一种具有乙酰胆碱酯酶抑制作用的千层塔提取物及其制备方法与应用

1.本发明涉及天然药物化学技术领域，具体涉及一种具有乙酰胆碱酯酶抑制作用的千层塔提取物及其制备方法与应用。


背景技术：

2.千层塔为石杉科石杉属植物蛇足石杉，以全草入药；其具有散瘀止血、清热解毒以及消肿止痛之功效；主治跌打损伤、瘀血肿痛、内伤吐血；外用治痈疖肿毒、毒蛇咬伤以及烧烫伤。
3.阿尔茨海默病(ad)是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病；65岁以前发病者，称早老性痴呆；65岁以后发病者称老年性痴呆。乙酰胆碱酯酶抑制剂，又称为抗胆碱酯酶药，是通过对乙酰胆碱酯酶的可逆性抑制，达到使乙酰胆碱(ach)在突触处的积累，延长并且增加了乙酰胆碱的作用；在临床上广泛用于抗老年性痴呆。
4.因此，开发对乙酰胆碱酯酶具有抑制作用的药物是开发预防或治疗老年痴呆作用的药物的方向之一。现有技术从千层塔中分离得到了单体化合物石杉碱甲，研究表明，其对乙酰胆碱酯酶具有明显的抑制作用，对老年痴呆症有显著疗效。
5.然而，千层塔中是否还有其它有效成分具有乙酰胆碱酯酶具有抑制作用，现有技术的报道较少。因此，以中药千层塔为原料，进一步开发对乙酰胆碱酯酶具有抑制作用的提取物或单体化合物，为开发预防或治疗老年痴呆的药物提供更多的选择，具有重要的应用价值。


技术实现要素：

6.为了克服现有技术中存在的至少之一的技术问题，本发明首先提供了一种具有乙酰胆碱酯酶抑制作用的千层塔提取物；研究表明，由本发明所述方法制备得的千层塔提取物具有优异的乙酰胆碱酯酶抑制作用
7.本发明所要解决上述技术问题，通过以下技术方案予以实现：
8.一种具有乙酰胆碱酯酶抑制作用的千层塔提取物的制备方法，其包含如下步骤：
9.(1)取中药千层塔用有机溶剂进行提取，将提取液浓缩去除有机溶剂后得千层塔有机溶剂提取物；
10.(2)将千层塔有机溶剂提取物上大孔树脂柱，先用体积分数为30～40％的乙醇水溶液进行洗脱除杂；再用体积分数为60～80％的乙醇水溶液进行洗脱，收集体积分数为60～80％的乙醇水溶液洗脱下来的洗脱液，浓缩干燥后得千层塔大孔树脂洗脱部位；
11.(3)将千层塔大孔树脂洗脱部位上硅胶柱富集有效成分，即得所述的千层塔提取物。
12.发明人经大量的实验研究表明，千层塔经有机溶剂提取，然后再经大孔树脂柱以及硅胶柱富集得到了大量的具有乙酰胆碱酯酶抑制作用的有效成分；使得制备得到的千层
塔提取物具有优异的乙酰胆碱酯酶抑制作用。
13.发明人在此需要强调的是，大孔树脂柱和硅胶柱富集有效成分的步骤，二者缺一不可，必须同时经过大孔树脂柱以及硅胶柱步骤才能富集得到大量的具有乙酰胆碱酯酶抑制作用的有效成分；缺少任何一个步骤都制备不到具有优异乙酰胆碱酯酶抑制作用的千层塔提取物。
14.优选地，步骤(1)中的有机溶剂为体积分数为70～95％的乙醇水溶液。
15.优选地，步骤(1)中千层塔与有机溶剂的用量比为1g:8～20ml。
16.最优选地，步骤(1)中千层塔与有机溶剂的用量比为1g:12ml。
17.优选地，步骤(1)中所述的提取是指采用冷浸法提取，提取时间为3～10d。
18.最优选地，所述的提取时间为7d。
19.优选地，步骤(2)中所述的大孔树脂柱是指d101型大孔树脂柱。
20.优选地，步骤(2)中先用3～5倍柱体积的体积分数为30～40％的乙醇水溶液进行洗脱除杂；再用5～8倍柱体积的体积分数为60～80％的乙醇水溶液进行洗脱，收集体积分数为60～80％的乙醇水溶液洗脱下来的洗脱液，浓缩干燥后得千层塔大孔树脂洗脱部位。
21.进一步优选地，步骤(2)中先用4倍柱体积的体积分数为40％的乙醇水溶液进行洗脱除杂；再用6倍柱体积的体积分数为70％的乙醇水溶液进行洗脱，收集体积分数为70％的乙醇水溶液洗脱下来的洗脱液，浓缩干燥后得千层塔大孔树脂洗脱部位。
22.优选地，步骤(3)中将千层塔大孔树脂洗脱部位上硅胶柱富集有效成分的具体方法为：
23.将千层塔大孔树脂洗脱部位上硅胶柱，先用体积比为91～93:9～7的氯仿和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱除杂；然后再用体积比为85～87:15～13的氯仿和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱，收集体积比为85～87:15～13的氯仿和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂洗脱下来的洗脱液，浓缩干燥后即得所述的千层塔提取物。
24.进一步优选地，步骤(3)中将千层塔大孔树脂洗脱部位上硅胶柱富集有效成分的具体方法为：
25.将千层塔大孔树脂洗脱部位上硅胶柱，先用2～4倍柱体积的体积比为92:8的氯仿和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱除杂；然后再用4～6倍柱体积的体积比为86:14的氯仿和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱，收集体积比为86:14的氯仿和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂洗脱下来的洗脱液，浓缩干燥后即得所述的千层塔提取物。
26.发明人在研究中发现，千层塔有机溶剂提取物经大孔树脂洗脱后，硅胶柱的洗脱条件对于能否制备得到的具有优异乙酰胆碱酯酶抑制作用的千层塔提取物起着决定性作用；发明人经大量的实验研究表明，在本发明所述硅胶柱洗脱条件下制备得到的千层塔提取物具有优异的乙酰胆碱酯酶抑制作用；然而，在其它硅胶柱洗脱条件下制备不到具有优异乙酰胆碱酯酶抑制作用的千层塔提取物。
27.本发明还提供了一种由上述制备方法制备得到的具有乙酰胆碱酯酶抑制作用的千层塔提取物。
28.本发明还提供了一种上述具有乙酰胆碱酯酶抑制作用的千层塔提取物在制备乙酰胆碱酯酶抑制剂中的应用。
29.本发明还提供了一种上述具有乙酰胆碱酯酶抑制作用的千层塔提取物在制备预
防或治疗老年痴呆症的药物中的应用。
30.有益效果：本发明提供了一种全新的千层塔提取物的制备方法，由该方法制备得到的千层塔提取物具有优异的乙酰胆碱酯酶抑制作用。因此，将该千层塔提取物用于开发治疗老年痴呆症的药物具有广阔的应用前景。
具体实施方式
31.以下结合具体实施例来进一步解释本发明，但实施例对本发明并不做任何形式的限定。
32.实施例1千层塔提取物的制备
33.(1)取中药千层塔用有机溶剂(有机溶剂采用体积分数为95％的乙醇水溶液)采用冷浸法在室温下提取7d，将提取液浓缩去除有机溶剂后得千层塔有机溶剂提取物；
34.其中，千层塔与有机溶剂的用量比为1g:12ml；
35.(2)将千层塔有机溶剂提取物上大孔树脂柱(填充有d101型大孔树脂，大孔树脂的重量为千层塔有机溶剂提取物重量的50倍)，先用4倍柱体积的体积分数为40％的乙醇水溶液进行洗脱除杂；再用6倍柱体积的体积分数为70％的乙醇水溶液进行洗脱，收集体积分数为70％的乙醇水溶液洗脱下来的洗脱液，浓缩干燥后得千层塔大孔树脂洗脱部位；
36.(3)将千层塔大孔树脂洗脱部位上硅胶柱(填充有200-300目的硅胶，硅胶的重量为千层塔大孔树脂洗脱部位重量的25倍)，先用3倍柱体积的体积比为92:8的氯仿和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱除杂；然后再用5倍柱体积的体积比为86:14的氯仿和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱，收集体积比为86:14的氯仿和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂洗脱下来的洗脱液，浓缩干燥后即得所述的千层塔提取物。
37.实施例2千层塔提取物的制备
38.(1)取中药千层塔用有机溶剂(有机溶剂采用体积分数为70％的乙醇水溶液)采用冷浸法在室温下提取10d，将提取液浓缩去除有机溶剂后得千层塔有机溶剂提取物；
39.其中，千层塔与有机溶剂的用量比为1g:15ml；
40.(2)将千层塔有机溶剂提取物上大孔树脂柱(填充有d101型大孔树脂，大孔树脂的重量为千层塔有机溶剂提取物重量的50倍)，先用5倍柱体积的体积分数为30％的乙醇水溶液进行洗脱除杂；再用5倍柱体积的体积分数为80％的乙醇水溶液进行洗脱，收集体积分数为80％的乙醇水溶液洗脱下来的洗脱液，浓缩干燥后得千层塔大孔树脂洗脱部位；
41.(3)将千层塔大孔树脂洗脱部位上硅胶柱(填充有200-300目的硅胶，硅胶的重量为千层塔大孔树脂洗脱部位重量的25倍)，先用2倍柱体积的体积比为93:7的氯仿和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱除杂；然后再用4倍柱体积的体积比为85:15的氯仿和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱，收集体积比为85:15的氯仿和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂洗脱下来的洗脱液，浓缩干燥后即得所述的千层塔提取物。
42.实施例3千层塔提取物的制备
43.(1)取中药千层塔用有机溶剂(有机溶剂采用体积分数为80％的乙醇水溶液)采用冷浸法在室温下提取5d，将提取液浓缩去除有机溶剂后得千层塔有机溶剂提取物；
44.其中，千层塔与有机溶剂的用量比为1g:10ml；
45.(2)将千层塔有机溶剂提取物上大孔树脂柱(填充有d101型大孔树脂，大孔树脂的
重量为千层塔有机溶剂提取物重量的50倍)，先用3倍柱体积的体积分数为30％的乙醇水溶液进行洗脱除杂；再用8倍柱体积的体积分数为60％的乙醇水溶液进行洗脱，收集体积分数为60％的乙醇水溶液洗脱下来的洗脱液，浓缩干燥后得千层塔大孔树脂洗脱部位；
46.(3)将千层塔大孔树脂洗脱部位上硅胶柱(填充有200-300目的硅胶，硅胶的重量为千层塔大孔树脂洗脱部位重量的25倍)，先用4倍柱体积的体积比为91:9的氯仿和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱除杂；然后再用4倍柱体积的体积比为87:13的氯仿和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱，收集体积比为87:13的氯仿和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂洗脱下来的洗脱液，浓缩干燥后即得所述的千层塔提取物。
47.对比例1千层塔提取物的制备
48.(1)取中药千层塔用有机溶剂(有机溶剂采用体积分数为95％的乙醇水溶液)采用冷浸法在室温下提取7d，将提取液浓缩去除有机溶剂后得千层塔有机溶剂提取物；
49.其中，千层塔与有机溶剂的用量比为1g:12ml；
50.(2)将千层塔有机溶剂提取物上大孔树脂柱(填充有d101型大孔树脂，大孔树脂的重量为千层塔有机溶剂提取物重量的50倍)，先用4倍柱体积的体积分数为40％的乙醇水溶液进行洗脱除杂；再用6倍柱体积的体积分数为70％的乙醇水溶液进行洗脱，收集体积分数为70％的乙醇水溶液洗脱下来的洗脱液，浓缩干燥后得千层塔大孔树脂洗脱部位；即所述的千层塔提取物。
51.对比例1与实施例1的区别在于，对比例1仅仅采用大孔树脂柱洗脱制备千层塔提取物；而实施例1则是在经大孔树脂柱洗脱后再经硅胶柱洗脱制备千层塔提取物。
52.对比例2千层塔提取物的制备
53.(1)取中药千层塔用有机溶剂(有机溶剂采用体积分数为95％的乙醇水溶液)采用冷浸法在室温下提取7d，将提取液浓缩去除有机溶剂后得千层塔有机溶剂提取物；
54.其中，千层塔与有机溶剂的用量比为1g:12ml；
55.(2)将千层塔有机溶剂提取物上硅胶柱(填充有200-300目的硅胶，硅胶的重量为千层塔有机溶剂提取物重量的25倍)，先用3倍柱体积的体积比为92:8的氯仿和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱除杂；然后再用5倍柱体积的体积比为86:14的氯仿和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱，收集体积比为86:14的氯仿和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂洗脱下来的洗脱液，浓缩干燥后即得所述的千层塔提取物。
56.对比例2与实施例1的区别在于，对比例2不经大孔树脂洗脱，直接采用硅胶柱洗脱制备千层塔提取物；而实施例1则是在先经大孔树脂柱洗脱后再经硅胶柱洗脱制备千层塔提取物。
57.对比例3千层塔提取物的制备
58.(1)取中药千层塔用有机溶剂(有机溶剂采用体积分数为95％的乙醇水溶液)采用冷浸法在室温下提取7d，将提取液浓缩去除有机溶剂后得千层塔有机溶剂提取物；
59.其中，千层塔与有机溶剂的用量比为1g:12ml；
60.(2)将千层塔有机溶剂提取物上大孔树脂柱(填充有d101型大孔树脂，大孔树脂的重量为千层塔有机溶剂提取物重量的50倍)，先用4倍柱体积的体积分数为40％的乙醇水溶液进行洗脱除杂；再用6倍柱体积的体积分数为70％的乙醇水溶液进行洗脱，收集体积分数为70％的乙醇水溶液洗脱下来的洗脱液，浓缩干燥后得千层塔大孔树脂洗脱部位；
61.(3)将千层塔大孔树脂洗脱部位上硅胶柱(填充有200-300目的硅胶，硅胶的重量为千层塔大孔树脂洗脱部位重量的25倍)，先用3倍柱体积的体积比为99:1的氯仿和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱除杂；然后再用5倍柱体积的体积比为95:5的氯仿和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱，收集体积比为95:5的氯仿和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂洗脱下来的洗脱液，浓缩干燥后即得所述的千层塔提取物。
62.对比例3与实施例1的区别在于，对比例3中的硅胶柱洗脱条件不同，对比例3的硅胶柱洗脱条件为：先用体积比为99:1的氯仿和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱除杂；然后再用体积比为95:5的氯仿和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱。而实施例1的硅胶柱洗脱条件则为：先用体积比为92:8的氯仿和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱除杂；然后再用体积比为86:14的氯仿和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱。
63.对比例4千层塔提取物的制备
64.(1)取中药千层塔用有机溶剂(有机溶剂采用体积分数为95％的乙醇水溶液)采用冷浸法在室温下提取7d，将提取液浓缩去除有机溶剂后得千层塔有机溶剂提取物；
65.其中，千层塔与有机溶剂的用量比为1g:12ml；
66.(2)将千层塔有机溶剂提取物上大孔树脂柱(填充有d101型大孔树脂，大孔树脂的重量为千层塔有机溶剂提取物重量的50倍)，先用4倍柱体积的体积分数为40％的乙醇水溶液进行洗脱除杂；再用6倍柱体积的体积分数为70％的乙醇水溶液进行洗脱，收集体积分数为70％的乙醇水溶液洗脱下来的洗脱液，浓缩干燥后得千层塔大孔树脂洗脱部位；
67.(3)将千层塔大孔树脂洗脱部位上硅胶柱(填充有200-300目的硅胶，硅胶的重量为千层塔大孔树脂洗脱部位重量的25倍)，先用3倍柱体积的体积比为85:15的氯仿和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱除杂；然后再用5倍柱体积的体积比为80:20的氯仿和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱，收集体积比为80:20的氯仿和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂洗脱下来的洗脱液，浓缩干燥后即得所述的千层塔提取物。
68.对比例4与实施例1的区别在于，对比例4中的硅胶柱洗脱条件不同，对比例4的硅胶柱洗脱条件为：先用体积比为85:15的氯仿和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱除杂；然后再用体积比为80:20的氯仿和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱。而实施例1的硅胶柱洗脱条件则为：先用体积比为92:8的氯仿和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱除杂；然后再用体积比为86:14的氯仿和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱。
69.实验例
70.将实施例1～3以及对比例1～4制备得到的千层塔提取物用dmso溶解，制成2mg/ml的待测溶液；用于测试实施例1～3以及对比例1～4制备得到的千层塔提取物对乙酰胆碱酯酶抑制率。
71.取96孔板，每孔分别加入待测溶液10μl、ph值为8.0的tris-hcl缓冲溶液40μl以及乙酰胆碱酯酶溶液10μl(用ph值为8.0的tris-hcl缓冲溶液配制，浓度为1000u/ml)；空白对照组用等量的ph值为8.0的tris-hcl缓冲溶液替代待测溶液；然后于37℃下在摇床中孵育10min；接着加入显色剂dtnb溶液20μl(用ph值为8.0的tris-hcl缓冲溶液配制，浓度为0.1mm)以及底物碘化乙酰硫代胆碱溶液10μl(用ph值为8.0的tris-hcl缓冲溶液配制，浓度为0.2mm)，接着于37℃下在摇床中继续孵育10min；孵育结束后，用酶标仪测定412nm下的吸光度；计算待测溶液对于乙酰胆碱酯酶的抑制率；测试结果见表1。
72.表1.本发明千层塔提取物对乙酰胆碱酯酶的抑制作用
[0073][0074][0075]
从表1实验数据可以看出，实施例1～3制备得到的千层塔提取物其在2mg/ml浓度时对乙酰胆碱酯酶抑制率达到了88％以上。这说明：采用本发明方法制备得到的千层塔提取物具有优异的乙酰胆碱酯酶抑制作用。
[0076]
从表1实验数据可以看出，实施例1制备得到的千层塔提取物，其对乙酰胆碱酯酶抑制率同样远远高于对比例1和2制备得到的千层塔提取物。这说明：大孔树脂柱和硅胶柱富集有效成分的步骤，二者缺一不可，必须同时经过大孔树脂柱以及硅胶柱步骤才能富集得到大量的具有乙酰胆碱酯酶抑制作用的有效成分；缺少任何一个步骤都制备不到具有优异乙酰胆碱酯酶抑制作用的千层塔提取物。
[0077]
从表1实验数据可以看出，对比例3和4制备得到的千层塔提取物，其对乙酰胆碱酯酶抑制率与对比例1相比提升的并不明显；而实施例1制备得到的千层塔提取物，其对乙酰胆碱酯酶抑制率与对比例1相比得到了大幅的提升；其对乙酰胆碱酯酶抑制率同样远远高于对比例3和4制备得到的千层塔提取物。这说明：千层塔有机溶剂提取物经大孔树脂洗脱后，硅胶柱的洗脱条件对于能否制备得到的具有优异乙酰胆碱酯酶抑制作用的千层塔提取物起着决定性作用；上述研究表明：千层塔有机溶剂提取物经大孔树脂洗脱后，并不是在任意的硅胶柱洗脱条件下制备得到的千层塔提取物都能够进一步大幅提高其对乙酰胆碱酯酶的抑制作用，并不是在任意的硅胶柱洗脱条件下制备得到的千层塔提取物都具有优异的乙酰胆碱酯酶抑制作用；只有在本发明所述的硅胶柱洗脱条件下制备得到的千层塔提取物才能够进一步大幅提高其对乙酰胆碱酯酶的抑制作用，只有在本发明所述的硅胶柱洗脱条件下制备得到的千层塔提取物才具有优异的乙酰胆碱酯酶抑制作用；而在其它硅胶柱洗脱条件下制备得到的千层塔提取物并不能够进一步大幅提高其对乙酰胆碱酯酶的抑制作用，并不具有优异的乙酰胆碱酯酶抑制作用。