合成双链RNA类似物经滴鼻预防呼吸道传播病毒的应用及其用途

合成双链rna类似物经滴鼻预防呼吸道传播病毒的应用及其用途
技术领域
1.本发明涉及预防呼吸道病毒感染技术领域，尤其涉及合成双链rna类似物经滴鼻预防呼吸道传播病毒的应用及其用途。


背景技术：

2.用于预防各种病原微生物感染的接种用生物制品被统称为疫苗，其作用机制是在病原体感染之前通过激活机体天然免疫和适应性免疫反应抵御病原体的感染或降低感染带来的危害。其中，机体的天然(固有)免疫应答是抵御病原体感染的第一道防线，粘膜上皮细胞和吞噬细胞系统构成了呼吸道的天然免疫屏障。对于抵御经呼吸道传播的病毒感染，上呼吸道天然免疫细胞及时有效的干扰素(ifn)反应至关重要。
3.上呼吸道天然免疫细胞通过各种模式识别受体(prr)感知包括病毒在内的病原体相关分子模式(pamp)，识别入侵机体的病原体。病毒pamp通常是宿主细胞中未发现的独特分子结构，如病毒基因组的独特核酸结构或病毒复制中间产物。在缺乏特定prr及其信号通路的情况下，机体对病毒的易感性增加。据报道，天然免疫细胞识别病毒感染后激活的i型和iii型ifn反应具有抗病毒作用(park annsea,iwasaki akiko,type i and type iii interferons-induction,signaling,evasion,and application to combat covid-19.[j].cell host microbe,2020,27:870-878.)。其中，i型ifn(人类的ifn-α、ifn-β、ifn-ε、ifn-κ、ifn-μ)以自分泌和旁分泌方式与广泛表达于各种细胞的i型ifn受体(ifnar)结合从而激活了由数百个干扰素刺激基因(isg)组成的强大抗病毒防御体系，这些基因能够干扰病毒复制的每一个步骤；iii型干扰素(ifnλs)与iii型干扰素受体(ifnlr)结合，ifnlr主要表达在上皮细胞和某些髓样细胞。及时有效的i型和iii型ifn反应对宿主防御包括严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，sars-cov-2)在内的病毒感染至关重要。在病毒感染的最初几天，呼吸道ifn反应强度不足可能是造成病毒大量复制和全身播散、引起肺部或全身过度炎症反应的原因。
[0004]
然而，一系列针对sarscov-2的研究中发现，sarscov-2感染后诱导的ifn-i或ifn-iii转录水平非常低，相关的isg反应有限；但却引起大量趋化因子和促炎细胞因子基因的表达，说明机体在感染sarscov-2后抗病毒的ifn反应相对较弱而全身炎症反应加强。该现象可能归因于病毒进化形成的“反干扰素机制”，以逃避和抑制机体ifn反应的抗病毒效应，具体环节包括(1)逃避天然免疫细胞的识别；(2)抑制ifn的生成；(3)干扰ifn信号传导；(4)抑制isg效应功能。也就是说，一旦病毒感染而机体未能及时有效遏制其复制，病毒便可能通过上述“反干扰素机制”抑制机体的ifn反应来逃避天然免疫细胞的抗病毒作用。因此，针对sarscov-2这一进化特性，有必要尝试在病毒感染之前即适当激活天然免疫细胞的ifn反应来实现预防和控制病毒感染。
[0005]
外源性补充ifn如重组或聚乙二醇化ifn-α和ifn-β已用于治疗各种疾病，包括多发性硬化症和病毒性肝炎。重组ifn-λ虽然尚未被批准用于任何适应症，但正在进行病毒性
肝炎的临床试验。在经上呼吸道(鼻内给药或吸入)外源性补充ifn领域，已有试验结果支持早期ifn-λ在sars-cov-2感染中的保护作用(chong zhenlu,karl courtney e,halfmann peter j et al.nasally-delivered interferon-λprotects mice against upper and lower respiratory tract infection of sars-cov-2variants including omicron.[j].biorxiv,2022,undefined:undefined.)。小鼠预防性服用ifn-β可加速病毒清除，而不会导致体重减轻或过度炎症反应。值得注意的是，在病毒达到峰值之前早期给予ifn-β治疗具有保护作用，而晚期给予ifn-β则可能无法控制病毒并导致炎症反应加重甚至致命性肺炎。这些研究共同强调了ifn反应的诱导时间对于控制病毒复制的重要性，即早期ifn诱导或给药可提供良好的预防感染和抗病毒作用(major jack,crotta stefania,llorian miriam et al.type i and iii interferons disrupt lung epithelial repair during recovery from viral infection.[j].science,2020,369:712-717.)。因此，宿主更可能在病程早期从外源性补充ifn中获益。但同时，直接补充外源性ifn也带来一些副作用，如吸入的ifn直接进入下呼吸道造成细胞因子风暴和相关组织损伤；由于ifn具有减少增殖和促凋亡的特征，长时间过量的外源性ifn直接作用会阻碍肺上皮再生，从而破坏呼吸道屏障功能，造成细菌的合并感染(major jack,crotta stefania,llorian miriam et al.type i and iii interferons disrupt lung epithelial repair during recovery from viral infection.[j].science,2020,369:712-717.)；由于ifnar在几乎所有细胞上都有表达，i型ifn可能会产生严重的全身副作用；外源性ifn可激活气道上皮细胞中的ahr从而产生粘液，后者可增加血气屏障的厚度、阻碍气体扩散造成机体缺氧(liu yuying,lv jiadi,liu jiangning et al.mucus production stimulated by ifn-ahr signaling triggers hypoxia of covid-19.[j].cell res,2020,30:1078-1087.)。


技术实现要素：

[0006]
本发明提供了合成双链rna类似物经滴鼻预防呼吸道传播病毒的应用及其用途。
[0007]
一种合成双链rna类似物经滴鼻预防呼吸道传播病毒的应用。
[0008]
作为优选的技术方案，所述滴鼻为局部滴注。
[0009]
作为优选的技术方案，所述预防的呼吸道传播病毒包括新冠病毒以及呼吸道传播病毒。
[0010]
作为优选的技术方案，所述合成双链rna类似物为可以激活天然免疫细胞ifn反应的双链rna类似物，包括但不限于聚肌苷酸胞嘧啶核苷酸poly(i:c)。
[0011]
本发明还公开了一种如权利要求1所述的合成双链rna类似物在呼吸道局部的用途。
[0012]
作为优选的技术方案，所述合成双链rna类似物经鼻滴后增强上呼吸道局部天然免疫细胞诱导细胞干扰素反应的作用，所述合成双链rna类似物为poly(i:c)。
[0013]
作为优选的技术方案，所述合成双链rna类似物经鼻咽部局部鼻滴预防新冠病毒以及呼吸道传播病毒的作用，所述合成双链rna类似物为poly(i:c)。
[0014]
作为优选的技术方案，所述合成双链rna类似物经鼻滴减少新冠病毒以及呼吸道传播病毒感染后下呼吸道的病毒栽量的作用，所述合成双链rna类似物为poly(i:c)。
[0015]
作为优选的技术方案，所述合成双链rna类似物经鼻滴避免全身诱导细胞干扰素
反应带来的下呼吸道或全身炎症反应加重作用。
[0016]
由于采用了上述技术方案，合成双链rna类似物经滴鼻预防呼吸道传播病毒的应用及其用途，一种合成双链rna类似物经滴鼻预防呼吸道传播病毒的应用。
[0017]
本发明的优点如下：
[0018]
1)本发明论证通过使用poly(i:c)滴鼻可有效激活小鼠呼吸道天然免疫细胞的i型和iii型ifn反应。
[0019]
2)本发明论证通过使用poly(i:c)滴鼻可有效降低小鼠后续感染病毒后肺部的病毒载量；
[0020]
3)本发明开拓了poly(i:c)功能的新发现，通过低浓度poly(i:c)滴鼻激活上呼吸道局部天然免疫细胞的ifn反应，减少全身副作用，覆盖病毒谱较广，应用前景大。
[0021]
4)本发明探索了通过局部激活上呼吸道ifn反应增强天然免疫应答来预防经呼吸道传播的病毒感染提供新思路。
[0022]
鼻咽部局部滴注poly(i:c)激活上呼吸道天然免疫细胞的干扰素(interferon，ifn)反应——增强抵御呼吸道病毒感染的第一道防线；poly(i:c)激活上呼吸道局部i型和iii型干扰素反应能够有效并相对长时间预防病毒的感染、减少病毒复制、向下呼吸道或血行播散以及炎症反应扩大带来的全身器官功能损害。
[0023]
本发明采用poly(i:c)局部刺激鼻咽部来增加上呼吸道天然免疫细胞的ifn反应，作为一种局部应用的增强天然免疫功能以抵御病毒的新型疫苗。poly(i:c)是一种合成的双链rna(dsrna)类似物，通过prr(主要是rlrs和tlr3)激活非特异性ifn反应同，一方面可以有效诱导上呼吸道天然免疫细胞的ifn反应，另一方面避免了直接外源性补充ifn造成的一系列副作用。经由细胞实验和动物体内实验表明，poly(i:c)可有效激活天然免疫细胞的i型和iii型ifn反应从而降低细胞感染病毒后的病毒载量；poly(i:c)局部刺激小鼠鼻咽部亦有效增强小鼠抵御病毒感染的能力。
附图说明
[0024]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0025]
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
[0026]
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
[0027]
图1为实施例poly(i:c)预刺激增强巨噬细胞干扰素反应并抑制病毒复制图；poly(i:c)(10μg/ml)预刺激巨噬细胞12h后，vsv再次刺激，rtq-pcr检测ifnβ(图1a)、ifnλ产量(图1b)和病毒载量(图1c)；
[0028]
图2为实施例poly(i:c)预刺激增强巨噬细胞干扰素反应的时间窗图；(图2a)poly(i:c)(10μg/ml)刺激巨噬细胞12h后，在不同的时间点vsv再次刺激6h，rtq-pcr检测病毒载量；(图2b)poly(i:c)刺激巨噬细胞不同时间点后，vsv再次刺激6h，rtq-pcr检测病毒载量；
[0029]
图3为实施例poly(i:c)预刺激增强巨噬细胞干扰素反应的合理浓度以及预防rna
和dna病毒感染的效力图。(图3a)不同浓度poly(i:c)刺激巨噬细胞12h后，vsv再次刺激6h，rtq-pcr检测病毒载量；(图3b)不同浓度poly(i:c)刺激巨噬细胞12h后，vsv、sev和hsv(moi:1)再次刺激6h，tcid50检测病毒载量；
[0030]
图4：poly(i:c)预刺激保护人和小鼠的肺上皮细胞的病毒感染并降低肺部病毒量图；(图4a)poly(i:c)(5μg/ml)刺激人肺癌细胞(a549)和小鼠气管上皮细胞(mle12)12h后，vsv再次刺激6h，q-pcr检测病毒载量；(图4b)小鼠两侧鼻腔滴注poly(i:c)(25ng in 5ul)12h后，使小鼠经鼻感染vsv，在不同的时间点rtq-pcr检测肺脏病毒载量。
具体实施方式
[0031]
为了弥补以上不足，本发明提供了合成双链rna类似物经滴鼻预防呼吸道传播病毒的应用及其用途以解决上述背景技术中的问题。
[0032]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
[0033]
一种合成双链rna类似物经滴鼻预防呼吸道传播病毒的应用。
[0034]
所述滴鼻为局部滴注。
[0035]
所述预防的呼吸道传播病毒包括新冠病毒以及呼吸道传播病毒。
[0036]
所述合成双链rna类似物为可以激活天然免疫细胞ifn反应的双链rna类似物，包括但不限于聚肌苷酸胞嘧啶核苷酸poly(i:c)。
[0037]
聚肌苷酸胞嘧啶核苷酸poly(i:c)通过鼻咽部局部应用poly(i:c)诱导细胞干扰素(ifn)反应，在病毒感染前即激活上呼吸道的天然免疫应答，有效预防sars-cov-2在内的呼吸道病毒的感染。
[0038]
本发明的第一方面，提供一种通过poly(i:c)经鼻滴注后增强上呼吸道局部天然免疫细胞ifn反应的可行性。
[0039]
本发明的第二方面，提供以poly(i:c)滴鼻应用于预防sars-cov-2在内的呼吸道病毒感染的可行性。
[0040]
本发明的第三方面，提供以poly(i:c)滴鼻应用于减少sars-cov-2在内的呼吸道病毒感染后下呼吸道的病毒载量的可行性。
[0041]
本发明的第四方面，提供以poly(i:c)局部滴注的给药方式避免全身ifn反应带来的下呼吸道或全身炎症反应加重。
[0042]
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
[0043]
实施例一、实验方法
[0044]
1.试剂(包括病毒)制备
[0045]
细胞rnafast200抽提试剂盒购于上海飞捷生物技术有限公司。rna反转录试剂及荧光定量pcr试剂购于toyobo公司。poly(i:c)购自sigma(st.louis,mo)公司，水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus，vsv)(indiana strain)、单纯疱疹病毒1(herpes simplex virus-1，hsv-1)(kos strain)仙台病毒(sendai virus，sev)由海军军医大学微生物教研室提供。rpmi1640培养基和dmem培养基购自pan-biotech公司。胎牛血清(fbs)、
antibiotic-antimycotic(15240)购自gibco公司。
[0046]
2.小鼠原代肺泡巨噬细胞提取
[0047]
c57bl/6j小鼠购自上海必凯实验动物中心，均在spf级环境下饲养培育。小鼠麻醉后颈部备皮、消毒、切皮后逐层分离皮下组织，到达气管后向肺部方向插入头皮针并用丝线固定。缓慢注入1mlrpmi1640培养液，1min后缓慢回抽注入离心管，重复10次后将所取液体离心(2000r/min)10min，弃上清，单细胞悬液混匀后计数并铺板，细胞浓度约1.5
×
10个/ml。每2ml单细胞悬液加入7mlrpmi1640培养液和1ml胎牛血清，充分混匀后于5％co2/37℃的孵箱无菌培养3h,待巨噬细胞贴壁后回收贴壁细胞并调整细胞浓度至1.5
×
10个/ml。
[0048]
3.细胞系
[0049]
人肺癌细胞株(a549)和小鼠气管上皮细胞株(mle12)购于atcc(american type culture collection)公司并由实验室扩增保存。
[0050]
3.elisa检测
[0051]
根据对应试剂盒说明书，依次加入检测缓冲液、待检测样品，室温孵育1-2h后；用试剂盒提供的洗液清洗检测孔，再加入第二抗体室温孵育1-2h；加入洗液清洗检测孔后，再加入辣根过氧化物酶(hrp)偶联的抗二抗抗体室温孵育1h后，再用洗液清洗检测孔后加入反应底物溶液，避光反应15-30min，加入终止液终止反应，并用酶标仪测定od值，最后将od值根据标准曲线换算成相应的蛋白量。
[0052]
4.rt-qpcr检测
[0053]
组织和细胞总rna用trizol提取。收集实验刺激后的组织或细胞，加入1ml trizol试剂，充分吹打(细胞)或打磨(组织)后，加入200μl氯仿，充分颠倒混匀后，室温静置5min；4℃，12,000g离心10min；将上层水相的液体小心吸入新的1.5ml ep管中(注意不要吸入固体蛋白)，加入0.5ml异丙醇，充分颠倒混匀，再室温静置10min后，4℃，12,000g离心10min，弃上清，加入75％乙醇洗涤沉淀一次，于4℃，12,000g离心5min，弃掉上清，待沉淀干燥后加入适量depc水吹打溶解，测定浓度并鉴定纯度，-80℃保存或进行反转录pcr获取cdna，反转录体系及条件如下：
[0054]
rt-pcr反转录体系如下：
[0055]
reaction component volume(μl)
[0056]
revertra ace*1μl
[0057]5×
buffer 4μl
[0058]
1mm dntps 2μl
[0059]
10μm olig dt 1μl
[0060]
total rna template 1μg
[0061]
depc h2o total to 20μl
[0062]
*revertra ace(toyobo，code no：trt-101)
[0063]
rt-pcr反转录反应条件：42℃，25min；99℃，5min；4℃，∞。
[0064]
5.tcid50检测
[0065]
稀释待测病毒液后按浓度梯度接种于96孔板，于55co2/37℃的孵箱无菌孵育1h，吸去病毒液后每孔加入维持液200μl继续在5％co2/37℃的孵箱中培养。48h后显微镜下观察细胞，spearman-karber法计算出该病毒液的tcid50。
[0066]
二、实验结果
[0067]
(一)低浓度poly(i:c)预刺激巨噬细胞可增强其ifn反应并长效抑制后续病毒感染后的复制。在离体细胞实验中，使用poly(i:c)(10μg/ml)预刺激巨噬细胞12h使细胞对于vsv再次刺激，ifn-β(图1a)和ifn-λ(图1b)产量增多而vsv病毒载量减少(图1c)。即poly(i:c)预刺激使巨噬细胞增强抗病毒的i型和iii型ifn反应从而显著抑制病毒复制。结果显示，poly(i:c)预刺激巨噬细胞增强病毒感染后的i型和iii型ifn反应并显著抑制病毒复制；
[0068]
进一步地，检测了poly(i:c)预刺激增强巨噬细胞ifn反应的时间窗。在poly(i:c)(10μg/ml)刺激巨噬细胞12h后，不同的时间点vsv再次刺激6h，结果显示在1-96h内，poly(i:c)预刺激可以显著抑制病毒载量，即poly(i:c)预刺激对于巨噬细胞可以提供持续96h以上的保护力(图2a)；结果显示poly(i:c)刺激12h后，在1-96h内，可以显著抑制病毒载量。说明poly(i:c)预刺激可以持续96h以上的细胞保护力；此外，poly(i:c)预刺激巨噬细胞0.5h后，即可以显著抑制vsv载量。poly(i:c)预刺激1h-12h，对病毒载量抑制作用没有差异，说明预刺激1h即可得到保护力(图2b)；结果显示poly(i:c)预刺激0.5h后，即可以显著抑制vsv载量。poly(i:c)预刺激1h-12h，对病毒载量抑制作用没有差异，说明预刺激1h即可得到保护力。
[0069]
进一步地，探测了poly(i:c)预刺激增强巨噬细胞干扰素反应的合理浓度以及预防rna和dna病毒感染的效力。在poly(i:c)的浓度方面，1-50μg/ml的poly(i:c)刺激12h后，可以显著抑制病毒载量。5μg/ml浓度和更高浓度的poly(i:c)预刺激，对病毒载量控制效果一致。说明5μg/ml是poly(i:c)保护力的合理浓度(图3a)；结果显示1-50μg/ml的poly(i:c)刺激12h后，可以显著抑制病毒载量。5μg/ml浓度和更高浓度的poly(i:c)预刺激，对病毒载量控制效果一致。说明5μg/ml是poly(i:c)产生保护力的有效浓度。不同浓度poly(i:c)刺激巨噬细胞12h后，vsv、sev和hsv(moi:1)再次刺激6h，tcid50结果显示5-10μg/ml的poly(i:c)刺激12h后，可以显著抑制vsv、sev和hsv病毒载量。5μg/ml浓度和更高浓度的poly(i:c)预刺激，对病毒载量控制效果一致。说明5μg/ml是poly(i:c)保护力的合理浓度，对rna和dna病毒同样具有保护力(图3b)；结果显示5-10μg/ml的poly(i:c)刺激12h后，可以显著抑制vsv、sev和hsv病毒载量。5μg/ml浓度和更高浓度的poly(i:c)预刺激，对病毒载量控制效果一致。说明5μg/ml是poly(i:c)保护力的合理浓度，对rna和dna病毒同样具有保护力。
[0070]
(二)poly(i:c)预刺激可以保护人和小鼠的肺上皮细胞的病毒感染。
[0071]
poly(i:c)(5μg/ml)预刺激人肺癌细胞(a549)和小鼠气管上皮细胞(mle12)12h后，vsv再次刺激6h，发现poly(i:c)预刺激细胞的病毒载量显著低于对照组，说明poly(i:c)预刺激可以保护人和小鼠的呼吸道上皮细胞的病毒感染(图4a)；结果显示poly(i:c)预刺激12h后，可以显著抑制病毒载量。说明poly(i:c)预刺激可以保护人和小鼠的肺上皮细胞的病毒感染。
[0072]
(三)小鼠使用poly(i:c)滴鼻可以降低后续经呼吸道病毒感染后肺部的病毒载量。
[0073]
poly(i:c)(25ng in 5μl)滴鼻小鼠12h后，使小鼠经鼻感染vsv，在不同的时间点检测小鼠肺脏的vsv病毒载量，结果显示poly(i:c)滴鼻可显著减少感染病毒后肺部的病毒载量。见图4b；结果显示poly(i:c)滴鼻组小鼠肺部病毒复制显著受到抑制。
[0074]
三、讨论
[0075]
sars-cov-2的变异型毒株omicron目前流行于全球，造成严重的社会和经济负担。作为一种通过呼吸道传播的病毒，omicron的特点是致病力弱但传染性强，因此相对于传统的经静脉接种疫苗建立的获得性免疫，直接加强上呼吸道天然免疫细胞的抗病毒能力可能对于预防omicron的感染更为有效。通过细胞实验证实，poly(i:c)可有效增强小鼠巨噬细胞的干扰素反应，从而抵御后续病毒的感染。同样的效应也在人和小鼠的肺上皮细胞系中得到证实。在小鼠实验中，poly(i:c)滴鼻可有效降低病毒感染后肺部的病毒载量。一方面可能是poly(i:c)增强上呼吸道的干扰素反应直接抑制了病毒的局部感染，减少病毒复制以及向下呼吸道的播散；另一方面，病毒本身具有抑制干扰素反应的机制，但因局部poly(i:c)诱导作用在病毒感染之前即激发了一定程度的干扰素反应，因此避免了病毒造成的天然免疫抑制效应，占据先机增强了机体的抗病毒能力。此外，poly(i:c)激活的干扰素效应是非特异性的。非特异性不仅体现在所激活干扰素的类型，也体现在对于不同病毒均具有抵御能力。首先，poly(i:c)预刺激同时上调了巨噬细胞的i型干扰素(ifn-β)和iii型干扰素(ifn-λ)。i型干扰素和iii型干扰素都具有显著的抗病毒效应，但直接运用外源性干扰素已报道产生损害肺上皮再生、破坏呼吸道屏障功能、合并细菌感染、造成全身炎症反应等副作用。其次，实验证实poly(i:c)预刺激可以同时降低rna病毒(vsv和sev)以及dna病毒(hsv)侵入细胞后的复制能力，从而应对病毒的高度变异特性。
[0076]
由于天然免疫细胞的干扰素反应和病毒具有互相对抗的特点，即干扰素反应具有抗病毒作用，但病毒感染细胞后也可通过各种机制削弱干扰素反应。因此，激活天然免疫细胞的干扰素反应的时机非常重要，在病毒感染天然免疫细胞前激活一定程度的干扰素反应可以显著降低后续病毒感染后的复制载量。因此poly(i:c)滴鼻预激活上呼吸道天然免疫细胞的干扰素反应可以将病毒阻断在第一道防线、减少向下呼吸道入侵和炎症反应扩大带来的全身重症反应。
[0077]
在给药途径选择方面本技术采取局部滴注而非吸入是为了规避药物进入下呼吸道的风险。文献报道上呼吸道以上皮细胞的iii型干扰素反应为主，下呼吸道则进一步激活i型干扰素反应。由于i型干扰素受体ifnar在几乎所有细胞上都有表达，因此强烈的i型干扰素反应可能会产生严重的全身副作用。因此本技术选择局部滴注poly(i:c)进行给药，以局部天然免疫细胞应答的形式产生适度的干扰素反应，既能够产生一定的抗病毒效力起到预防作用又避免了全身副作用。
[0078]
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。