表没食子儿茶素没食子酸酯在心肌缺血再灌注损伤早期的应用

1.本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种表没食子儿茶素没食子酸酯在心肌缺血再灌注损伤早期的应用。


背景技术：

2.在心肌缺血再灌注损伤过程中，大量的巨噬细胞在24小时内浸润损伤心肌组织，作为主导的免疫细胞来清除坏死组织，这对损伤修复是至关重要的，但过度的炎症则是造成miri组织损伤恶化、不良重塑和心力衰竭的重要发病机制，心肌组织内浸润的单核巨噬细胞分化表型会经历由促炎向抑炎的过渡,通过分泌il-10抑制炎症反应，并分泌vegfα和tgf-β促进血管生成和纤维性愈合。巨噬细胞亚型的复杂性及其分化的环境依赖性使得单核巨噬细胞会根据具体的环境及刺激因素分化出适应相应损伤的表型，按照适宜的程序产生一系列细胞因子、趋化因子、蛋白酶和生长因子，有序地发挥促炎吞噬清除作用和抗炎修复新生作用。这就提示需要在合适的时间窗内采取适当程度的抗炎疗法，在实现有效抑制过度炎症所致的损伤恶化的同时不对组织修复造成负面影响。同时也说明，单核巨噬细胞的迁移和分化都是其在miri中发挥清除坏死组织及促进组织修复作用的重要方面，因此也是调控miri炎症机制的重要靶点。
3.既往大量研究表明，单核细胞是心肌损伤的重要治疗靶点。无论是抑制ccr2或ccl2的表达，还是拮抗介导单核细胞迁移的关键炎症介质，都可以通过抑制单核细胞招募改善心肌损伤预后。相反，循环单核细胞数量的增加则会使心肌损伤进一步恶化。临床研究显示，循环经典单核细胞(cd14+cd16-)的水平与急性心梗后心血管不良事件的发生率呈正相关。尽管目前尚无研究特定针对抑制单核细胞功能对心肌损伤影响的临床试验，但一些可以抑制单核细胞招募及其功能的药物其实已经存在于目前临床的常规治疗方案之中，例如心梗后早期血管紧张素转换酶(ace)抑制剂和β-阻断剂的应用。此外，虽然目前各类心肌损伤免疫抑制疗法的临床试验结果大多不尽如人意，但il-1β抑制剂canakinumab在减少动脉粥样硬化高风险患者心血管事件中取得了良好的临床疗效。这肯定了抑制炎症在心肌损伤中的心肌保护作用，但也提示要进一步探索炎症抑制的有效靶点。


技术实现要素：

4.本发明提供了表没食子儿茶素没食子酸酯在心肌缺血再灌注损伤早期的应用。
5.表没食子儿茶素没食子酸酯在心肌缺血再灌注损伤早期的应用，
6.包括治疗心肌缺血再灌注损伤早期的产品中的应用；
7.单核巨噬细胞向受损心肌组织迁移浸润与促炎因子分泌的抑制剂产品中的应用；
8.避免心肌缺血再灌注早期过度炎症反应带来的心肌损伤的产品；
9.避免心肌缺血再灌注早期过度炎症反应带来的心功能恶化的产品。
10.作为优选的技术方案，所述表没食子儿茶素没食子酸酯具有抑制单核巨噬细胞向
受损心肌组织迁移浸润与促炎因子的分泌作用。
11.作为优选的技术方案，所述产品为药物或实验试剂。
12.本发明还公开了一种治疗心肌缺血再灌注早期过度炎症反应的药物组合物，所述药物组合物包括表没食子儿茶素没食子酸酯。
13.本发明还公开了一种表没食子儿茶素没食子酸酯在制备用治疗或预防心肌缺血早期相关疾病的药物中的用途。
14.作为优选的技术方案，所述心肌缺血早期为心肌缺血再灌注损伤早期。
15.由于采用了上述技术方案，表没食子儿茶素没食子酸酯在心肌缺血再灌注损伤早期的应用，包括包括治疗心肌缺血再灌注损伤早期的产品中的应用；单核巨噬细胞向受损心肌组织迁移浸润与促炎因子分泌的抑制剂产品中的应用；避免心肌缺血再灌注早期过度炎症反应带来的心肌损伤的产品；避免心肌缺血再灌注早期过度炎症反应带来的心功能恶化的产品。
16.本发明的优点如下：
17.表没食子儿茶素没食子酸酯为天然绿茶提取物，安全性及接受度高；其可多通路、多方面影响巨噬细胞在心肌缺血再灌注损伤中的生物学功能，调控更加全面；相较于基因靶向治疗药物和单克隆抗体中和疗法，化学药物作用时间更加精准可控，故可实现仅在再灌注损伤早期抑制巨噬细胞过度炎症清除作用而不干扰其后期组织修复功能；
18.在心肌缺血再灌注损伤早期应用表没食子儿茶素没食子酸酯可抑制单核巨噬细胞向受损心肌组织迁移浸润和促炎因子的分泌，减少再灌注早期过度炎症反应带来的进一步心肌损伤和心功能恶化，从而改善心肌缺血再灌注损伤的预后。
附图说明
19.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
20.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
21.以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
22.图1为本发明的实施例ir术后1天ttc染色与比较相对梗死面积图，p《0.0001；n＝6；
23.图2为本发明的实施例ir术后1天心肌组织荧光tunel染色与比较凋亡细胞数量图；p《0.0001；n＝6；
24.图3为本发明的实施例western blot检测ir术后1天心肌组织凋亡相关分子bcl-2与bax表达水平图；p《0.0001；n＝4；
25.图4为本发明的实施例ir术后4天心脏超声与比较ef、fs值图，p《0.0001；n＝12；
26.图5为本发明的实施例ir术后1天心肌组织α-actinin+f4/80免疫荧光共染与比较f4/80+细胞数量图；p《0.0001；n＝4；
27.图6为本发明的实施例流式细胞术分析ir术后1天及3天心肌组织巨噬细胞数量与
比较巨噬细胞在总的活细胞中的比例图，进一步比巨噬细胞中m1/m2比值差异；p《0.0001；n＝5；
28.图7为本发明的实施例rt-qpcr分析ir术后1天及3天心肌组织中分选出的巨噬细胞(f4/80+)炎症及趋化因子的mrna水平图；n＝4；
29.图8为本发明的实施例western blot检测药物组和对照组的raw264.7单克隆细胞株与缺氧复氧损伤的心肌细胞共培养24h后p-erk1/2和wave2蛋白水平、比较组间差异图；p《0.0001；n＝4；
30.图9为本发明的实施例western blot分析药物组和对照组raw264.7单克隆细胞株与缺氧复氧损伤的心肌细胞共培养24h的p-tbk1和tbk1蛋白水平、比较组间p-tbk1和tbk1的比值差异图；p《0.0001；n＝4；
31.图10为本发明的实施例western blot检测药物组和对照组raw264.7单克隆细胞株与缺氧复氧损伤的心肌细胞共培养不同时长的p100/52和p105/50蛋白水平、分别比较组间p52和p50的水平差异图；p《0.0001；n＝4。
具体实施方式
32.为了弥补以上不足，本发明提供了表没食子儿茶素没食子酸酯在心肌缺血再灌注损伤早期的应用以解决上述背景技术中的问题。
33.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
34.表没食子儿茶素没食子酸酯在心肌缺血再灌注损伤早期的应用，
35.包括治疗心肌缺血再灌注损伤早期的产品中的应用；
36.单核巨噬细胞向受损心肌组织迁移浸润与促炎因子分泌的抑制剂产品中的应用；
37.避免心肌缺血再灌注早期过度炎症反应带来的心肌损伤的产品；
38.避免心肌缺血再灌注早期过度炎症反应带来的心功能恶化的产品。
39.作为优选的技术方案，所述表没食子儿茶素没食子酸酯具有抑制单核巨噬细胞向受损心肌组织迁移浸润与促炎因子的分泌作用。
40.作为优选的技术方案，所述产品为药物或实验试剂。
41.本发明还公开了一种治疗心肌缺血再灌注早期过度炎症反应的药物组合物，所述药物组合物包括表没食子儿茶素没食子酸酯。
42.本发明还公开了一种表没食子儿茶素没食子酸酯在制备用治疗或预防心肌缺血早期相关疾病的药物中的用途。
43.作为优选的技术方案，所述心肌缺血早期为心肌缺血再灌注损伤早期。
44.为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
45.实施例：
46.1)实验动物及动物模型制备：选用spf级8周龄雄性c57bl/6背景小鼠(购自南京集萃生物有限公司)，通过前降支结扎45分钟后再通，构建心肌缺血再灌注损伤模型。
47.2)分组与处理：小鼠分组为实验组和sham组。实验组给予标准心肌缺血再灌注损
伤造模；sham组造模流程与实验组一致，仅区别在结扎线穿过前降支下方心肌但不打结。实验组和sham组均设置药物组和对照组，药物组在血管再通前给予egcg 40mg/kg腹腔注射，此后每日一次直至术后3天；对照组在相同时间点相同给药途径给予生理盐水。
48.3)评估心功能及心肌损伤严重程度：术后1天对心肌组织进行ttc染色评价梗死面积/aar(图1)，tunel染色(图2)、western-blot检测凋亡相关分子表达量评价心肌细胞凋亡水平(图3)；术后3天心脏彩超检测ef及fs评价心功能(图4)，发现egcg可对心肌缺血再灌注损伤的心肌损伤和心脏功能起到显著的保护作用。
49.4)评估egcg在心肌缺血再灌注损伤中对单核巨噬细胞迁移和分化的影响：术后1天对心肌组织进行免疫荧光染色，计数比较f4/80+细胞数目；分别在术后1天和3天对心肌组织进行流式细胞学分析，比较巨噬细胞(cd45+ly-6g-cd11b+cd64+)比例及其中m1/m2比值差异；分别在术后1天和3天对心肌组织进行单细胞磁珠分选，分选出f4/80+的细胞进行rna提取并rt-qpcr检测il-1β、mcp-1、tgf-β、ifnβ表达水平，比较组间差异。发现egcg可显著减少心肌缺血再灌注损伤后受损心肌中巨噬细胞浸润数量，抑制巨噬细胞向促炎表型分化，减少促炎细胞因子的合成；见图5、图6与图7所示。
50.5)egcg对心肌缺血再灌注损伤在分子机制上的保护作用：利用小鼠单核巨噬细胞系raw264.7与缺氧复氧损伤的成年小鼠原代心肌细胞共培养模型在体外模拟单核巨噬细胞与缺血再灌注损伤的心肌细胞之间的细胞互作情景。细胞分为为共培养组和空白组：共培养组在tranwell上室铺种成年小鼠原代心肌细胞并进行缺氧条件处理6小时后置入铺种有raw264.7的下室进行常氧共培养24小时，空白组在tranwell上室铺种成年小鼠原代心肌细胞常氧常规条件培养6小时后置入铺种有raw264.7的下室进行常氧共培养24小时；共培养组和空白组均设置药物组和对照组：药物组在下室培养基中加有egcg(20μm)，对照组以等体积无菌pbs替代。共培养24小时后提取下室raw264.7细胞总蛋白进行后续western blot分析。发现：1.应用egcg抑制g3bp1可进一步抑制ras下游erk1/2的磷酸化以及wave2的表达；2.应用egcg抑制g3bp1可抑制cgas下游tbk1的磷酸化，进一步抑制nf-κb通路活性(p50/p105、p52/p100)；见图8、图9和图10。
51.综上可知，表没食子儿茶素没食子酸酯通过抑制g3bp1进一步抑制下游ras-mapk-erk通路及cgas-nfκb通路激活，从而抑制单核巨噬细胞向受损心肌组织迁移浸润和促炎因子的分泌，在心肌缺血再灌注损伤早期(缺血后再通前至损伤后3天，每日一次40mg/kg，腹腔注射)给药可减少再灌注早期过度炎症反应带来的进一步心肌损伤和心功能恶化，从而改善心肌缺血再灌注损伤的预后。
52.以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。