基于牛β防御素5的结核疫苗及其在预防结核病中的应用

基于牛
β
防御素5的结核疫苗及其在预防结核病中的应用
技术领域
1.本技术属于动物疾病免疫和疫苗领域，具体地，本技术提供了基于牛β防御素5的结核疫苗及其在预防结核病中的应用。


背景技术：

2.结核病(tuberculosis，tb)由结核分枝杆菌复合群(mycobacterium tuberculosiscomplex，mtbc)引起，其中最主要的两种病原体为结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis，mtb)和牛分枝杆菌(mycobacterium bovis，m.bovis)。主要由mtb引起的 tb给全球人类健康造成巨大的危害，每年100万以上的人因mtb而死亡。由m.bovis引起的牛结核(bovine tuberculosis,btb)是一种对全球人类健康和养殖业发展有重大影响的人兽共患病，不但给养殖业造成严重的经济损失，还对人类的健康造成威胁，在一些国家或地区，3.1％-30.2％的tb病人由m.bovis感染引起。btb被世界动物卫生组织(worldorganization for animal health，oie)列入b类动物疾病，被我国农业部门列入二类动物疫病。目前对人类tb的控制措施是在婴幼儿时期接种卡介苗(bacille calmette-guerin， bcg)，但bcg仅对儿童有效，对成年人无效。对btb的控制则采取“诊断-扑杀”的方式进行净化根除处理，然而，这一措施成本高，在发展中国家难以实施。尽管人们经过上百年的努力来控制tb，但至今结核病形势依然严峻，严重影响人类健康和养殖业发展。
3.将宿主的免疫调节活性分子设计到结核疫苗中已有报道，如鼠β防御素2，细胞因子 il-12和巨噬细胞集落因子等，主要用于dna疫苗设计中。但将牛β防御素5应用到结核疫苗的研究尚未见报道。我们前期研究发现呼吸道黏膜牛β防御素5(b5)能促进疫苗诱导的特异性免疫应，增强机体抵抗m.bovis感染的免疫调节作用(专利号：cn202110285747.6)。但b5在毕赤酵母菌和大肠杆菌中表达量低，我们设计的疫苗将用于靶动物牛，牛为大型动物，使用量大，b5的低表达不利于后续的临床应用。


技术实现要素：

4.针对以上问题，申请人进一步将将结核菌抗原ah和b5进行融合表达设计了两种疫苗，即融合蛋白疫苗ahb-p和融合dna疫苗pvax1-ahb，其中，pvax1-ahb疫苗不需要额外添加佐剂，大大降低了疫苗制备成本，而且实际研究证实了ahb-p和pvax1-ahb经呼吸道黏膜免疫可预防结核感染。
5.一方面，本技术提供了一种结核疫苗，所述结核疫苗包含结核菌ah抗原和牛β防御素 5的融合蛋白ahb。
6.进一步地，所述融合蛋白ahb由seq id no.1所示的核苷酸序列编码；优选地，所述结核疫苗中还包含疫苗中还包括聚肌胞(poly i:c)。
7.一方面，本技术提供了一种结核疫苗，所述结核疫苗包含pvax1-ahb构建体，所述构建体中包括编码结核菌ah抗原和牛β防御素5的核酸。
8.进一步地，所述构建体包含序列为seq id no.2的核酸以及载体pvax1。
9.进一步地，所述疫苗中还包含佐剂和/或辅料。
10.进一步地，所述包含pvax1-ahb构建体的结核疫苗中不包含佐剂。
11.进一步地，所述疫苗为经黏膜使用的疫苗。
12.进一步地，所述疫苗为经呼吸道黏膜使用的疫苗。
13.进一步地，所述疫苗为经鼻黏膜使用的疫苗。
14.进一步地，本技术提供了上述疫苗在制备预防或治疗牛分枝杆菌(mycobacterium bovi) 所导致的疾病中的应用
15.进一步地，所述牛分枝杆菌(mycobacterium bovi)所导致的疾病为牛结核病。
16.本技术中所述的牛β防御素5也称为β-defensin-5、b5或简写为b；本技术中所述的牛β防御素5序列不限于实施例中实际制备时所用序列，其他已知和未知的天然和人工的变体也可以使用。本技术中所述的ah抗原为由ag85a和hspx经过各种方式连接而成的抗原，本技术中所述的ag85a和hspx序列不限于实施例中实际制备时所用序列，其他已知和未知的天然和人工的变体也可以使用。
17.本技术中的黏膜疫苗可以为通过口腔、鼻、胃、上呼吸道黏膜等施用的疫苗，优选通过鼻黏膜施用的疫苗。
18.本技术的佐剂包含各种本领域已知和在研的用于增强免疫效果的佐剂，包括但不限于矿物质类佐剂、油乳类佐剂、微生物类佐剂。
附图说明
19.图1：ahb的纯化和鉴定：(a)ahb的纯化；(b)ahb的western blot鉴定；(c)pvax1-ahb 表达鉴定；
20.图2a和图2b：疫苗对肺脏产生ah特异性ifn-γ或il-17的cd4
+
t细胞的影响；***p 《0.0001；
21.图3：疫苗的保护作用评价：(a)左肺he染色切片扫描；(b)肺炎性面积百分比；(c和 d)肺和脾的细菌载量；*p《0.033,**p《0.0021,***p《0.0002。
具体实施方式
22.实施例1融合疫苗的制备
23.融合基因序列的密码子优化
24.(1)ahb-p融合蛋白疫苗的ahb序列根据大肠杆菌偏好的密码子进行优化，优化后的基因序列如下：
[0025][0026]
(2)pvax1-ahb融合dna疫苗的ahb序列根据牛(bos taurus)偏好的密码子进行优化，优化后的基因序列如下：
[0027][0028]
ahb融合蛋白的制备
[0029]
ahb基因序列两端加入酶切位点5'(kpni)和3'(bamhi)，通过双酶切连接到原核表达载体pet-30a(+)，并转化到大肠杆菌感受态细胞bl21(de3)，用含卡那霉素(50μg/ml)的 lb培养基培养细菌至对数生长期(od
600nm
为0.6-0.8)，加入1mm的iptg，37℃摇床，160rpm，诱导表达4h，4℃，8000rpm离心3min收集菌体，并用预冷pbs洗两遍，菌体冻存于-80℃用于后续纯化。
[0030]
解冻菌体，用预冷pbs重悬(200毫升菌液沉淀加入20毫升pbs重悬)，在冰浴条件超声破碎菌体约30min直至涂片染色后镜下观察无明显可见的完整细菌。4℃，11000rpm离心 30min，收集沉淀(即包涵体蛋白)，用包涵体洗涤液ⅰ(20mm tris，100mm nacl，10mmedta，0.5％triton x-100，ph 8.4)充分洗涤，再用包涵体洗涤液ⅱ(20mm tris，100mmnacl，2mm尿素，ph 8.4)充分洗涤，将洗涤后的包涵体溶解于变性液(20mm tris，5mmedta，8m尿素)。用含不同浓度尿素(6m，4m，2m，1m，0.5m，0.1m，0m)的包涵体复性液(含20mm tris，1mm edta，100mm nacl，1mm还原型谷胱甘肽，0.1mm氧化型谷胱甘肽，10％甘油，ph为8.4)在4℃透析复性，每个尿素梯度复性4h以上。最后分别在ph 8.4和ph 7.4的pbs中进行透析去盐。
向蛋白溶液中加入1％triton x-114，用移液枪轻轻吹打混匀，冰浴30min，每隔5min混匀一次，37℃水浴10min，直至出现肉眼可见的分层现象，25℃，11000rpm，离心10min，将上清转移至无菌离心管中，如此重复2 次，去除大部分内毒素。0.22μm过滤除菌，分装，冻存于-80℃。纯化后的蛋白进行考马斯亮蓝染色和western blot(用抗his-tag抗体作为一抗)鉴定。
[0031]
pvax1-ahb融合dna疫苗的制备
[0032]
ahb基因序列两端加入酶切位点5'(kpni)和3'(noti)，通过双酶切连接到真核表达载体pvax1，并转化到大肠杆菌感受态细胞dh5α，用含卡那霉素(50μg/ml)的lb培养基培养细菌12-16h，常温，8000rpm离心3min收集菌体，用去内毒素质粒提取试剂盒提取 pvax1-ahb质粒。将质粒pvax1和pvax1-ahb分别转染到293t细胞，按每孔105个细胞铺于 24孔培养板，待贴壁后使用lipofectamine
tm
3000转染试剂(按试剂盒说明书进行)将0.5μg 质粒转染到293t细胞，在37℃和5％co2条件下孵育24h，收集全细胞蛋白质，用抗ah(1:500) 的小鼠多克隆血清作为一抗进行western blot检测。
[0033]
实施例2疫苗的免疫效果评价
[0034]
45只6-8周的雌性c57bl/6小鼠被随机分为5组，每组9只，分正常对照组(control)， bcg对照组(bcg)、pvax1-ahb免疫组(pvax1-ahb)，ahb-p免疫组(ahb-p)，攻毒模型组(m. bovis)。pvax1-ahb的鼻内免疫剂量为50μg/只，ahb-p的鼻内免疫剂量为40μg/只(ahb： 20μg/只；poly ic：20μg/只)，一共免疫3次，间隔3周。第二次免疫时皮下注射免疫 bcg(105cfu/只)。最后一次免疫3周后每组剖杀3只小鼠，分离肺组织细胞，用ah抗原刺激肺细胞8h后流式细胞术检测产生ifn-γ或il-17的cd4
+
t细胞。其余小鼠用m.bovis 鼻腔感染(约100cfu/只)，4周后采集右肺和脾脏用于cfu计数，左肺固定于10％的中性福尔马林用于组织病理学观察。
[0035]
融合疫苗ahb-p和pvax1-ahb提供抗m.bovis作用
[0036]
如图1所示，纯化的ahb纯度大于90％，约65kda(图1a)，用抗his标签抗体进行westernblot鉴定，结果显示nc膜上出现单一条带，符合预期大小(图1b)。用pvax1-ahb转染293t 细胞后，可见与预期大小相一致的条带，而转染了pvax1的细胞未表达目的蛋白(图1c)。由于pvax1-ahb质粒不带his-tag，而大肠杆菌表达的ahb带his-tag，因此在大肠杆菌里表达的ahb蛋白(约65kda)比在293t细胞表达的ahb蛋白(约61kda)分子量大。
[0037]
末次免疫三周后，我们检测了肺组织中分泌抗原特异性细胞因子的cd4 t细胞。结果显示，与control组，bcg组和pvax1-ahb组相比，ahb-p使肺组织中产生ifn-γ和il-17的 cd4+t细胞显著增多(图2a-b)，提示鼻内免疫融合蛋白疫苗ahb-p能诱导肺组织中产生cd4 t细胞反应，而鼻内免疫融合dna疫苗pvax1-ahb未能诱导这种免疫反应。为了探究两种融合疫苗对保护效力的影响，末次免疫后三周进行m.bovis滴鼻感染。感染四周后进行组织病理检测和细菌载量检测。结果显示，与m.bovis感染对照组相比，三个免疫组肺脏中的炎性面积明显减少，而pvax1-ahb组的肺脏炎性面积最少(图3a和b)。与之相一致，各个免疫组肺脏的细菌载量显著低于m.bovis感染对照组，其中，pvax1-ahb组的肺脏细菌载量最低 (图3c)；与m.bovis感染对照组相比，三个免疫组的脾脏细菌载量明显减少，ahb-p和bcg 显著减少了脾脏中的细菌载量，而pvax1-ahb组和m.bovis感染对照组的脾脏载菌量未显示具有统计学意义的差异(图3d)。这些结果表明两种融合疫苗均能提供抗m.bovis保护作用。
[0038]
此实施例仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，
任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。