一种草本与珍珠粉结合的美颜亮肤组合物以及制备方法与流程

1.本技术涉及芦荟技术领域，尤其涉及草本与珍珠粉结合的美容亮肤组合物及其制备方法。


背景技术：

2.芦荟具有强大的生命力和惊人的损伤修复能力，其神奇功效源于其含有的多种功效成分。芦荟中的化学成分有160多种，其中营养素(多糖和氨基酸等)70多种、有机酸20多种、矿物质20多种、烷烃类30多种、生物酶10多种。除此之外，芦荟鲜叶中水含量约占鲜叶重量的95％这种水是原始的天然生物水，又称滑水，在美容、保健、医疗等方面具有重要功效。虽然不同产地、不同品种和不同种植条件会导致芦荟中某些化学成分的含量出现差异，但其化学成分的种类却大致相同。目前已经研究确认并被应用的有100余种化学成分。在各种化学成分中，含量较高的是芦荟凝胶、芦荟大黄素、芦荟多糖和芦荟苷；其中，芦荟苷被现代药理证实了具体明显的抑制酪氨酸酶活性，具有抑制皮肤黑色素生成和沉积的作用，是具有美白作用的主要成分。
3.然而，现有的芦荟提取物中芦荟苷含量过低，对其直接进行提取将极大地促进生成成本，而且单一芦荟提取物对美白亮肤的作用有限。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本技术的目的在于提供一种美白亮肤组合物，不仅能够提高其中芦荟苷含量，还能通过对其他草本植物的结合，更好地发挥美白亮肤的作用。该美白亮肤组合物不仅能够使得皮肤呈现光泽净透，使肌肤焕发透亮光彩，令肌肤光泽净透，滋润细腻肌肤，还能使肌肤水嫩亮泽，具有很好的市场应用前景。
5.第一方面，本技术实施例公开了一种美白亮肤组合物，包括10～500份上述的发酵提取物，10～200份珍珠粉以及10～100份烟酰胺；
6.其中，所述发酵提取物是将丁酸梭菌进行活化后接种于工作种子培养液中厌氧培养制得工作种子液，然后将所述工作种子液转接至发酵培养基中厌氧培养制得发酵液，再将发酵液进行提取得到；
7.所述工作种子培养液包含1.25～8.5g/l芦荟提取物和1.25～4.5g/l人参根提取物，所述发酵培养液包含1.25～8.5g/l芦荟提取物、1.25～4.5g/l人参根提取物、0.1～0.22g/l珍珠粉和0.02～0.12g/l烟酰胺。
8.在本技术实施例中，所述发酵提取物包含23.7～50.58mg/g糖蛋白、7.48～14.57mg/g芦荟苷、41.49～58.19mg/g可溶性糖、7.72～10.98mg/g人参皂苷rg1、5.46～6.95mg/g人参皂苷re、3.39～5.41mg/g人参皂苷rb1、4.06～5.05mg/g人参皂苷rb2、2.8～3.46人参皂苷rc和2.48～2.85mg/g人参皂苷rd。
9.在本技术实施例中，所述美白亮肤组合物还包括保湿剂、润肤剂、增稠剂、防腐剂和芳香剂中的至少一种；以组合物的总质量计，所述保湿剂的加入量为0.001～3wt％；所述
增稠剂的加入量为0.001～0.5％；所述润肤剂的加入量为0.001～0.5wt％；所述防腐剂的加入量为0.001～1.5wt％。
10.在本技术实施例中，所述保湿剂选自括异丙醇、丙二醇、丁二醇、泛醇、甘油和甘油聚醚-26中的至少一种；所述润肤剂包括但不限于橄榄油、澳洲坚果油、甜杏仁油、葡萄籽油、鳄梨油、玉米油、芝麻油、大豆油、花生油、白池花籽油、红花籽油、狗牙蔷薇果油、刺阿干树仁油、霍霍巴籽油、向日葵籽油、毛瑞搁果油、角鳖烷、棕搁酸乙基己酯、肉豆寇酸异丙酯、氢化聚异丁烯、异十六烷、异十二烷、碳酸二乙基己酯、碳酸二辛酯、月桂酰肌氨酸异丙酯、异壬酸异壬酯、氢化聚癸烯、甘油三(乙基己酸)酯、鲸蜡醇乙基己酸酯、双-二乙氧基二甘醇环己烷1,4一二梭酸酯、辛酸/癸酸甘油三醋、油醇芥酸酯、辛基十二醇肉豆范酸酯、辛基十二醇、聚二甲基硅氧烷、辛基聚甲基硅氧烷、鲸蜡基聚二甲基硅氧烷、环五聚二甲基硅氧烷、鲸蜡醇、硬脂醇、鲸蜡硬脂醇、山箭醇、鳖肝醇、月桂酸、肉豆范酸、棕搁酸、硬脂酸、蜂蜡、小烛树蜡、巴西棕搁蜡、羊毛脂、地蜡、霍霍巴籽蜡、石蜡、微晶蜡、氢化米糠蜡、氢化椰油甘油酯类、甘油山箭酸酯/二十酸酯、肉豆范醇肉豆荔酸酯、双-二甘油多酰基己二酸酯-2、牛油果树果脂和木鲁星果棕籽脂中的至少一种；所述增稠剂包括丙烯酸(酯)类及其衍生物、黄原胶、阿拉伯胶、聚乙二醇-14m、聚乙二醇-90m、琥珀酞聚糖、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素中的至少一种；所述防腐剂包括羟苯甲酯、羟苯丙酯、苯氧乙醇、苯甲醇、苯乙醇、双(羟甲基)咪哇烷基脉、山梨酸钾、苯甲酸钠、氯苯甘醚、脱氢乙酸钠、辛酞经脂酸、1,2-己二醇、1,2-戊二醇、对羟基苯乙酮、辛甘醇、甘油辛酸酯、十一碳烯酸甘油醋、山梨坦辛酸酯和乙基己基甘油中的至少一种。
11.第二方面，本技术实施例公开了第一方面所述的美白亮肤组合物的制备方法，包括按照配方量将组合进行混合均质的步骤；其中，所述发酵提取物的制备方法包括：
12.获得活化的丁酸梭菌菌液；
13.制备初级种子液，所述初级种子液是将所述活化的丁酸梭菌菌液涂布于固体培养上厌氧培养后，转接平板上的菌落至储初级种子培养液进行厌氧培养得到；
14.制备工作种子液，所述工作种子液是将所述初级种子液接种于工作种子培养液中进行厌氧培养得到；所述工作种子培养液包含1.25～8.5g/l芦荟提取物和1.25～4.5g/l人参根提取物；
15.制备发酵液，所述发酵液是将所述工作种子液接种于发酵培养液中进行厌氧培养得到；所述发酵培养液包含1.25～8.5g/l芦荟提取物、1.25～4.5g/l人参根提取物、0.1～0.22g/l珍珠粉和0.02～0.12g/l烟酰胺；以及
16.制备所述发酵提取物的步骤。
17.在本技术实施例中，所述工作种子培养液包含1.25～8.5g/l芦荟提取物、1.25～4.5g/l人参根提取物、2～3g/l酵母浸膏、7～10g/l牛肉浸膏、6～10g/l胰蛋白胨、1～5g/l葡萄糖、1～5g/l nacl、1～3g/l ch3coona
·
3h2o和0.1～0.5g/l l-半胱氨酸盐酸盐。
18.在本技术实施例中，所述发酵培养液包含2～3g/l酵母浸膏、7～10g/l牛肉浸膏、6～10g/l胨胰蛋白、2～5g/l葡萄糖、1.25～8g/l芦荟提取物、1.25～4.5g/l人参根提取物、1～5g/l nacl、1～3g/l ch3coona
·
3h2o、0.1～0.5g/l l-半胱氨酸盐酸盐、0.1～0.22g/l珍珠粉和0.02～0.12g/l烟酰胺。
19.在本技术实施例中，制备所述发酵提取物的步骤具体包括：
75-1，上海迈瑞尔化学技术有限公司)，于45.0℃水浴条件下酶解45～60min后，以100～105℃蒸煮10～15min，进行灭酶处理，再次以8000rpm低温离心10min后，取上清液，用75％的饱和硫酸铵溶液进行盐析处理，4℃放置下12h后，4℃、8000rpm离心10min后收集沉淀，冷冻干燥，即可得到所述的芦荟提取物。
42.2、人参根提取物的制备
43.将人参根(吉林省颐鹿堂商贸有限公司)粉碎，80目筛网过筛，混入10倍重量水，于40℃水浴超声提取2h，提取液离心过滤，取残渣继续混入10倍质量的水，水浴升温至100℃提取1.5h，提取液超滤浓缩，浓缩液冻干，即为人参根提取物。
44.3、发酵
45.一个具体的实施例1的发酵实施过程如下：
46.(1)菌株
47.丁酸梭菌，gim1.676，北京博瑞康沐生物技术有限公司。
48.(2)菌种活化
49.吸取于-80℃甘油管保藏的丁酸梭菌菌种1ml，接种于活化培养液中，并置于厌氧培养箱中37℃培养24h。其中，活化培养液配方为蛋白胨10g/l、牛肉膏10g/l、葡萄糖5g/l、氯化钠5g/l、可溶性淀粉1g/l、乙酸钠3g/l、l-半胱氨酸盐酸盐0.5g/l，ph值7.0
±
0.1，121℃灭菌20min。
50.(3)制备初级种子液
51.将上述培养24h后的活化液涂布于固体培养基上，于37℃厌氧培养28h，再次转接其中较大的菌落，获得稳定的菌落后，取菌落接种至初级种子培养液中，于37℃厌氧培养24h，即可得到初级种子液。
52.其中，固体培养基包括：酵母浸膏3g/l、牛肉浸膏10g/l、胰蛋白胨10g/l、葡萄糖5g/l、可溶性淀粉1g/l、nacl 5g/l、ch3coona
·
3h2o3g/l、l-半胱氨酸盐酸盐0.5g/l、0.5％美蓝、琼脂6g，调节ph到7.1
±
0.1，121℃灭菌20min，备用。初级种子培养液与固体培养基的配方大致相同，区别仅在于无美蓝和琼脂。
53.(4)制备工作种子液
54.上述制得的初级种子液按3％的体积比接种于装有120ml工作种子培养液的250ml培养瓶中，置于37℃厌氧培养箱中培养48h，即可得到工作种子液。
55.其中，工作种子培养液包括：酵母浸膏3g/l、牛肉浸膏10g/l、胰蛋白胨10g/l、葡萄糖5g/l、芦荟提取物1.25g/l、1.25g/l人参根提取物、nacl 5g/l、ch3coona
·
3h2o 3g/l和l-半胱氨酸盐酸盐0.5g/l，调节ph到7.1
±
0.1，121℃灭菌20min，备用。其中，芦荟提取物和发酵提取物按照上述方法制得。
56.(5)制备发酵液
57.在10l全自动不锈钢发酵系统(江苏贝朗生物工程设备有限公司)中装入7l的发酵培养基，灭菌后冷却后，向其中接入210ml的工作种子液，向接种的培养液中无菌覆盖2cm的石蜡油，并连续通入氮气以维持厌氧或低氧状态，控温37℃、ph6.8～7.5厌氧培养培养30h，每隔2h取样镜检，观察芽孢形成情况，若芽孢形成率在90％以上，终止发酵。并进行芽孢计数，确定最佳厌氧培养方式。
58.其中，发酵培养基包括：酵母浸膏3g/l、牛肉浸膏10g/l、胰蛋白胨10g/l、葡萄糖
5g/l、芦荟提取物1.25g/l、1.25g/l人参根提取物、nacl 5g/l、ch3coona
·
3h2o 3g/l、l-半胱氨酸盐酸盐0.5g/l、珍珠粉0.22g/l、烟酰胺0.12g/l，调节ph到7.1
±
0.1，121℃灭菌20min，备用。其中，珍珠粉，货号zx-hzp-125，西安展迅生物科技有限公司。烟酰胺，cas:98-92-0，杭州唯铂莱生物科技有限公司。
59.一个具体的实施例2的发酵实施过程为：步骤(1)～(3)以及(5)均与实施例1相同；步骤(4)中使用的种子培养基包括：酵母浸膏3g/l、牛肉浸膏7.5g/l、胰蛋白胨8g/l、葡萄糖3.5g/l、芦荟提取物6.5g/l、发酵提取物2.5g/l、nacl 5g/l、ch3coona
·
3h2o 3g/l和l-半胱氨酸盐酸盐0.5g/l，调节ph到7.1
±
0.1，121℃灭菌20min，备用。
60.一个具体的实施例3的发酵实施过程为：步骤(1)～(3)以及(5)均与实施例1相同；步骤(4)中使用的种子培养基包括：酵母浸膏2.2g/l、牛肉浸膏7.5g/l、胰蛋白胨6.5g/l、葡萄糖2.5g/l、芦荟提取物8.5g/l、发酵提取物4.5g/l、nacl 5g/l、ch3coona
·
3h2o 3g/l和l-半胱氨酸盐酸盐0.5g/l，调节ph到7.1
±
0.1，121℃灭菌20min，备用。
61.一个具体的实施例4的发酵实施过程为：步骤(1)～(4)均与实施例1相同；步骤(5)中使用的发酵培养基包括：酵母浸膏3g/l、牛肉浸膏7.5g/l、胰蛋白胨8g/l、葡萄糖3.5g/l、芦荟提取物6.5g/l、发酵提取物2.5g/l、nacl 5g/l、ch3coona
·
3h2o 3g/l、l-半胱氨酸盐酸盐0.5g/l、珍珠粉0.22g/l、烟酰胺0.12g/l，调节ph到7.1
±
0.1，121℃灭菌20min，备用。
62.一个具体的实施例5的发酵实施过程为：步骤(1)～(4)均与实施例1相同；步骤(5)中使用的发酵培养基包括：酵母浸膏2.2g/l、牛肉浸膏7.5g/l、胰蛋白胨6.5g/l、葡萄糖2.5g/l、芦荟提取物8.5g/l、发酵提取物4.5g/l、nacl 5g/l、ch3coona
·
3h2o 3g/l、l-半胱氨酸盐酸盐0.5g/l、珍珠粉0.22g/l、烟酰胺0.12g/l，调节ph到7.1
±
0.1，121℃灭菌20min，备用。
63.一个具体的对比例1的发酵实施过程为：步骤(1)～(3)以(5)均与实施例1相同；步骤(4)中使用的种子培养基包括：酵母浸膏3g/l、牛肉浸膏10g/l、胰蛋白胨10g/l、葡萄糖5g/l、nacl 5g/l、ch3coona
·
3h2o 3g/l和l-半胱氨酸盐酸盐0.5g/l，调节ph到7.1
±
0.1，121℃灭菌20min，备用。
64.一个具体的对比例2的发酵实施过程为：步骤(1)～(3)以(5)均与实施例1相同；步骤(4)中使用的工作种子培养液包括：酵母浸膏3g/l、牛肉浸膏10g/l、胰蛋白胨10g/l、葡萄糖5g/l、芦荟提取物1.25g/l、nacl 5g/l、ch3coona
·
3h2o 3g/l和l-半胱氨酸盐酸盐0.5g/l，调节ph到7.1
±
0.1，121℃灭菌20min，备用。
65.一个具体的对比例3的发酵实施过程为：步骤(1)～(3)以(5)均与实施例1相同；步骤(4)中使用的工作种子培养液包括：酵母浸膏3g/l、牛肉浸膏10g/l、胰蛋白胨10g/l、葡萄糖5g/l、1.25g/l人参根提取物、nacl 5g/l、ch3coona
·
3h2o 3g/l和l-半胱氨酸盐酸盐0.5g/l，调节ph到7.1
±
0.1，121℃灭菌20min，备用。
66.一个具体的对比例4的发酵实施过程为：步骤(1)～(3)以(5)均与实施例1相同；步骤(4)中使用的工作种子培养液包括：酵母浸膏3g/l、牛肉浸膏10g/l、胰蛋白胨10g/l、葡萄糖5g/l、芦荟提取物0.5g/l、发酵提取物0.5g/l、nacl 5g/l、ch3coona
·
3h2o 3g/l和0.5g/ll-半胱氨酸盐酸盐，调节ph到7.1
±
0.1，121℃灭菌20min，备用。
67.一个具体的对比例5的发酵实施过程为：步骤(1)～(3)以(5)均与实施例1相同；步骤(4)中使用的工作种子培养液包括：酵母浸膏3g/l、牛肉浸膏10g/l、胰蛋白胨10g/l、葡萄
糖5g/l、芦荟提取物10g/l、发酵提取物6g/l、nacl 5g/l、ch3coona
·
3h2o 3g/l和l-半胱氨酸盐酸盐0.5g/l，调节ph到7.1
±
0.1，121℃灭菌20min，备用。
68.一个具体的对比例6的发酵实施过程为：步骤(1)～(4)均与实施例1相同；步骤(5)中使用的发酵培养液包括：酵母浸膏3g/l、牛肉浸膏10g/l、胰蛋白胨10g/l、葡萄糖5g/l、芦荟提取物1.25g/l、1.25g/l人参根提取物、nacl 5g/l、ch3coona
·
3h2o 3g/l和0.5g/ll-半胱氨酸盐酸盐，调节ph到7.1
±
0.1，121℃灭菌20min，备用。
69.一个具体的对比例7的发酵实施过程为：步骤(1)～(4)均与实施例1相同；步骤(5)中使用的发酵培养液包括：酵母浸膏3g/l、牛肉浸膏10g/l、胰蛋白胨10g/l、葡萄糖5g/l、芦荟提取物0.5g/l、发酵提取物0.5g/l、nacl 5g/l、ch3coona
·
3h2o 3g/l、l-半胱氨酸盐酸盐0.5g/l、珍珠粉0.22g/l、烟酰胺0.12g/l，调节ph到7.1
±
0.1，121℃灭菌20min，备用。
70.一个具体的对比例8的发酵实施过程为：步骤(1)～(4)均与实施例1相同；步骤(5)中使用的发酵培养液包括：酵母浸膏3g/l、牛肉浸膏10g/l、胰蛋白胨10g/l、葡萄糖5g/l、芦荟提取物10g/l、发酵提取物6g/l、nacl 5g/l、ch3coona
·
3h2o 3g/l、l-半胱氨酸盐酸盐0.5g/l、珍珠粉0.22g/l、烟酰胺0.12g/l，调节ph到7.1
±
0.1，121℃灭菌20min，备用。
71.4、发酵液提取物的制备
72.实施例1的发酵液提取实施过程如下：
73.(1)发酵液的脉冲强光辐照处理
74.采用蓝谱里克uv脉冲强光仪，深圳市蓝谱里克科技有限公司，最小设置闪照频率1次/s；紫外区能量占总能量21.1％，距离灯管中心13cm处的单次脉冲剂量为150mj/cm2；紫外线峰值247nm；辐照度615.0w/cm2；脉冲宽度234ms。
75.取多个盛有2.0ml发酵液的无菌空培养皿，设置辐照距离5cm、固定闪照频率5次/s、单次辐照剂量3.6j/cm辐照距离5cm、固定闪照频率5次/s、单次辐照剂量3.6j/cm
2,
，单次辐照时间为40s。共进行3次及以上的辐照处理。
76.其对菌体和芽抱灭活率的影响，以未进行脉冲强光辐照处理组为对照组。实验设3个平行，以平均值报告结果。
77.(2)胞内物质泄漏量的测定
78.以260nm和280nm波长处的紫外吸光度分别表征核酸与蛋白质漏出相对含量，以无菌生理盐水做参比溶液；
79.同时采用平板菌落计数法对灭活的发酵液进行菌落计数，按下式计算灭活率＝(对照样品菌落总数－辐照后样品菌落总数)/对照样品菌落总数
×
100％。
80.(4)再次灭活处理
81.为保证对发酵液的灭活率达到99％以上，在实际对发酵液进行灭活处理的实施例中，向经过上述辐照处理的发酵液中通入臭氧，保证发酵液中臭氧浓度为4mg/l，处理时间为5min，处理完成后，将发酵液置于35℃的超声处理，以充分挥发其中溶解的臭氧。
82.(5)提取处理
83.将经过辐照处理和/或臭氧处理的发酵液进行灭活率检测，取其中灭活率超过99％的发酵液，4℃放置下12h，离心8000rpm、10min后收集沉淀，重悬于蒸馏水中，用75％的饱和硫酸铵溶液进行盐析处理，4℃放置下12h后，4℃、8000rpm离心10min后收集沉淀，冷冻干燥，即可得到所述的发酵提取物。
84.实施例2～5以及对比例1～8的发酵液提取实施过程均与实施例1相同。
85.实施例6的发酵液提取实施过程为：
86.其步骤(1)～(4)均与实施例1相同，步骤(5)包括：将经过辐照处理和/或臭氧处理的发酵液进行灭活率检测，取其中灭活率超过99％的发酵液，向其中加入25％(质量百分比)peg6000(杭州仟诺生物科技有限公司)，加入na2so4的质量分数为6％，加入kcl的质量分数为1％。4℃静置1 0h，8000r/min离心10min以加速分相，收集沉淀，冷冻干燥，即可得到所述的发酵提取物。
87.5、糖蛋白的分析
88.对上述实施例1～6和对比例1～8分别制得的发酵提取物件糖蛋白分析，分析方法如下：
89.供试品溶液：取发酵提取物溶于5mm ph8.0的磷酸缓冲液(kh2po
4-na2hpo4)，质量浓度为5％，以作为层析供试品。
90.第一次层析：将供试品溶液上样至deae-cellulose52层析柱(青岛碧水寒天生物有限公司，2.5
×
45cm)后静置15min，让其中糖蛋白充分吸附，用含0～0.5mol/l浓度的nacl的磷酸缓冲液进行分段梯度洗脱(nacl的浓度分别为0mol/l、0.lmol/l、0.2mol/l、0.3mo1/l、0.4mo1/l、0.5mo1/l)，流速lml/min，每个浓度洗脱体积为2～3bv，于280nm处洗脱峰收集洗脱液，每管6ml分部收集，并用v型凝血板法检测每管的凝集活性，收集合并具有凝集活性的组分，对蒸馏水透析除去盐分，冷冻干燥，即为糖蛋白粗提物。
91.第二次层析：取糖蛋白粗提物冻干粉溶于蒸馏水中，上凝胶sephadexg75(2.4
×
45cm)柱，用5mm ph8.0的磷酸缓冲液洗脱，洗脱条件:流速5ml/h，每管3ml，于280nm处洗脱峰收集洗脱液，并测定每管的凝集活性，收集合并具有凝集活性的组分，透析后将上清液冻成干粉，即为糖蛋白的冻干粉。
92.6、糖蛋白的冻干粉凝集效价的检测
93.红细胞悬液的制备：取小鼠血浆加3.8％枸橼酸钠抗凝，2000rpm离心10min。吸弃上层血浆和白细胞，取沉淀细胞，用0.1％胰蛋白酶在37℃下处理1h，去除红细胞表面非特异性吸附的血浆球蛋白，用生理盐水洗涤3～5次，每次以2000rpm离心5min，最后将红细胞沉淀用生理盐水配成2％红细胞悬液。
94.凝集效价的测定：在v型凝血板上，每孔加入25μl的血球缓冲液(ph7.2的0.075mo1/l磷酸缓冲液含0.075mo1/l氯化钠)，第1孔加入25μl样品(浓度为2.5mg/ml)，然后倍比稀释，混匀。每孔加入2％新鲜血球悬液25μl，振荡后，放置1～2h，观察结果，以能使红细胞凝集的最大样品稀释倍数为凝集效价(t)，凝集活性(ha)以产生红细胞50％凝集作用时所需要的最低凝集素浓度的倒数(mg/ml)表示。相对活性(rha)是指每毫克凝集素所具有的凝集活性(ha/mg)。
95.7、sds-聚丙烯酞胺凝胶电泳分析糖蛋白含量
96.分离胶浓度7％、ph8.9，浓缩胶浓度2.5％、ph6.7，垂直板电泳，电压100～200v。样品溶于样品缓冲液(含1％sds，5％琉基乙醇，10％的甘油，0.2％溴酚蓝)，100℃下加热处理5min，10％三氯乙酸-1％考马斯亮蓝r250染色，10％三氯乙酸脱色。电泳结束后，利用epalyzer 2型全自动电泳仪对电泳谱图进行扫描，根据扫描的结果计算对应样品中的糖蛋白的含量。
97.8、发酵提取物的人参皂苷和芦荟苷的检测
98.供试品溶液：用5％的香草醛冰乙酸溶液溶解发酵提取物，再加入4倍体积的高氯酸(需避光保存)充分混匀，置于60℃水浴处理15min，冷却至室温后，向其中加入上述混合液体积的5％的冰乙酸，震荡均匀后，用0.45μm滤膜过滤，以作为供试品溶液。
99.标准品溶液：
100.人参皂苷re(cas:52286-59-6，纯度：hplc》＝98％，南京狄尔格医药科技有限公司)、rg1(cas:22427-39-0，纯度：hplc》＝98％，南京源植生物科技有限公司)、人参皂苷rbl(cas:41753-43-9，纯度：》＝98％，武汉天植生物技术有限公司)、人参皂苷rb2(cas:11021-13-9纯度：99％，化夏化学)、人参皂苷rc(cas:11021-14-0纯度：98％，北京百灵威科技有限公司)和人参皂苷rd(cas:52705-93-8，纯度：98％，北京百灵威科技有限公司)，分别用甲醇制成每1mg/ml的标准品溶液，用0.45μm滤膜过滤。
101.hplc色谱条件：agilent zorbax eclipse xdb-c18色谱柱(250mm
×
4.6mm，5μm)；流动相a为乙腈，b为水，梯度洗脱程序为0
→
5min，5％a；5
→
25min，5％
→
40％a；25
→
35min，40％a
→
5％a；检测波长为203nm；柱温为30℃；流速为1ml/min。
102.标准曲线：吸取各标准品溶液，按照2
×
、4
×
、6
×
、8
×
比例稀释后，分别按照上述hplc色谱条件进行检测，根据特征峰面积和浓度对应关系制作标准曲线，将供试品溶液以同样的检测方法检测，根据特征峰面积计算各供试品中对应的人参皂苷浓度，并计算发酵提取物中人参皂苷含量。如图1所示为典型的供试品(发酵提取物)的人参皂苷检测hplc图谱。
103.9、芦荟苷含量检测
104.供试品溶液：参照上述步骤。
105.标准品溶液：精密称取芦荟苷的标准品，用甲醇溶解配制成1mg/ml。
106.hplc色谱条件：色谱柱：agilent zorbax eclipse xdb-c18色谱柱(250mm
×
4.6mm，5μm)；流动相a为乙腈，流动相b为质量分数0.05％磷酸溶液；梯度洗脱程序(体积分数)为0
→
5min，20％a；5
→
30min，20％a
→
90％a；30
→
31min，90％a
→
20％a；31
→
35min、20％a；流速为1.0ml/min；检测波长:300nm；柱温:25℃；进样体积:10μl。如图2所示为典型的供试品(发酵提取物)的芦荟苷检测hplc图谱。
107.10、数据处理
108.所有测试数据均以平均值和标准偏差表示，应用spss13.0软件处理数据，并对数据进行多重比较和显著性差异标记。
109.二、结果
110.表1 mg/g
[0111][0112][0113]
表2 mg/g
[0114]
[0115][0116]
表1和表2列出了实施例1～6和对比例1～8提供的发酵提取物、以及人参根提取物和芦荟提取物中的相关的活性成分含量。由表1可知，相对于芦荟提取物和对比例1～8分别提供的发酵提取物，实施例1～6提供的发酵提取物中糖蛋白、芦荟苷和可溶性糖含量均显著升高。结合前述对“发酵”过程的描述，实施例1～6在其“制备工作种子液”中使用的种子培养基、以及在“制备发酵液”中使用的发酵培养基均与对比例1～6不同，从而使得实施例1～6提供的发酵提取物中糖蛋白、芦荟苷和可溶性糖含量显著升高。
[0117]
由表2可知，相对于芦荟提取物和对比例1～8分别提供的发酵提取物，实施例1～6提供的发酵提取物中人参皂苷rg1、人参皂苷re、人参皂苷rb1、人参皂苷rb2、人参皂苷rc和人参皂苷rd含量均显著升高。结合前述对“发酵”过程的描述，实施例1～6在其“制备工作种子液”中使用的种子培养基、以及在“制备发酵液”中使用的发酵培养基均与对比例1～6不同，从而使得实施例1～6提供的发酵提取物中人参皂苷rg1、人参皂苷re、人参皂苷rb1、人参皂苷rb2、人参皂苷rc和人参皂苷rd含量显著升高。
[0118]
发酵提取物性能试验
[0119]
为进一步阐明本技术实施例提供的发酵提取物中糖蛋白、芦荟苷、可溶性糖、人参皂苷rg1、人参皂苷re、人参皂苷rb1、人参皂苷rb2、人参皂苷rc和人参皂苷rd含量显著高于芦荟提取物或人参提取物的作用，本技术实施例还进行了如下性能试验：
[0120]
1、dpph自由基清除试验
[0121]
通过构建dpph自由基清除反应体系，评估实施例1～6和对比例1～8分别提供的发酵提取物的抗氧化活性，如表3所示。供试品溶液：ph为6.8磷酸缓冲液溶解各发酵提取物后，稀释成相应受试浓度0.5wt％(质量百分浓度)。dpph自由基清除反应体系为参照表4所示分为a、b和c三个组别进行加液，加样结束后，25℃水浴下恒温反应20min，在517nm处测定各a、b和c吸光值。dpph清除率＝[(b+c)－a]/b
×
100％，式中，a、b、c为对应反应管反应结束后在517nm处的吸光值。
[0122]
表3(ml)
[0123]
试剂abc供试品溶液1.5－1.50.2mm dpph溶液1.51.5－无水乙醇－1.51.5
[0124]
2、抑制酪氨酸酶试验
[0125]
构建酪氨酸酶催化反应体系，来评价实施例1～6和对比例1～8分别提供的发酵提取物对酪氨酸酶的抑制效果。
[0126]
供试品溶液：ph为6.8磷酸缓冲液溶解各发酵提取物后，稀释成相应受试浓度0.5wt％(质量百分浓度)。
[0127]
酪氨酸酶催化反应体系为参照表4所示分为a、b、c和d四个组别进行加液，加样结束后，37℃水浴下恒温反应20min，在475nm处测定各a、b、c和d吸光值。酪氨酸酶抑制率＝[(a－b)－(c－d)]/(a－b)
×
100％，式中，a、b、c、d为对应反应管反应结束后在475nm处的吸光值。
[0128]
表4(μl)
[0129]
试剂abcd供试品溶液－－400400500u/ml酪氨酸酶液250－250－0.5wt％l-酪氨酸400400400400ph＝6.8磷酸缓冲液7501000350600
[0130]
3、抑制透明质酸酶试验
[0131]
构建透明质酸酶体外抑制elson-morgan法反应体系，来评价实施例1～6和对比例
1～8分别提供的发酵提取物对透明质酸酶的抑制效果。供试品溶液：ph＝5.6的醋酸缓冲液溶解各发酵提取物后，稀释成相应受试浓度0.5wt％(质量百分浓度)。
[0132]
透明质酸酶体外抑制elson-morgan法反应体系为参照表5所示分为a、b、c和d四个组别进行加液，按照以下加入步骤：氯化钙溶液、透明质酸酶溶液37℃保温20min；加入受试样品，继续37℃保温20min；加入透明质酸钠溶液37℃保温30min，常温放置5min；加入0.4mol/l氢氧化钠溶液和乙酰丙酮溶液，置于沸水浴中加热15min后立即用冰水进行冷却5min；加入埃尔利希试剂和无水乙醇进行稀释，放置20min显色，用分光光度计测定反应体系在555nm下的吸光度值。透明质酸酶抑制率＝[(a－b)－(c－d)]/(a－b)
×
100％，式中，a、b、c、d为对应反应管反应结束后在555nm处的吸光值。
[0133]
表5(ml)
[0134]
试剂abcd供试品溶液－－0.50.5500u/ml透明质酸酶液0.5－0.5－0.25mm氯化钙溶液0.10.10.10.10.25mm透明质酸钠溶液0.50.50.50.50.4mol/l氢氧化钠溶液0.10.10.10.1乙酰丙酮溶液0.50.50.50.5埃尔利希试剂1.01.01.01.0无水乙醇3.03.03.03.0ph＝5.6的醋酸缓冲液0.51.0－0.5
[0135]
4、结果
[0136]
表6 mg/g
[0137]
[0138][0139]
表6列出了各实施例1～6和对比例1～8提供的发酵提取物、芦荟提取物以及人参根提取物分别对dpph自由基清除率、酪氨酸酶抑制率和透明质酸酶抑制率。由表6可知，实施例1～6提供的发酵提取物的dpph自由基清除率、酪氨酸酶抑制率和透明质酸酶抑制率均显著高于对比例1～8提供的发酵提取物、芦荟提取物以及人参根提取物，说明本技术实施例提供的发酵提取物具有更佳的抗氧化能力，更强的抑制酪氨酸酶抑制率提示其可能具有更强的抑制体内黑色素沉积的作用，具有发展作用美白或者亮肤的化妆品的潜力；同时，由于透明质酸酶是一种能够降低体内透明质酸的活性，从而提高组织中液体渗透能力的酶，而实施例1～6提供的发酵提取物具有更高的透明质酸酶抑制率意味着能够在体内或皮肤组织中上调其中透明质酸含量，提高皮肤组织保湿和亮度，保持皮肤组织的年轻状态，同时还能皮肤组织抵抗炎症的发生提供帮助。
[0140]
动物实验
[0141]
为进一步证实本技术实施例1～6提供的发酵提取物在美白亮肤方面的功效，本技术实施例进一步进行了相关动物实验，实验方法如下：
[0142]
一、材料与方法
[0143]
1、实验动物
[0144]
wistar大鼠，雌性，体重300g左右，9～12周龄，购于江苏悟空生物科技有限公司，实验期间动物环境保持在恒温、恒湿条件下，正常饮食。
[0145]
2、供试品
[0146]
根据前述内容可知，本技术实施例公开了一种美白亮肤的组合物，包含参照上述实施例1～6所述的方法制得的发酵提取物。
[0147]
其中，发酵提取物包含23.7～50.58mg/g糖蛋白、7.48～14.57mg/g芦荟苷、41.49～58.19mg/g可溶性糖、7.72～10.98mg/g人参皂苷rg1、5.46～6.95mg/g人参皂苷re、3.39～5.41mg/g人参皂苷rb1、4.06～5.05mg/g人参皂苷rb2、2.8～3.46人参皂苷rc和2.48～2.85mg/g人参皂苷rd。
[0148]
其中，发酵提取物是经过将丁酸梭菌进行活化后接种于工作种子培养液中厌氧培养制得工作种子液，然后转接至发酵培养基中厌氧培养制得发酵液，再将发酵液进行提取得到。其中，工作种子培养液包含1.25～8.5g/l芦荟提取物和1.25～4.5g/l人参根提取物，发酵培养基包含1.25～8.5g/l芦荟提取物、1.25～4.5g/l人参根提取物、珍珠粉0.22g/l、烟酰胺0.12g/l。
[0149]
进一步的实施例中，该美白亮肤组合物还包括珍珠粉和烟酰胺。具体的，该美白亮肤组合物按重量份计包括10～500份上述的发酵提取物，10～200份珍珠粉以及10～100份烟酰胺。
[0150]
为进一步地将该美白亮肤组合物应用于化妆品领域，本技术实施例提供的组合物还包括保湿剂、润肤剂、增稠剂、防腐剂和芳香剂中的至少一种；以组合物的总质量计，所述保湿剂的加入量为0.001～3wt％；所述增稠剂的加入量为0.001～0.5％；所述润肤剂的加入量为0.001～0.5wt％；所述防腐剂的加入量为0.001～1.5wt％。
[0151]
其中，所述保湿剂选自括异丙醇、丙二醇、丁二醇、泛醇、甘油和甘油聚醚-26中的至少一种。
[0152]
其中，所述润肤剂包括但不限于橄榄油、澳洲坚果油、甜杏仁油、葡萄籽油、鳄梨油、玉米油、芝麻油、大豆油、花生油、白池花籽油、红花籽油、狗牙蔷薇果油、刺阿干树仁油、霍霍巴籽油、向日葵籽油、毛瑞搁果油、角鳖烷、棕搁酸乙基己酯、肉豆寇酸异丙酯、氢化聚异丁烯、异十六烷、异十二烷、碳酸二乙基己酯、碳酸二辛酯、月桂酰肌氨酸异丙酯、异壬酸异壬酯、氢化聚癸烯、甘油三(乙基己酸)酯、鲸蜡醇乙基己酸酯、双-二乙氧基二甘醇环己烷1,4一二梭酸酯、辛酸/癸酸甘油三醋、油醇芥酸酯、辛基十二醇肉豆范酸酯、辛基十二醇、聚二甲基硅氧烷、辛基聚甲基硅氧烷、鲸蜡基聚二甲基硅氧烷、环五聚二甲基硅氧烷、鲸蜡醇、硬脂醇、鲸蜡硬脂醇、山箭醇、鳖肝醇、月桂酸、肉豆范酸、棕搁酸、硬脂酸、蜂蜡、小烛树蜡、巴西棕搁蜡、羊毛脂、地蜡、霍霍巴籽蜡、石蜡、微晶蜡、氢化米糠蜡、氢化椰油甘油酯类、甘油山箭酸酯/二十酸酯、肉豆范醇肉豆荔酸酯、双-二甘油多酰基己二酸酯-2、牛油果树果脂和木鲁星果棕籽脂中的至少一种。
[0153]
其中，所述增稠剂包括丙烯酸(酯)类及其衍生物、黄原胶、阿拉伯胶、聚乙二醇-14m、聚乙二醇-90m、琥珀酞聚糖、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素中的至少一种。
[0154]
其中，所述防腐剂包括羟苯甲酯、羟苯丙酯、苯氧乙醇、苯甲醇、苯乙醇、双(羟甲基)咪哇烷基脉、山梨酸钾、苯甲酸钠、氯苯甘醚、脱氢乙酸钠、辛酞经脂酸、1,2-己二醇、1,2-戊二醇、对羟基苯乙酮、辛甘醇、甘油辛酸酯、十一碳烯酸甘油醋、山梨坦辛酸酯和乙基己基甘油中的至少一种。
[0155]
其中，该美白亮肤的组合物的化妆品剂型选自面霜、精华、乳液、亮肤水中的至少一种。
[0156]
为进一步本技术实施例提供的美白亮肤组合物作为具体的应用，将其配方列入表7，其按照常规的化妆品制备方法进行制备混合、均质等，以制得最终的剂型。
[0157]
表7
[0158][0159][0160]
2、衰老模型的建立
[0161]
取wistar大鼠每天颈背部皮下注射注射d-半乳糖1000mg/kg，连续注射7周后作为衰老模型大鼠。将其分为模型组、阳性对照组和干预组。阳性组每日在大鼠背部注射区域涂抹1～2g维生素e，干预组每日在大鼠背部注射区域涂抹1～2g实施例1～6、对比例1～10分
别提供的美白亮肤组合物，连续涂抹3个月后，进行相关指标的检测。另外设立未进行造模的正常wistar大鼠作为正常组。
[0162]
3、大鼠皮肤含水量的测定
[0163]
将模型组、阳性对照组和干预组大鼠在末次给药结束后，以及正常组大鼠，利用脱毛膏脱去大鼠背部注射区域毛后，取后背部皮肤组织1.5
×
1.5cm左右，生理盐水漂洗，剔除皮下脂肪等，滤纸拭干，称湿重。然后放80℃干燥箱烘12h，称干重并记录，计算含水率。皮肤的含水率＝(皮肤湿重－皮肤干重)/皮肤湿重
×
100％。
[0164]
4、大鼠皮肤组织中相关制备检测
[0165]
测定皮肤含水率后，将肝脏皮肤组织加入9倍重量的4℃生理盐水，匀浆3～5min，3000rpm离心15min，取上清4℃保存待测，利用羟脯氨酸(hyp)、透明质酸(ha)、超氧化物歧化酶(sod)、丙二醛(mda)和脂褐质(lf)h试剂盒检测上清液中含量。羟脯氨酸试剂盒，50t/48s，boxbio。透明质酸试剂盒，48t/96t，臻科生物。超氧化物歧化酶试剂盒，48t/96t，er0332，菲恩生物。丙二醛试剂盒，48t/96t，le-b0424，莱尔生物。脂褐质试剂盒，96t，仑昌硕生物。
[0166]
5、大鼠皮肤组织观察
[0167]
取大鼠背部正中0.5cm2大小皮肤，放入4％多聚甲醛固定12-24h，常规脱水、透明、浸蜡、包埋，石蜡切片，厚度sum，贴片至载玻片。二甲苯脱蜡，逐级乙醇复水至水洗，苏木素染色，自来水洗，盐酸乙醇分化，自来水浸泡，he染色，常规脱水，透明中性树胶封片，在光学显微镜下，观察各剂量组大鼠的皮肤组织。
[0168]
6、大鼠皮肤黑色素和血红素的含量检测
[0169]
通过测定特定波长的光照射于皮肤得到的反射量来确定皮肤中黑色素和血红素的含量。具体测试方法为：利用conemeter mpa 580皮肤测试仪的黑色素和血红素测试探头mx 18，测定皮肤黑色素和血红素的含量。
[0170]
7、大鼠皮肤亮度评价
[0171]
按照《化妆品接触性皮炎诊断标准及处理原则》方法进行各组大鼠皮肤亮度l值检测。
[0172]
8、数据处理
[0173]
所有测试数据均以平均值和标准偏差表示，应用spss13.0软件处理数据，并对数据进行多重比较和显著性差异标记。
[0174]
二、结果
[0175]
对各组小鼠皮肤组织进行切片和he染色，进行显微拍照，结果如图3所示，正常对照组大鼠皮肤表皮组织结构框架完整，细胞分层清晰，真皮层较厚，其内可见呈致密排列的波浪状胶原纤维。衰老模型组大鼠皮肤细胞分层不清，真皮层变薄明显，胶原纤维减少，排列疏松。阳性对照组大鼠真皮层与模型组相差不大，而胶原纤维较多，排列较为致密。干预组与衰老模型组相比，大鼠真皮层胶原纤维明显增多，排列致密，真皮厚度明显增加甚至与正常对照组相接近。
[0176]
表8
[0177]
[0178][0179]
[0180]
表8示出了各实验组大鼠的皮肤组织中hyp、ha、sod、mda和lf含量情况。由表8可知，相对于正常组，模型组大鼠hyp、ha和sod含量均显著升高，而mda和lf含量均显著升高，说明衰老模型wistar大鼠构建成功。
[0181]
干预组中，实施例1～6提供的美白亮肤组合物涂抹模型大鼠的注射区域皮肤后，其皮肤组织中hyp、ha和sod含量均相对于模型组显著升高，并与正常组相差不大；其皮肤组织中mda和lf含量均相对于模型组显著降低至与正常相差无异，由此说明本技术实施例提供的美白亮肤组合物具有明显调节衰老模型大鼠皮肤组织中hyp、ha、sod、mda和lf含量。hyp与皮肤胶原蛋白合成有关，ha能够提高皮肤保湿性保持皮肤细胞的代谢正常和年轻化，sod能够提高皮肤组织抗氧化能力，减少mda能够减少皮肤组织脂质过氧化物堆积，lf含量代表皮肤组织中色素的沉积情况，综合表明，本技术实施例提供的美白亮肤组合物能够促进本技术实施例提供的美白亮肤组合物能够促进胶原蛋白合成，减少皮肤组织脂质过氧化物堆积，提高其抗氧化能力并减少其中色素堆积，不仅能起到抗皮肤衰老，还能起到美白亮肤的作用。
[0182]
而干预组中，对比例1～10提供的美白亮肤组合物涂抹模型大鼠的注射区域皮肤后，其皮肤组织中hyp、ha和sod虽然相对于模型组升高，但仍与正常组差异显著；其皮肤组织中mda和lf含量均相对于模型组降低，但仍至与正常相差显著，由此说明对比例1～10提供的美白亮肤组合物对模型大鼠的功效作用不佳。
[0183]
表9
[0184][0185][0186]
表9示出了各实验组大鼠的皮肤组织中含水率，mi指数和ei指数，以及相对于正常组的l值变化率。由表9可知，模型组大鼠皮肤组织的含水率和ei指数显著降低，mi指数显著
升高，l值显著降低，说明模型组大鼠皮肤含水降低，皮肤干燥，黑色素沉积严重，而血红素指数降低表明皮肤血红素欠缺，皮肤无血气不足，进而导致其皮肤亮度不足，l值显著降低。
[0187]
干预组中，实施例1～6提供的美白亮肤组合物涂抹模型大鼠的注射区域皮肤后，其皮肤组织中含水量、ei指数和l值均相对于模型组显著升高，并与正常组相差不大；其皮肤组织中mi指数均相对于模型组显著降低至与正常相差无异，由此说明本技术实施例提供的美白亮肤组合物显著减少了模型大鼠皮肤组织中黑色素沉积，提高其血红素含量，使得皮肤红润，并且含水量促进，进一步促进皮肤美白和亮度增加。
[0188]
而干预组中，对比例1～10提供的美白亮肤组合物对模型大鼠的含水量、黑色素沉积、血红素改善以及亮度促进功效作用不佳。
[0189]
综上所述，本技术实施例利用丁酸梭菌对芦荟提取物和人参根提取物进行发酵，得到了一种发酵提取物，其中包含高含量的糖蛋白、芦荟苷、可溶性糖以及各类人参皂苷，包含了芦荟提取物和人参根提取物中各类活性成分，并且含量显著高于芦荟提取物和人参根提取物。经过性能试验证实了，该发酵提取物具有更佳的抗氧化能力，更强的抑制酪氨酸酶抑制率提示其可能具有更强的抑制体内黑色素沉积的作用，具有发展作用美白或者亮肤的化妆品的潜力；同时，该发酵提取物具有更高的透明质酸酶抑制率意味着能够在体内或皮肤组织中上调其中透明质酸含量，提高皮肤组织保湿和亮度，保持皮肤组织的年轻状态，同时还能皮肤组织抵抗炎症的发生提供帮助。
[0190]
本技术还通过动物实验发现，由该发酵提取物制得的美白亮肤组合物能够促进衰老模型大鼠胶原蛋白合成，减少皮肤组织脂质过氧化物堆积，提高其抗氧化能力并减少其中色素堆积，提升皮肤亮度；不仅能起到抗皮肤衰老，还能起到美白亮肤的作用。
[0191]
以上所述，仅为本技术较佳的具体实施方式，但本技术的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本技术揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本技术的保护范围之内。