纳米二氧化钛在调节肠道菌群中的新应用的制作方法

1.本发明属于生物医药领域，具体涉及纳米二氧化钛在调节肠道菌群中的新应用。


背景技术：

2.纳米二氧化钛(titanium dioxide nanoparticles,ntio2)是各种工业中生产最广泛的纳米材 料之一，据估算全球每年的ntio2消费量达1000万吨，主要应用于化妆品和涂料。ntio2根 据晶型可分为锐钛矿型，金红石型及板钛矿型，其中锐钛矿型及金红石型较为常见；又可根 据疏水性分为亲水型和疏水型。ntio2良好的抗菌效果和阻隔能力使其复合包装材料得以广泛 的应用；因其对紫外线具有吸收作用，ntio2用于防晒霜及喷雾的生产；而ntio2良好的吸附 特性及光催化特性在环境污染治理中为废气的吸收及废水的处理提供了有效的方法。二氧化 钛可作为着色剂(e171)添加到糖果涂层、口香糖、冰淇淋、牙膏等食品和日用品中，而e171 中的二氧化钛颗粒一部分为纳米级，按数量计占5％～50％，按质量计最多占30％。
3.镉(cd)是银白色有光泽的金属，广泛用于合金制造、电镀等工业领域，采矿活动及工 业废水中的cd造成环境水及土壤污染后，由于大部分cd化合物有较高的溶解度，极易被植 物吸收，通过环境及食物链在无脊椎动物和脊椎动物体内蓄积。cd污染在我国乃至全世界一 直是一个突出的环境问题，cd暴露及其毒性也一直深受人们关注。19世纪70年代日本神通 川的“痛痛病”被认为是长期摄入cd污染的农作物引起的慢性中毒，而至今cd污染的问题仍 未得到解决。
4.随着测序技术的发展，我们开始认识到人体肠道微生物的数量之大、种类之多。人的肠 道中定居着1000多个属的微生物，数量超过100万亿个，形成了肠道微生物区系，其编码的 基因总数超330万个，是人类基因组的150倍。越来越多研究将肠道菌群的结构、功能与宿 主的生理、营养、免疫和代谢过程联系起来，认为肠道菌群在保持宿主健康的稳定方面起着 至关重要的作用。肠道微生物的组成和丰度改变，或功能的紊乱可能介导多种疾病的发展。 此外，肠道微生物一直被认为是有机污染物、抗生素、农药以及hms等环境污染物的靶点。
5.破坏肠道环境及肠道微生物平衡被认为是ntio2的安全隐患之一。过去的几年间，众多学 者进行了许多针对ntio2重复给样对大小鼠肠道菌群影响的研究，选用的受试物包括e171，涂 料级或工业级ntio2。这些研究大部分都报道了ntio2导致肠道菌群的紊乱失衡，包括肠道菌 群丰度变化，以及alpha多样性和beta多样性的减少(zhang s,jiang x,cheng s,et al.titaniumdioxide nanoparticles via oral exposure leads to adverse disturbance of gut microecology andlocomotor activity in adult mice[j].archives of toxicology.2020,94(6))。但bredeck等人用工业 级ntio
2 p25掺入饲料对大鼠给样21天，未发现肠道菌群的显著改变。上述结果的差异可能与 ntio2颗粒在晶型、粒径、疏水性、介质及前处理方式上的不同有关。
[0006]
肠道微生物区系被认为是调解包括cd在内的重金属毒性效应的重要角色。breton
等人指出， 肠道微生物区系是cd毒性的保护因素，服用cd的无菌小鼠血、肝、肾和脾的cd含量以及十二 指肠和结肠中的金属硫蛋白mt
‑ⅰ
、mt
‑ⅱ
的表达显著增加。长期和短期cd暴露对肠道微生物 的影响也被证实，认为cd暴露显著降低了大鼠肠道微生物区系的多样性和物种丰度，扰乱短 链脂肪酸的产生等肠道菌群生理功能，但研究中cd暴露方式等差异可能会导致对特定菌群的 影响不一致。
[0007]
目前关于ntio2与重金属的联合毒性研究表明，ntio2可以通过吸附重金属改变重金属在机 体中的有效浓度，从而改变重金属毒性。然而，关于ntio2与cd联合暴露对肠道菌群影响仍是 未知的。


技术实现要素：

[0008]
本发明的目的是提供一种纳米二氧化钛的新应用。
[0009]
包括以下技术方案。
[0010]
纳米二氧化钛在制备调节和/或治疗肠道菌群紊乱的制剂中的应用。
[0011]
纳米二氧化钛在制备调节和/或治疗由重金属造成的肠道菌群紊乱的制剂中的应用。
[0012]
一种调节和/或治疗由重金属造成的肠道菌群紊乱的制剂，其活性成分包括有纳米二氧 化钛。
[0013]
在其中一些实施例中，所述重金属为镉(cd)。
[0014]
在其中一些实施例中，所述纳米二氧化钛为食品级的亲水型ntio2。
[0015]
在其中一些实施例中，所述纳米二氧化钛的晶型为锐钛矿型。
[0016]
在其中一些实施例中，所述纳米二氧化钛的平均粒径为40.9
±
9.6nm。
[0017]
在其中一些实施例中，所述应用表现包括调节肠道菌群丰度和结构，提高肠道菌群多样 性。
[0018]
在其中一些实施例中，所述调节和/或治疗由重金属造成的肠道菌群紊乱包括降低脱铁菌 门(deferribacteres)和/或拟杆菌门(bacteroidetes)丰度，提高厚壁菌门(firmicutes)丰度。
[0019]
在其中一些实施例中，所述调节和/或治疗由重金属造成的肠道菌群紊乱包括提高罗姆布 茨菌属(romboutsia)、罗氏菌属(roseburia)、厌氧孢杆菌属(anaerosporobacter)、catabacter、 苏黎世杆菌属(turicibacter)、和/或严格梭菌属(clostridium_sensu_stricto)的丰度。
[0020]
在其中一些实施例中，所述调节和/或治疗由重金属造成的肠道菌群紊乱包括降低普雷沃 菌属(prevotella)、肠球菌属(enterococcus)、粘液杆菌属(mucispirillum)、螺旋杆菌属(helicobatacter)和/或脱硫弧菌属(desulfovibrio)的丰度。
[0021]
在其中一些实施例中，所述制剂是药物或者食品或者保健品。
[0022]
本发明的发明人在研究中发现，重金属(包括cd)能造成肠道菌群结构失衡，而纳米二 氧化钛可缓解重金属(包括cd)导致的肠道菌群结构失衡，包括调节肠道菌群丰度和结构， 提高肠道菌群多样性。在调节中，包括降低脱铁菌门(deferribacteres)和/或拟杆菌门 (bacteroidetes)的丰度，提高厚壁菌门(firmicutes)丰度；罗姆布茨菌(romboutsia)及罗 氏菌(roseburia)等的有益菌属丰度升高，而普雷沃菌属
(prevotella)、螺旋杆菌属 (helicobatacter)等炎症标志菌或致病菌丰度显著下降。根据纳米二氧化钛对cd导致的肠 道菌群失衡有拮抗作用，可将纳米二氧化钛应用于制备调节和/或治疗肠道菌群紊乱，特别是 由重金属包括cd造成的肠道菌群紊乱的药物或者食品或者保健品中的应用。
附图说明
[0023]
图1：ntio2的sem表征(a,bar＝300nm)及tem表征(b,bar＝200nm)。
[0024]
图2：ntio2的流体动力学粒径检测结果(a)和ntio2的zeta电位检测结果(b)。
[0025]
图3：ntio2的xrd检测结果。
[0026]
图4：各组大鼠试验期间体重变化。
[0027]
图5：各组大鼠试验期间摄食量。
[0028]
图6：各组大鼠试验期间食物利用率。
[0029]
图7：各组大鼠试验期间平均每日饮水量。
[0030]
图8：otu丰度等级曲线。
[0031]
图9：各组otu韦恩图。
[0032]
图10：各组大鼠肠道菌群alpha多样性。
[0033]
图11：各组大鼠肠道菌群beta多样性。
[0034]
图12：各组大鼠肠道菌群门水平物种丰度。
[0035]
图13：各组大鼠肠道菌群厚壁菌门与拟杆菌门(f/b)比值。
[0036]
图14：各组大鼠肠道菌群属水平物种丰度。
[0037]
图15：lefse分析结果：lda分值及进化分枝图。
具体实施方式
[0038]
本发明下列实施例未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所 建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
[0039]
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术 人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目 的，不用于限制本发明。
[0040]
在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系， 表示可以存在三种关系，例如，a和/或b，可以表示：单独存在a，同时存在a和b，单独 存在b这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
[0041]
本发明针对目前食品中的新材料ntio2和污染中仍然突出的高风险重金属cd污染问题， 利用啮齿类动物系统开展混合污染物的联合毒性效应评价研究，主要通过研究ntio2对cd主 要毒性作用肠道菌群的影响。
[0042]
与对照组相比，ntio2组中大鼠的肠道菌群alpha、beta多样性均未见差异。该组肠道菌 群丰度在门水平未出现显著差异，属水平中的butyricimonas出现显著下降；butyricimonas可 能对ntio2的暴露敏感。因此，对大鼠进行100mg/kg bw灌胃给予ntio2(40nm，锐钛矿) 12周未对大鼠肠道菌群造成显著影响。
[0043]
(1)与对照组相比，cd组大鼠的肠道菌群alpha多样性并未显著改变，而beta多样
14.7mv，证明室温下 超纯水的ph值大于ntio2的等电点，当其分散在超纯水中时带负电，利于对阳离子的吸附。
[0060]
1.3元素组成分析
[0061]
取少量ntio2粉末粘在碳导电胶布上，用能量色散x射线光谱仪(edx)进行元素组成 检测。结果见表1.3。
[0062]
表1.3 ntio2的edx表征结果
[0063][0064]
1.4晶体结构表征
[0065]
取少量ntio2粉末，研磨过300目筛，装入铝制样品盘，压平，放入x射线衍射仪(xrd) 检测晶体结构。测试条件：电压40kv电流40ma扫描角度：3-90
°
扫描速度：6
°
/min，入射 狭缝：1/2
°
，一维探测器d/tex ultra，步长0.02
°
，扫描模式：连续扫描。
[0066]
图3中可见样品呈现出良好结晶性，各衍射峰尖锐分明。图谱在25.2858
°
，36.931
°
，37.782
°
， 38.527
°
，48.017
°
，53.905
°
，55.025
°
，62.809
°
处的特征峰分别对应锐钛矿的晶面，而在27.42
°ꢀ
对应金红石的晶面，除这两种tio2相，无其他杂相出现。
[0067]
1.5比表面积测定
[0068]
称取一定量的ntio2置于u型测试管中，在单点模式下，以300℃的温度预处理15分钟 后，以n2为吸附质，he为载气，氦氮比7：3，测试程序下样品管放入液氮杯中保温，进行 n2吸附测试，吸附温度为77.30k，气体浓度为30.00％。
[0069]
通过bet法测得样品的比表面积为49.2059m2/g。
[0070]
2实验动物
[0071]
40只spf级5周龄雌性sd种大鼠，体重80～100g，购于广东省医学实验动物中心，实 验动物使用许可证号：syxk(粤)2018-0002。涉及动物的程序已经动物实验伦理委员会批 准。实验室动物的管理参照《良好实验室规范》(good laboratory practice,glp)的要求。 大鼠饲养在温度为20-26℃和相对湿度为40-70％的标准spf环境中，动物2只/笼，合笼饲 养，采用12h:12h昼夜间断照明。动物分组及暴露:大鼠检疫5天，期间每日检查动物1次， 记录动物的体形、被毛、皮肤、精神、粪便、眼睛、口鼻、呼吸等体征，如发现不健康的动 物立即剔除，选用健康大鼠进行实验。检疫最后一天称重，根据动物体重分层，随机分为4 组：对照组、ntio2组(灌胃给予100mg/kg bw ntio2混悬液)、cd组(饮水给予50mg cd/lcdcl2)和ntio2+cd组(饮水给予50mg cd/l cdcl2，灌胃给予100mg/kg bw ntio2混悬液)， 每组10只动物，每周给样7次，连续90天。在灌胃前将ntio2混悬液涡旋30s，利用超声仪 超声20min并涡旋3min。基于2016年efsa的评估，通过饮食暴露于ntio2的最大暴露量 为1.04mg/kg bw，
我们以100为安全系数设定了100mg/kg bw ntio2的剂量；根据文献报 道，我们选择了暴露12周引起明显的肾毒性50mg cd/l cdcl2的剂量。动物自由摄食和饮 水。经测定，纯净饮用水以及ntio2混悬液中使用的超纯水均不含cd，所用的灭菌饲料中 cd的浓度为0.095μg/g。
[0072]
表2.1动物分组
[0073][0074][0075]
为进行实验的质量控制，防止交叉污染，本实验对实验区域及实验器材进行了染cd与非 染cd的严谨区分。为保护环境，本实验对实验过程中产生的cd废水进行无害化处理。
[0076]
3标本采集与检测指标
[0077]
3.1一般临床观察：每天观察并记录1次，观察大鼠精神状态、外观体征、行为活动、腺体分 泌、呼吸、粪便及死亡等情况及其他毒性症状。
[0078]
各试验组大鼠一般生理体征、行为表现、外观、皮毛、黏膜、分泌物、大小 便等均未见异常，试验期间动物无死亡。
[0079]
3.2体重：前6周每周记录2次，之后每周测定1次；第90天记录所有动物体重，解剖当日 记录空腹体重。
[0080]
各剂量组大鼠体重与对照组比较，差异均无统计学意义(p》0.05)；各剂量组总增重与对照 组比较，差异均无统计学意义(p》0.05)，见图4。
[0081]
3.3摄食量：每周测定1次，根据增重及摄食量计算食物利用率。
[0082]
各组摄食量如图5所示：
[0083]
①
与对照组相比，ntio2组摄食量未见统计学差异；
[0084]
②
与对照组相比，cd组第一周、第八周摄食量显著降低；
[0085]
③
与对照组相比，ntio2+cd组第一周、第七周、第十周摄食量显著降低；与cd组相比 第七周摄食量显著降低。
[0086]
④
各剂量组试验期间总摄食量与对照组比较，差异均无统计学意义。
[0087]
3.4食物利用率
[0088]
各组食物利用率如图6所示(其中第五周、第九周的食物利用率因尿液采集24h禁食而 下降)：
[0089]
①
与对照组相比，ntio2组食物利用率仅在第九周显著升高；
[0090]
②
与对照组相比，cd组食物利用率在第二周、第六周、第十三周显著增加，第八周显著 降低；
[0091]
③
ntio2+cd组与对照组相比，第十三周食物利用率显著增加；与cd组相比，第二周食 物利用率显著降低，而第八周显著增加。
[0092]
④
各剂量组试验期间总食物利用率与对照组比较，差异均无统计学意义。
[0093][0094]
综上，剂量组在个别时间点与对照组相比摄食量与食物利用率有显著差异，但这些差异未 见时间连续性，同时各组总摄食量及总食物利用率未见统计学差异，因此ntio2与cd单独或 联合给样对大鼠的摄食量和食物利用率无明显影响。
[0095]
3.3饮水量：每周测定2次。根据试验期间饮水量及cd浓度计算cd实际摄入量。
[0096]
各组饮水量及cd实际摄入量如图7所示：
[0097]
(1)ntio2组的饮水量与对照组相比仅在第三、第八周有显著差异(p《0.05)；在整个实验 过程的总饮水量无显著差异。
[0098]
(2)cd组与对照组比较，在整个实验过程的饮水量均显著降低，差异有统计学意义(p《0.01)； 总饮水量与对照组相比显著降低(p《0.01)。
[0099]
(3)ntio2+cd组与对照组比较，在整个实验过程的饮水量显著降低，差异有统计学意义(p《 0.01)；与cd组相比，部分时间点有统计学差异，但总饮水量无显著差异。
[0100]
(4)根据饮水量计算cd实际摄入量，cd组和ntio2+cd组在实验期间的平均每日cd实际 摄入量分别为0.996
±
0.043mg/rat(3.75-4.45mg/kg bw)和0.941
±
0.097mg/rat(3.17-4.73 mg/kg bw)。
[0101]
4.其他材料与仪器
[0102]
表4-1实验所用试剂
[0103]
试剂规格/货号生产厂家magpure stool dna kf kit bmd5115广州美基生物科技有限公司qubit dsdna br assay kitq32853美国invitrogenagencourtampre xpa63881美国beckman coulter
[0104]
5.实验方法
[0105]
5.1标本采集及总dna提取
[0106]
大鼠按照以上饲养给样12周后，在spf级动物房中收集大鼠粪便到无菌管中，并立即用 液氮冷冻，标本迅速转移到-80℃的冰箱中保存。每组检测10个样本。大鼠粪便中的基因组 dna通过magpure粪便dna kf试剂盒b提取，并通过quabit dsdna br分析试剂盒使用 quabit荧光计定量。此外，通过在1％琼脂糖凝胶上运行等分试样来检查质量。
[0107]
5.2 16s rdna扩增及测序
[0108]
用一对引物：515f(5'-gtgccagccggtaa-3'，seq id no.1)和806r (5'-ggactachvgggtwtctaat-3'，seq id no.2)进行pcr以扩增细菌rdna基因的高 度可变区v4，正、反引物均标记有illumina接头、pad和接头序列。pcr扩增在50μl反应 中进行，反应中含
有30ng模板、融合引物和聚合酶链反应母体混合物。pcr循环条件为： 95℃预变性3分钟，30次循环包括95℃变性45秒，56℃退火45秒，72℃延伸45秒， 最后在72℃延伸10分钟。扩增产物用agencourtampre xp试剂盒纯化，然后在洗脱缓冲液 中洗脱。文库通过安捷伦科技2100生物分析仪鉴定。按照illumina的标准管道，在illuminahiseq 2500平台(华大基因，中国深圳)上进行测序。
[0109]
6.数据分析
[0110]
通过快速长度调整短读程序(fast length adjustment of short reads,flash，v1.2.11)处 理16s rdna基因测序的原始读取，旨在排除适配器、低质量和不明确的碱基，并将成对末端 读取添加到标签中。为了分析大鼠肠道菌群的组成，用uparse软件(v7.0.1090)将相似度为 97％以上的序列归为一组可操作分类单元(operational taxonomic unit,otu)。使用qiime (v1.8.0)基于核糖体数据库项目(ribosomal database project，rdp)分类器(v.2.2)和绿色基 因数据库(greengenes，v201305)对otu代表性序列分类及比对，进行物种注释，最小置信 阈值为0.6。mothur(v1.31.2)软件用于进行alpha多样性分析，包括chao、simpson、基于 丰度的覆盖率估计(abundance-based coverage estimator，ace)和shannon指数。同时，qiime (v1.8.0)进行了beta多样性测试。使用usearch_global，将otu与所有标签进行比较， 以获得otu丰度统计表。进行lefse(lda effect sizes)丰度差异分析，进一步探索肠道菌 群中差异较大的代表性菌群，线性判别分析(linear discriminant analysis,lda)阈值设为2。
[0111]
7.统计方法
[0112]
使用spss 25.0(spss inc.,chicago,il,usa)对实验数据进行分析。采用均数
±
标准差或频数和率对数据进行统计描述。对照组和试验组以及cd组和ntio2+cd组之间 的组间比较采用参数检验中的student t检验(双尾)或非参数检验中的mann-whitney u检 验。p《0.05被认为是差异具有统计学意义。
[0113]
8.实验结果
[0114]
8.1otu分析otu
[0115]
丰度等级曲线是展现物种丰度及均匀度的一种形式。横坐标为丰度由低到高的otu累积 数量，纵坐标为物种丰度。由图8中可看出四组的曲线平缓程度及宽度相当，即整体丰度和 均匀度未见较大影响；但cd组曲线在后端有较明显的下降，即cd对于丰度较低的otu有 一定的影响。
[0116]
参见图9，对照组、ntio2组、cd组和ntio2+cd组检测的otu个数分别为724，718， 677，727。其中对照组和ntio2组的差异otu为52个，对照组和cd组的差异otu为83 个，对照组与联合组的差异otu为47个，cd组和联合组的差异otu为84个。可见cd导 致肠道菌群的otu减少，且导致与对照组的差异otu增加；而cd与ntio2联合暴露时otu 个数回升到对照组水平，且与对照组的差异otu个数减少。
[0117]
8.2物种多样性分析
[0118]
8.2.1alpha多样性分析
[0119]
alpha多样性反应的是每个样本中的菌群多样性。其中chao,ace指数反映了样本中物种 丰富度，即物种数量；而shannon和simpson指数反应了群落多样性，包括物种丰富度和均 匀度。如图10结果显示，各剂量组的alpha多样性(chao,ace,simpson,shannon)与
对照 组相比均无统计学差异。
[0120]
8.2.2beta多样性分析
[0121]
与alpha多样性不同的是，beta多样性分析基于样本序列的进化关系及丰度计算样本间 的距离，从而比较样品间的物种多样性存在的差异大小。cd组与对照组相比，beta多样性显 著下降(p《0.01)；而ntio2+cd组与cd组相比，beta多样性显著上升(加权p《0.05，未 加权p《0.01)，如图11的a，b所示。结果表明在cd组内各样本间的物种多样性与对照组 相比显著降低，而在ntio2+cd组这种差异基本恢复。
[0122]
8.3物种组成分析
[0123]
8.3.1门水平菌群丰度
[0124]
门水平上，拟杆菌门(bacteroidetes)、厚壁菌门(firmicutes)、疣微菌门(verrucomicrobia)、 和变形菌门(proteobacteria)在优势菌门中占很大比例。与对照组相比，ntio2组的各菌门 丰度未见显著差异。cd组与对照组相比，脱铁杆菌门(deferribacteres)丰度显著上升；其余菌 门丰度无显著差异，但厚壁菌门(firmicutes)丰度下降，拟杆菌门(bacteroidetes)丰度升 高，cd组厚壁菌门与拟杆菌门的比率(firmicutes/bacteroidetes ratio,f/b)下降。与对照组相 比，ntio2+cd组的各菌门无显著差异，与cd组相比，联合组脱铁杆菌门回降；f/b比值增 加。
[0125]
根据目前关于人类各种群微生物区系组成的数据，人体肠道主要由占整个微生物群落90％ 以上的两个优势细菌门：拟杆菌门(bacteroidetes)和厚壁菌门(firmicutes)组成，而其它 亚优势菌门包括变形杆菌(proteobacteria)、放线菌(actinobacteria)。f/b值常被用作与 健康个体比较的指标。然而，现有的研究表明，cd可导致f/b值降低，这是由于cd可显著 降低厚壁菌门(firmicutes)的丰度或显著增加拟杆菌门(bacteroidetes)的丰度。在liu等 人以含cd 20mg/l、100mg/l的饮水对小鼠进行给样21天的研究中，在给样第一周开始 f/b值显著下降，并持续到实验结束，与本研究的结果中f/b下降的趋势一致。参见图12和 图13。
[0126]
f/b值的下降可能是cd毒作用降低了厚壁菌门(firmicutes)的丰度导致的。现有研究表 明，结肠细胞总能量需求的90％以上由丁酸提供，结肠细胞在丁酸的作用下维持着重要的生 理功能，包括通过对紧密连接蛋白的调节来保持肠道屏障的完整性。肠道屏障可有效地维持 营养物质的交换，并阻止病原体、毒素等有害物质进入血液。而厚壁菌门(firmicutes)是产 生丁酸的主力军。因此，cd可能通过使厚壁菌门(firmicutes)丰度降低而引起短链脂肪酸 产生减少，从而进一步破坏肠道屏障，导致物质吸收的紊乱及炎症的发生。而与ntio2联合 给样可使厚壁菌门(firmicutes)的丰度上升，f/b值恢复到正常组水平。
[0127]
表8.1各组大鼠肠道菌群门水平物种组成及f/b值
[0128][0129][0130]
注：*表示与对照组比较，p《0.05；**表示与对照组比较，p《0.01。
[0131]
8.3.2属水平菌群丰度
[0132]
ntio2组与对照组相比，仅butyricimonas显著降低，该菌占比较小(对照组中约0.05％) 目前对该菌的研究较少；cd组与对照组相比，普雷沃菌属(prevotella)显著升高(p《0.01)； 与cd组相比，联合组普雷沃菌(prevotella)显著降低(p《0.01)。参见表8.2和图14。
[0133]
表8.2各组大鼠肠道菌群属水平物种组成
[0134]
[0135]
[0136]
[0137]
[0138][0139]
注：*表示与对照组比较，p《0.05；**表示与对照组比较，p《0.01；
[0140]
表示与cd组比较，p《0.05；表示cd组比较，p《0.01。
[0141]
本发明研究表明，cd组大鼠肠道中的普雷沃菌属(prevotella)显著增加，表明cd能引 起肠道菌群结构失衡；而与ntio2的共暴露使普雷沃菌属(prevotella)显著降低到对照组水 平，表明了ntio2可缓解cd导致的肠道菌群结构失衡。
[0142]
8.4lefse分析
[0143]
lefse分析及线性判别分析(lda)是为了研究肠道菌群中有丰度差异的分类群及其系统 进化关系而进行的分析，强调统计学意义和生物学相关性，旨在识别符合生物学意义聚类的 差异特征
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。如图15中a和b所示，与ntio2组相比，对照组的主要差异微生物群是butyricimonas (lda得分＝2.9)，即在ntio2组中butyricimonas代表性降低。在对照组和cd组中，分别 有16个和14个优势类群如图15中c和d。在对照组中，罗姆布茨菌属(romboutsia)(lda 得分＝3.8)、罗氏菌属(roseburia)(lda得分＝3.6)、棒状杆菌属(corynebacterium)(lda 得分＝3.3)、巴斯德菌属(pasteurella)(lda得分＝3.3)、厌氧孢杆菌(anaerosporobacter) (lda得分＝3.1)、帕拉普氏菌属(paraprevotella)(得分＝3.0)、韦荣氏球菌属(veillonella) (lda得分＝2.9)和链球菌属(streptococcus)(lda得分＝2.5)有代表性意义，即cd组中 这些菌属有代表性下降。在cd组中，主要的差异菌门是脱铁杆菌门(lda得分＝2.5)，主 要的差异属是普雷沃菌属(prevotella)(lda得分＝4.6)、欧陆森氏菌属(olsenella)(lda 得分＝3.1)、螺旋杆菌属(helicobatacter)(lda得分＝2.9)、肠球菌属(enterococcus)(lda 得分＝2.8)和粘液杆菌属(mucispirillum)(lda得分＝2.5)，即这些菌门/属在cd组有代表 性意义升高。比较cd组和ntio2+cd组，两组中都检测到11个优势类群，如图15中e,f。 在cd组中，普雷沃菌属(prevotella)(lda得分＝4.7)、oscillibacter(lda得分＝4.1)、 脱硫弧菌属(desulfovibrio)(lda得分＝3.9)和butyricimonas(lda得分＝3.8)显著增加， 即在ntio2+cd组以上菌属显著降低；而在ntio2+cd组中，门水平上，cd诱导上升的拟杆 菌门显著降低(lda得分＝4.8)；属水平上，catabacter(lda得分＝4.5)、厌氧孢杆菌属 (anaerosporobacter)(lda得分＝4.3)、苏黎世杆菌属(turicibacter)(lda得分＝4.0)、 罗姆布茨菌属(romboutsia)(lda得分＝3.6)和严格梭菌属(clostridium_sensu_stricto)(lda 得分＝3.5)显著增加，提示ntio2+cd组可恢复受cd导致的普雷沃菌(prevotella)、厌氧孢 杆菌(anaerosporobacter)、罗姆布茨菌(romboutsia)的丰度失衡。在物种丰度分析及lefse 分析结果可看出，在本发明研究中，ntio2未对肠道菌群丰度造成明显影响，这与bredeck等 的研究结论一致。cd单独给样时，影响最大的是普雷沃菌属(prevotella)，在前面的物种丰 度分析中也显示与对照组相比显著升高。在分别与cd组的对比中，在对照组及联合组中有 代表性，且lda分值仅次于普雷沃菌属(prevotella)的是罗姆布茨菌属(romboutsia)， mangifesta等人的研究认为，在健
康粘膜的罗姆布茨菌属(romboutsia)丰度更高，其丰度可 能与炎症反应呈负相关关系。结合物种组成分析，该属在cd组显著下降(p《0.05)。同样 显著下降(p《0.05)的还有罗氏菌(roseburia)。罗氏菌(roseburia)是厚壁菌门中产丁酸 的菌属之一，被认为是肠道菌群的“重要基石菌属”。正常的肠道菌群中一些菌属也有致病的 潜力，在失衡时可引发疾病，被称为致病生物体(pathobionts)。除了前面提到的普雷沃菌 属(prevotella)外，在cd中代表性升高的螺旋杆菌属，也被认为是常见致病菌属之一，可 引起结肠炎、溃疡等肠胃疾病。另外，肠球菌被证明是可引起尿路、皮肤等组织感染的强致 病革兰氏阳性菌，致病力仅次于葡萄球菌，且具有耐药性，近年来感染该菌引起的发病率和 死亡率较高。粘液杆菌属(mucispirillum)是脱铁菌门中的一个菌属，该属丰度的显著升高 (p《0.05)是cd组脱铁菌门丰度显著升高的主要原因。粘液杆菌(mucispirillum)被认为是 肠道炎症的标志物，在炎症状态下丰度增加，而在炎症缓解时丰度降低。结合lda分析及物 种组成分析，以上提到的cd组中丰度降低的有益菌在联合组中的丰度增加，而丰度升高的 致病菌或炎症标志菌在联合组中的丰度均有所下降，即ntio2对cd导致的肠道菌群失衡有拮 抗作用。
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以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细但并不能因此而 理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离 本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此， 本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。