncs的荧光光谱对比图；
24.图4为本发明中实施例1制备的dna-ag@pd ncs的高分辨pd 3d xps谱图；
25.图5为本发明中实施例1制备的dna-ag@pd ncs的高分辨ag 3d xps谱图；
26.图6为本发明中实施例1制备的dna-ag@pd ncs的xps全谱表征图；
27.图7为本发明中实施例1制备的不同浓度dna-ag@pd ncs水溶液对应的 uv-vis-nir吸收光谱图；
28.图8为本发明中实施例1制备的dna-ag@pd ncs在1270nm波长处的吸光度同浓度之间的线性拟合直线；
29.图9为本发明中实施例1制备的不同浓度的dna-ag@pd ncs水溶液在 1270nm激光照射下的光热升温曲线；
30.图10为本发明中实施例1制备的不同浓度的dna-ag@pd ncs水溶液在 1270nm激光照射下的光热成像图；
31.图11为本发明中实施例1制备的dna-ag@pd ncs水悬浮液在不同功率的 1270nm激光照射下的光热升温曲线；
32.图12为本发明中实施例1制备的dna-ag@pd ncs在1270nm激光照射下 20min的升温降温曲线图；
33.图13为本发明中实施例1制备的dna-ag@pd ncs降温10min过程中时间t与lnθ的关系图；
34.图14为本发明中实施例1制备的dna-ag@pd ncs在五个1270nm激光开 /关循环内的升温/降温曲线；
35.图15为本发明中实施例1制备的dna-ag@pd ncs每个体系的uv-vis-nir 吸收光谱:1.dna-ag@pd ncs催化tmb-h2o2的显色(dna-ag@pd ncs+ h2o2+tmb)；2.空白组tmb-h2o2(h2o2+tmb)；3.只加dna-ag@pd ncs (dna-ag@pd ncs)；
36.图16为本发明中实施例1制备的dna-ag@pd ncs各体系在652nm波长处的吸收值柱状图；
37.图17为本发明中实施例1制备的dna-ag@pd ncs+h2o2+tmb在不同 ph值条件下反应后的uv-vis-nir吸收光谱；
38.图18为本发明中实施例1制备的dna-ag@pd ncs组和control组在不同 ph值条件下反应后在652nm处的吸光强度对比，误差数据为三次独立实验得到的结果；
39.图19为本发明中实施例1制备的dna-ag@pd ncs在不同合成条件下的催化动力学；
40.图20为本发明中实施例1制备的dna-ag@pd ncs的光热增强化学动力学；
41.图21为本发明中实施例1制备的dna-ag@pd ncs对3t3和mkn-45细胞的毒性；
42.图22为本发明中实施例1制备的dna-ag@pd ncs对mkn-45细胞进行化学动力学治疗后的细胞存活率；
43.图23为本发明中实施例1制备的不同浓度dna-ag@pd ncs孵育的 mkn-45细胞经1270nm激光照射10min及不经过激光照射的成活率柱状图；
44.图24为本发明中实施例1制备的dna-ag@pd ncs材料中孵育的mkn-45 细胞经过不同功率(0、0.3、0.6、0.9、1.2和1.5w cm-2
)1270nm激光照射10min 后的成活率。
45.图25为本发明中实施例1制备的dna-ag@pd ncs与细胞共孵育后的荧光共聚焦成像图。control组：无材料无光照；dna-ag@pd ncs组：有材料无光照；dna-ag@pd ncs+laser组：有材料有光照，图中比例尺长度代表200mm。
46.图26为本发明中实施例1与对比例1制备的产物的光热性能对比。
具体实施方式
47.以下结合实施例和附图对本发明作进一步说明。
48.实施例1
49.本实施例提供了一种dna-ag@pd ncs的制备方法，具体包括如下步骤：
50.首先将dna模板链(100ml,100mm)加入到cbs缓冲液(ph＝7.0,40 ml,0.1m)中，以25℃、400rpm的条件在恒温混匀仪中振荡30min后加入200 ml agno3(500mm)溶液，用旋涡混匀仪剧烈振荡1min，放入冰箱避光孵育 30min。
51.加入200ml na2pdcl4(1mm)溶液在恒温混匀仪中以25℃、800rpm振荡30min。
52.在混合溶液中快速加入500ml低温新制备的nabh4(1mm)溶液进行还原反应，用旋涡混匀仪剧烈振荡1min，用恒温混匀仪以4℃、1300rpm的条件反应3h后置于4℃环境中避光孵育24h，最后通过离心(7000r，10min)进行分离，收集上清液。
53.将本实施例1中制备的dna-ag@pd ncs进行表征，从tem图像(图1) 观察所获得的dna-ag@pd ncs呈球形无团聚，分散均匀，平均粒径约为3nm。通过hrtem分析dna-ag@pd ncs的晶格数据(图2)。我们对多个位点进行晶格测量，dna-ag@pd ncs外层部分的晶格间距为0.213nm，对应于pd的(200) 晶面；中间位置的晶格间距为0.207nm，对应于ag的(200)晶面。hrtem表征初步证明了dna-ag@pd ncs为ag和pd的核壳结构。与具有明亮荧光的 dna-ag ncs不同，dna-ag@pd ncs观察到几乎没有荧光(图3)，这可归因于pd层生长在ag ncs表面上，从而导致ag ncs的荧光淬灭。dna-ag@pd ncs 中的原子价态通过x射线光电子能谱(xps)来确定，如图4、5所示，pd 3d 的xps光谱峰位于336.06ev和341.35ev位置处，分别对应于零价pd的pd 3d
5/2
和pd 3d
3/2
。ag 3d的xps光谱峰位于367.63ev和373.62ev位置处，分别归属于零价ag的ag 3d
5/2
和ag 3d
3/2
。tem、hrtem及xps表征证明了pdag核壳纳米簇的成功合成。dna-ag@pd nc水溶液的浓度由电感耦合等离子体发射光谱仪(icp-oes)测定。含有不同浓度dna-ag@pd nc水溶液的uv-vis-nir光谱如图7所示，dna-ag@pd ncs水溶液在nir-ii窗口有明显的光学吸收。由朗伯-比尔定律，根据材料不同浓度与1270nm波长处的吸光度值做线性关系拟合(图8)，经过计算得到dna-ag@pd nc在1270nm波长处的质量消光系数ε为0.36l g-1
cm-1
。
54.将本实施例1中制备的dna-ag@pd ncs进行光热性能表征，从图9可知，不同浓度的dna-ag@pd ncs升温效果不同，且表现出浓度依赖性。 dna-ag@pd ncs的浓度越高，近红外吸收越强，其光热升温效果越明显，相应的光热成像效果如图10所示。对于同一浓度，随着时间的增长，dna-ag@pd ncs 水悬浮液的温度不断升高并在10min左右趋于稳定。其中，180μg l-1
的材料在激光照射10min后升温到48℃左右，达到了可以杀死细胞的温度，而对于空白组的pbs缓冲溶液，1270nm的激光对其的升温效果微弱，说明dna-ag@pdncs升温效果绝大部分来自于溶液中的dna-ag@pd ncs对激光的吸收。激光功率对dna-ag@pd ncs的光热升温效果影响如图11所示。我们测试了dna
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ag@pd ncs水悬浮液在不同功率1270nm激光照射下的光热升温曲线，研究结果表明dna-ag@pd ncs的光热升温效果随着照射的激光功率密度的增大呈递增趋势，在0.75w cm-2
的功率密度下，7min内即可升温到48℃以杀死癌细胞。 dna-ag@pd ncs的升温降温曲线及降温过程中t与lnθ的关系如图12和13所示，通过文献已报道的方法计算dna-ag@pd ncs的光热转化效率。从图13可知，在1270nm的激光下，dna-ag@pd ncs的光热转化效率为59.32％。选取了浓度为180μg l-1
的dna-ag@pd ncs在1270nm激光下进行光热稳定性测试。在重复5次的激光照射10min并冷却10min后，得到dna-ag@pd ncs水悬浮液的升温/降温循环曲线如图14所示，在每次的升温/降温循环过程中，温度差都没
有发生明显的变化，说明dna-ag@pd ncs可以作为一种光热转化效率高且稳定的光热治疗剂应用于相关肿瘤的光热治疗。
55.将本实施例1中制备的dna-ag@pd ncs进行化学动力学性能表征，化学动力学性能研究结果如图15、16所示。在只含有dna-ag@pd ncs材料(红线) 及只含有h2o2和tmb的底物(黑线)时，uv-vis-nir光谱中均没有明显的吸收变化，而将等量的dna-ag@pd ncs加入到含有h2o2和tmb的底物体系中后，tmb溶液被氧化并显示氧化tmb的蓝色变化(图15插图)，在652nm波长处表现出氧化tmb的特征吸收峰(蓝线)，这证明了dna-ag@pd ncs具有明显的化学动力学性能，可以催化过氧化氢分解生成
·
oh。图16是三次独立实验后得到的吸收均值和标准差。接着探究了不同ph环境对化学动力学性能影响， control组为只有h2o2和tmb底物的体系。将dna-ag@pd ncs加入到同时含有h2o2和tmb的底物体系后，不同ph环境反应后的吸收光谱显示出明显的吸收强度差别(图17)。其中，在ph＝5.0的条件下光谱吸收最强。图18是三次独立实验后的得到结果，证明了数据的非偶然性。为了探讨dna-ag@pd ncs 化学动力学性能的来源，继续采集相同浓度的不同材料在652nm波长处的催化活性动力学性能数据，探究材料在不同合成条件下的催化性能，测定时间为10 min。动力学结果如图19所示，control组为同时含有h2o2和tmb底物时的催化动力学效果，h2o2在10min内存在微弱的自我分解，而dna-ag@pd ncs在 10min时间内有着显著的催化反应速率。与dna-ag@pd ncs相比，在加入 dna-ag ncs(红线)和不加入dna(蓝线)时，催化动力学效果可忽略不计，这是因为dna-ag ncs本身没有催化性能，而不加入dna时，合成的是较大尺寸的ag和pd的颗粒，催化性能同样不佳，结果突出表明使用的dna模板对 ag@pd ncs的形成至关重要。
56.dna-ag@pd ncs由于兼具nir-ii区光热性能与化学动力学特性，我们对其光热效应增强化学动力学性能进行了探讨。图20展现了nir-ii激光对化学动力学性能的影响。i(h2o2+tmb+dna-ag@pd ncs)和iii(h2o2+tmb)为经过激光照射组；ii(h2o2+tmb+dna-ag@pd ncs)和iv(h2o2+tmb) 为不经过激光照射组。通过两组对照实验发现，经过激光照射后的反应体系产生的氧化tmb的吸收强度明显强于未经过激光照射的，这是因为dna-ag@pdncs可以将nir-ii的激光能量转化为局部热，光热效应加速了h2o2的催化，产生更多的
·
oh，从而提高了dna-ag@pd ncs的化学动力学治疗性能。这证明了 dna-ag@pd ncs的光热性能与化学动力学特性可以产生协同增强效应。
57.除了dna-ag@pd ncs优异的光热和化学动力学性能外，其在生物应用方面具有良好的生物相容性以及体外癌细胞治疗效果。采用mtt法对3t3胚胎成纤维正常细胞和mkn-45胃癌细胞两种细胞进行毒性验证。如图21所示，在 dna-ag@pd ncs的浓度达到60μg ml-1
时，mkn-45细胞与dna-ag@pd ncs 共孵育24h后活性达到96％以上，即使在更高的浓度(250μg ml-1
)下也能达到80％左右的成活率，说明材料具有良好的生物相容性。采用3t3正常细胞在相同的实验条件下进行细胞活性验证，在dna-ag@pd ncs的浓度为0-200μgml-1
的范围内，3t3细胞活性只下降13％，高于mkn-45癌细胞(下降20.4％) 的活性，这可能是由于肿瘤细胞中的过氧化氢表达性差异，致使dna-ag@pdncs催化h2o2产生
·
oh的量不同，从而导致肿瘤细胞体现的成活率存在差异。接下来探究dna-ag@pd ncs对胃癌细胞mkn-45的nir-ii光热治疗效果。将 mkn-45细胞与不同浓度的材料共孵育24h后用1270nm激光照射10min，后用mtt法对癌细胞的光热治疗效果进行验证。如图22所示，以250μg ml-1
的浓度为例，经过1270nm(1.5w cm-2
)激光照射10min后，与同浓度的未经过激光照射的细胞对照组相比，细胞
活性又下降50％以上，说明细胞中的材料具有良好的光热升温效果，经nir-ii区激光照射后几分钟内即可吸收光能升温使癌细胞凋亡。接着我们对dna-ag@pd ncs的胃癌细胞化学动力学治疗进行进一步的研究。由图23所示，在只加入h2o2和dna-ag@pd ncs的情况下，无论是否经过nir-ii激光照射，细胞死亡率都很低，说明适量的h2o2和dna-ag@pdncs有着较小的细胞毒性。当细胞中同时加入h2o2和dna-ag@pd ncs时，细胞活性下降了26％左右，与未经过激光照射的h2o2组和dna-ag@pd ncs组相比有着明显的下降，这是由于dna-ag@pd ncs会催化h2o2分解产生高细胞毒性的
·
oh，导致细胞死亡，说明了dna-ag@pd ncs有着优异的细胞化学动力学治疗效果。图23后两组数据显示，在细胞中同时加入dna-ag@pd ncs和h2o2时，与单独的h2o2组和dna-ag@pd ncs组相比，细胞活性发生了少量的下降，说明材料的化学动力学可以杀死细胞。当继续加入nir-ii激光(1270nm) 照射10min后，与未经过激光照射组(dna-ag@pd ncs+h2o2)相比，细胞活性又下降了68％，说明材料的光热能够增强细胞的化学动力学治疗效果，大大提升细胞的杀伤率。同样的，探究了光照功率密度其对细胞活性影响，在相同实验条件下，我们仅调制1270nm激光器的照射功率密度大小(0、0.3、0.6、0.9、 1.2和1.5w cm-2
)，对细胞照射10min后验证细胞活性(图23)，可以发现，随着功率密度的增强，细胞死亡率随之升高，当功率密度达到1.5w cm-2
时，细胞的活性降至25％左右，体现了dna-ag@pd ncs对胃癌细胞优异的光热治疗效果。接着，我们通过荧光共聚焦显微镜对不同条件下的光热治疗后的细胞进行共聚焦成像，如图24所示。对照组的为不经过材料和光照处理的细胞，因为细胞有良好的活性，细胞核保持完整，pi染料对其不能进行染色；当只加入材料不加光照时，可以看到有微弱的红色，说明只有极少量的细胞没有活性，证明材料具有低毒性和良好的生物相容性；当加入材料孵育(250μg ml-1
)并经过1270nm 激光器(1.5w cm-2
)照射10min后，共聚焦成像显示出大量的细胞死亡，说明材料的光热升温杀死细胞，更加证明了材料可以进行nir-ii区的肿瘤治疗，可以作为有潜力的有效的光热治疗剂。
58.对比例1
59.本对比例与实施例1的方法基本相同，不同之处仅在于，将双金属纳米簇替换成了单金属纳米簇dna-ag ncs，并和dna-ag@pd ncs光热及催化动力学性能进行对比。在同等ag含量的前提下，两者在1270nm激光下的光热性能如图26所示，表明dna-ag@pd ncs的升温效果要远远强于dna-ag ncs。如图19所示，dna-ag@pd ncs在10min时间内有着显著的催化反应速率，而 dna-ag ncs催化动力学效果可忽略不计。综上所述，单金属纳米簇dna-agncs的光热性能和化学动力学性能均不如本实施例所制备的双金属纳米簇 dna-ag@pd ncs。