一种含有壳聚糖修饰氧化石墨烯的蚕丝-蛛丝复合丝素蛋白纳米微球的制备方法
1.技术领域
2.本发明涉及生物医用材料领域，尤其涉及一种含有壳聚糖修饰氧化石墨烯的蚕丝-蛛丝复合丝素蛋白纳米微球的制备方法。
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背景技术：
4.烧伤和烫伤是日常生活中常见的意外伤害，轻度烧烫伤可能会使患者皮肤受损，而重度烧烫伤将会危及患者生命并带来终生伤害。目前对于轻度的烧烫伤，传统的方法是对伤口进行消毒清理后，贴以无菌纱布等进行保护和压迫伤口。当然这种方法的治疗周期长且效果有限，常用以生物材料为基础的敷料来促进伤口愈合等，以增强对于轻度烧烫伤的治疗效果。然而，目前的生物材料敷料，多以为保持伤口湿润和透气为主，对伤口主动治疗的生物材料敷料较少。对于烧烫伤口，由于伤口的微环境变化导致细菌能够快速的生长与繁殖，因此，为抑制细细菌在伤口的大量繁殖影响伤口愈合效果，需要抗菌药物等来杀死细菌，保护和促进伤口的微环境变化，缩短伤口的愈合恢复期，达到快速治疗的效果。
5.氧化石墨烯是一种极具应用前景的生物抗菌剂，其作为抗菌剂时，生物体对其相容性极好且机体不容易产生抗体，同时具有良好的抗菌作用，能够消灭大多数的细菌。因此，氧化石墨烯作用在烧烫伤口时，能够有助于预防伤口愈合过程中细菌等的感染。
6.天然大分子蛋白质由于其来源丰富，价格低廉，且具有良好的生物相容性，已被广泛应用于生物医用材料领域。大量研究表明，蚕丝丝素蛋白作为从蚕丝中提取出来的天然蛋白质产物，是一种极其理想的药物载体材料，但是由于其强度不够高和弹性性能有限，极大地限制了蚕丝丝素蛋白作为生物医用材料的应用前景。
7.水凝胶膜、纤维等已被广泛的应用于治疗烧烫伤口敷料的材料中，其中纳米微球由于其具有透皮吸收和药物负载等作用被广泛的应用于药物载体材料中，研究表明，皮肤吸收是纳米材料进入体循环的一条可能途径，与传统的透皮技术相比，纳米微球透皮吸收技术有生物相容性和配方多样性的显著优势。其能够将生物活性成分运送到皮肤深层的过程中，释放颗粒所吸附的生物活性材料。纳米微球透皮吸收技术，打破了皮肤吸收壁垒，让皮肤能主动接收药物并产生作用。
8.壳聚糖作为天然的高分子材料因其具有良好的生物安全性、生物可降解性已被广泛的应用于组织工程、生物骨架等领域。但单纯的壳聚糖支架材料由于其力学性能较差，限制了其在生物医用敷料领域的应用。氧化石墨烯除了能够实现抑制烧烫伤口细菌的滋生外，其较大的表面积和良好的力学性能也是负载药物的良好载体。研究表明，壳聚糖和氧化石墨烯的复合材料表现出良好的物理机械性能。因此，将由壳聚糖修饰的氧化石墨烯同丝素蛋白材料结合，可望在能进一步提升复合材料力学性能的同时，实现抑制伤口微生物滋
生、促进负载药物吸收、生物可降解等性能。
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技术实现要素：
10.为了解决上述技术问题，本发明提供了一种含有壳聚糖修饰氧化石墨烯的蚕丝-蛛丝复合丝素蛋白纳米微球的制备方法。本发明先用蛛丝分别和碳酸钠溶液、乙酸溶液反应制备得到蛛丝丝素蛋白溶液，再用碳酸钠溶液对蚕茧进行脱胶处理后，用溴化锂溶液溶解得到蚕丝丝素蛋白溶液。之后将这两种丝素蛋白溶液混合低温保存一段后冻干得到复合丝素蛋白纤维。为得到复合丝素蛋白纤维的微球，将得到的复合丝素蛋白纤维溶解于水中，加入磷酸缓冲液和蛋白酶溶液，加热反应使复合纤维分解为微球后将蛋白酶进行灭活处理，冷冻干燥后得到蚕丝-蛛丝复合丝素蛋白微球。其次制备了壳聚糖修饰氧化石墨烯颗粒，接着分别将壳聚糖修饰氧化石墨烯颗粒和复合丝素蛋白微球分散在少量水中，并超声混合均匀，离心、冷冻干燥后得到壳聚糖修饰氧化石墨烯的蚕丝-蛛丝复合丝素蛋白纳米微球。该复合纳米微球具有良好的生物相容性、生物可降解性、能够促进负载药物的释放进而杀菌、强度和弹性等，其能够缓慢释放氧化石墨烯来抑制伤口细菌滋生，同时蛛丝丝素蛋白和壳聚糖能够促进伤口的愈合，如果将其作为伤口敷料等，能够有效地治疗烧烫伤伤口；同时该方法操作过程简单、无毒无害、绿色环保。
11.本发明的具体技术方案为：一种含有壳聚糖修饰氧化石墨烯的蚕丝-蛛丝复合丝素蛋白纳米微球的制备方法，包括以下步骤：步骤1）：取洗净的蜘蛛丝，置于碳酸钠溶液中煮沸脱胶，并用水清洗，获得脱胶蜘蛛丝。
12.步骤2）：将脱胶蜘蛛丝置于乙酸溶液中加热反应，反应后将所得混合溶液进行离心，收集上层清液，得到蛛丝蛋白混合溶液，在水中透析后，得到较纯的蛛丝蛋白溶液。
13.蛛丝丝素蛋白作为另一种天然的蛋白质，它和蚕丝丝素蛋白的结构类似且具有较好的生物相容性。蛛丝的延伸度可以达到130%而不断裂。同时它还具有耐湿性和耐低温性能，蛛丝在低温下仍能保持高弹性和防菌防霉的特性，同时，蛛丝丝素蛋白对烫烧伤口具有一定的缓解和治疗效果。该制备步骤得到的蛛丝丝素蛋白纯度高，保留蛛丝强度和弹性的同时能够脱去使机体产生抗性、生物组织相容性低的物质，有利于后面和蚕丝丝素蛋白混合及纳米微球的形成。
14.因此，将蚕丝丝素蛋白和蛛丝丝素蛋白混合得到复合的蚕丝-蛛丝丝素蛋白生物材料，可望在提高作为生物医用材料的弹性和强度的同时，还具有一定的伤口治疗效果，，能够极大地丰富丝素蛋白作为生物医用材料的应用前景。然而，目前对于蚕丝-蛛丝复合作为生物医用材料的研究较少。
15.步骤3）：取蚕丝，洗净后置于碳酸钠溶液中煮沸脱胶，并水清洗后，获得脱胶蚕丝。
16.步骤4）：将脱胶蚕丝在溴化锂溶液中溶解，得到丝素蛋白混合溶液，在水中透析后，得到较纯的蚕丝蛋白溶液。
17.该制备步骤为两步溶出法，能够得到纯度较高的蚕丝丝素蛋白溶液，同时脱去了具有免疫原性、对于生物组织相容性很低的丝胶蛋白，有利于后面包含氧化石墨烯的复合微球的合成。
18.步骤5）：将步骤2）得到的蛛丝蛋白溶液和步骤4）得到的蚕丝蛋白溶液混合均匀，低温保存后冷冻干燥，得到蚕丝-蛛丝复合丝素蛋白溶液。
19.步骤6）：将步骤5）得到的蚕丝-蛛丝复合丝素蛋白溶液放入水中，溶解后置于磷酸缓冲液中，然后加入蛋白酶溶液，将所得混合溶液在水浴中加热，然后升温将蛋白酶灭活，降至室温静置，冷冻干燥得到蚕丝-蛛丝复合丝素蛋白微球。
20.该制备步骤将蚕丝和蛛丝丝素蛋白混合获得复合丝素蛋白溶液。通过蛋白酶溶液酶解，蚕丝丝素蛋白和蛛丝丝素蛋白混合更加均匀，混合丝素蛋白的分子量得到降低，同时获得的具有一定粒径的蚕丝-蛛丝复合丝素蛋白微球为后续和壳聚糖修饰的氧化石墨烯微球的复合提供了良好的基础。
21.步骤7）：将氧化石墨烯溶液、壳聚糖溶液、交联剂和催化剂混合后，搅拌反应使氧化石墨烯和壳聚糖共价结合，得到由壳聚糖修饰的氧化石墨烯水凝胶；低温保存后，冷冻干燥，得到壳聚糖修饰氧化石墨烯颗粒。
22.步骤8）：将壳聚糖修饰氧化石墨烯颗粒和蚕丝-蛛丝复合丝素蛋白微球分散在水中使其呈悬浮液，超声使其混合均匀，将所得混合溶液离心后取下层沉淀物，冷冻干燥，得到含有壳聚糖修饰氧化石墨烯的蚕丝-蛛丝复合丝素蛋白纳米微球。
23.该制备步骤将壳聚糖修饰氧化石墨烯颗粒和蚕丝-蛛丝复合丝素蛋白微球分散于水中，由于复合丝素蛋白微球表面存在活性氨基酸残基，而壳聚糖修饰氧化石墨烯颗粒表面也存在着活性残基，混合超声使壳聚糖修饰氧化石墨烯颗粒表面活性残基和蚕丝-蛛丝复合丝素蛋白微球表面活性残基相互共轭吸附。通过残基间共轭吸附增强了复合材料结构的稳定性，并得到含有壳聚糖修饰氧化石墨烯的蚕丝-蛛丝复合丝素蛋白纳米微球。
24.作为优选，步骤1）中，碳酸钠的浓度为0.3-3.0wt%，蜘蛛丝与碳酸钠溶液的用量比为1g：（100-300）ml，煮沸脱胶时间为20-50分钟。
25.作为优选，步骤2）中，乙酸溶液的浓度为70-90wt%，蜘蛛丝与乙酸溶液的用量比为1g：（30-70）ml，加热反应温度为35-72℃，反应时间4-12小时，离心速度为8500-14000转/分钟，离心时间为10-20分钟，透析时间为30-50小时。
26.作为优选，步骤3）中，碳酸钠的浓度为0.04-0.1wt%，蚕丝与碳酸钠溶液的用量比为1g：（200-800）ml，煮沸脱胶时间为20-50分钟。
27.作为优选，步骤4）中，溴化锂浓度为7-10m，蚕丝与溴化锂溶液的用量比为1g：（20-150）ml，透析时间为45-85小时。
28.作为优选，步骤5）中，蛛丝蛋白溶液与蚕丝蛋白溶液混合的质量比为1：（5-20），低温保存温度为（-60）~（-20）℃，保存时间为8-20小时，冷冻干燥时间为16-30小时。
29.作为优选，步骤6）中，蚕丝-蛛丝复合丝素蛋白溶液的浓度为10-15wt%，磷酸缓冲液的ph=7.5-8.0，磷酸缓冲液与蚕丝-蛛丝复合丝素蛋白溶液的混合体积比为1：（2-5），蛋白酶溶液与蚕丝-蛛丝复合丝素蛋白溶液的混合体积比为1：（30-80），水浴加热温度为40-70℃，加热时间为2-5小时，蛋白酶灭活的升温温度至105℃并维持5-15分钟，降至室温后静置时间为9-20小时，冷冻干燥时间为16-30小时。
30.作为优选，步骤7）中，氧化石墨烯溶液的浓度为2-9g/l，壳聚糖溶液的质量浓度为1-10%，交联剂为质量浓度90-98%的1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液，催化剂为质量浓度95-100%的n-羟基琥珀酰亚胺溶液，混合溶液各组分的质量比为1-（3-二甲
氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐：n-羟基琥珀酰亚胺：壳聚糖=1:1：（3-8）；混合溶液搅拌反应时间12-24小时。冷冻干燥时间为24-48小时。
31.作为优选，步骤8）中，壳聚糖修饰氧化石墨烯溶液的浓度为1-20g/l，壳聚糖修饰氧化石墨烯溶液与蚕丝-蛛丝复合丝素蛋白溶液的混合体积比为1：（10-80），超声时间为20-50分钟，离心速度为8000-15000转/分钟，离心时间为20-40分钟，冷冻干燥时间为24-48小时。
32.与现有技术对比，本发明的有益效果是：（1）本发明含有壳聚糖修饰氧化石墨烯的蚕丝-蛛丝复合丝素蛋白纳米微球可以作为载体装载氧化石墨烯抗菌剂，能够在烧烫伤口有效地抑制细菌生长和繁殖，保护伤口的同时为伤口提供了良好的愈合微环境。
33.（2）本发明含有壳聚糖修饰氧化石墨烯的蚕丝-蛛丝复合丝素蛋白纳米微球中蛛丝丝素蛋白和壳聚糖能够有效地提高该材料的弹性和强度，同时蛛丝丝素蛋白和壳聚糖能够有效地促进伤口的愈合，如果将该微球进一步制作为治疗伤口的敷料等，在得到较好的敷料材料的同时能够快速愈合伤口，有效地缩短病人的治疗周期和痛苦。
34.（3）本发明含有壳聚糖修饰氧化石墨烯的蚕丝-蛛丝复合丝素蛋白纳米微球具有良好的生物相容性，无明显的毒副作用和过敏性反应，且制备材料易得，操作简单，成本较低。
35.（4）本发明由壳聚糖修饰氧化石墨烯的蚕丝-蛛丝复合丝素蛋白纳米微球颗粒分散均匀，稳定高效，粒径大小统一。
36.具体实施方式
37.下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
38.实施例1取3g洗净的蜘蛛丝，置于500 ml的1.0wt%的碳酸钠溶液中煮沸30分钟，并用去离子水清洗后，重复上述步骤一次。将上述得到的蜘蛛丝置于150 ml的70wt%的乙酸溶液中，在60℃下加热反应6小时，反应后将混合溶液在10000转/分钟下进行离心12分钟，收集上层清液，得到蛛丝蛋白混合溶液，将该溶液在去离子水中透析30小时后，得到较纯的蛛丝蛋白溶液。
39.取50g的蚕丝，洗净后置于1.5l的0.05wt%的碳酸钠溶液中煮沸30分钟，并用去离子水清洗后，重复上述步骤一次。将得到的蚕丝在1.5l的8m溴化锂溶液中溶解，得到丝素蛋白混合溶液，将该溶液在去离子水中透析60小时后，得到较纯的丝素蛋白溶液。
40.将得到的蛛丝蛋白溶液和蚕丝蛋白溶液按1:15比例均匀后，-25℃保存10小时后，冷冻干燥18小时得到蚕丝-蛛丝复合丝素蛋白纤维。将得到的蚕丝-蛛丝复合丝素蛋白纤维放入去离子水中溶解使其浓度为10wt%，溶解后按1:2比例置于ph=7.9的磷酸缓冲液中，然后按1:40比例加入一定量的蛋白酶溶液，将混合溶液在45℃水浴中加热3小时后，升温至105℃将蛋白酶灭活并维持6分钟，然后降至室温静置10小时后，冷冻干燥18小时得到蚕丝-蛛丝复合丝素蛋白微球。
41.将8g/l的氧化石墨烯溶液、质量浓度为10%的壳聚糖溶液、质量浓度98%的1-（3-二
甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和质量浓度98%的n-羟基琥珀酰亚胺按5:1:1:3混合后，搅拌反应使氧化石墨烯和壳聚糖共价结合。得到由壳聚糖修饰的氧化石墨烯水凝胶。低温保存后，冷冻干燥36小时得到由壳聚糖修饰的氧化石墨烯颗粒。
42.将得到的蚕丝-蛛丝复合丝素蛋白微球分散在少量去离子水中，使其呈悬浮液，然后按1:20比例加入5g/l的壳聚糖修饰的氧化石墨烯溶液，超声20分钟使其混合均匀，将混合溶液在10000转/分钟下离心30分钟后取下层沉淀物，冷冻干燥30小时后得到由壳聚糖修饰氧化石墨烯的蚕丝-蛛丝复合丝素蛋白纳米微球。
43.该方法中所用蚕丝丝素蛋白较多，蛛丝丝素蛋白较少，得到的复合纳米微球的机械性能稍差，拉伸强度为1.6mpa，伸长率达到121.68%。壳聚糖修饰的氧化石墨烯的用量稍高，体外通过负载抗菌剂四环素的释放试验中在第1、3、7和12天分别累计释放了约13.7%、36.8%、65.1%和80.3%，在第24天累积释放含量约为88.6%。将该复合纳米微粒制作为敷料覆盖于烧伤的大鼠表皮创面上，14天后创面闭合率达79.1%，在第4周无明显创面。
44.实施例2取3g洗净的蜘蛛丝，置于600 ml的2wt%的碳酸钠溶液中煮沸30分钟，并用去离子水清洗后，重复上述步骤一次。将上述得到的蜘蛛丝置于200ml的75wt%的乙酸溶液中，在55℃下加热反应8小时，反应后将混合溶液在10000转/分钟下进行离心12分钟，收集上层清液，得到蛛丝蛋白混合溶液，将该溶液在去离子水中透析35小时后，得到较纯的蛛丝蛋白溶液。
45.取20g的蚕丝，洗净后置于1.0l的0.05wt%的碳酸钠溶液中煮沸30分钟，并用去离子水清洗后，重复上述步骤一次。将得到的蚕丝在1.5l的7m溴化锂溶液中溶解，得到丝素蛋白混合溶液，将该溶液在去离子水中透析70小时后，得到较纯的丝素蛋白溶液。
46.将得到的蛛丝蛋白溶液和蚕丝蛋白溶液按1:10比例均匀后，-30℃保存12小时后，冷冻干燥24小时得到蚕丝-蛛丝复合丝素蛋白纤维。将得到的蚕丝-蛛丝复合丝素蛋白纤维放入去离子水中溶解使其浓度为10wt%，溶解后按1:3比例置于ph=7.9的磷酸缓冲液中，然后按1:60比例加入一定量的蛋白酶溶液，将混合溶液在50℃水浴中加热4小时后，升温至105℃将蛋白酶灭活并维持10分钟，然后降至室温静置10小时后，冷冻干燥15小时得到蚕丝-蛛丝复合丝素蛋白微球。
47.将3g/l的氧化石墨烯溶液、质量浓度为7%的壳聚糖溶液、质量浓度96%的1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和质量浓度98%的n-羟基琥珀酰亚胺按3:1:1:5混合后，搅拌反应使氧化石墨烯和壳聚糖共价结合。得到由壳聚糖修饰的氧化石墨烯水凝胶。低温保存后，冷冻干燥36小时得到由壳聚糖修饰的氧化石墨烯颗粒。
48.将得到的蚕丝-蛛丝复合丝素蛋白微球分散在少量去离子水中，使其呈悬浮液，然后按1:50比例加入10g/l由壳聚糖修饰的氧化石墨烯溶液，超声30分钟使其混合均匀，将混合溶液在10000转/分钟下离心30分钟后取下层沉淀物，冷冻干燥36小时后得到由壳聚糖修饰氧化石墨烯的蚕丝-蛛丝复合丝素蛋白纳米微球。
49.该方法中所用蚕丝丝素蛋白和蛛丝丝素蛋白比例适中，得到的复合纳米微球的机械性能合适，拉伸强度为1.9mpa，伸长率达到125.82%。壳聚糖修饰的氧化石墨烯的用量偏低，体外通过负载抗菌剂四环素的释放试验中在第1、3、7和12天分别累计释放约了16.3%、39.4%、68.9%和83.7%，在第24天累积释放含量约为90.0%。将该复合纳米微粒制作为敷料覆
盖于烧伤的大鼠表皮创面上，14天后创面闭合率达85.9%，在第4周无明显创面。
50.实施例3取3g洗净的蜘蛛丝，置于500 ml的2.5wt%的碳酸钠溶液中煮沸30分钟，并用去离子水清洗后，重复上述步骤一次。将上述得到的蜘蛛丝置于100 ml的85wt%的乙酸溶液中，在55℃下加热反应10小时，反应后将混合溶液在12000转/分钟下进行离心15分钟，收集上层清液，得到蛛丝蛋白混合溶液，将该溶液在去离子水中透析36小时后，得到较纯的蛛丝蛋白溶液。
51.取20g的蚕丝，洗净后置于1.5l的0.1wt%的碳酸钠溶液中煮沸45分钟，并用去离子水清洗后，重复上述步骤一次。将得到的蚕丝在1.0l的9m溴化锂溶液中溶解，得到丝素蛋白混合溶液，将该溶液在去离子水中透析65小时后，得到较纯的丝素蛋白溶液。
52.将得到的蛛丝蛋白溶液和蚕丝蛋白溶液按1:6比例均匀后，-50℃保存12小时后，冷冻干燥24小时得到蚕丝-蛛丝复合丝素蛋白纤维。将得到的蚕丝-蛛丝复合丝素蛋白纤维放入去离子水中溶解使其浓度为12wt%，溶解后按1:3比例置于ph=7.9的磷酸缓冲液中，然后按1:55比例加入一定量的蛋白酶溶液，将混合溶液在65℃水浴中加热5小时后，升温至105℃将蛋白酶灭活并维持12分钟，然后降至室温静置15小时后，冷冻干燥24小时得到蚕丝-蛛丝复合丝素蛋白微球。
53.将5g/l的氧化石墨烯溶液、质量浓度为7%的壳聚糖溶液、质量浓度95%的1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和质量浓度95%的n-羟基琥珀酰亚胺按5:1:1:6混合后，搅拌反应使氧化石墨烯和壳聚糖共价结合。得到由壳聚糖修饰的氧化石墨烯水凝胶。低温保存后，冷冻干燥24小时得到由壳聚糖修饰的氧化石墨烯颗粒。
54.将得到的蚕丝-蛛丝复合丝素蛋白微球分散在少量去离子水中，使其呈悬浮液，然后按1:40比例加入12g/l壳聚糖修饰的氧化石墨烯溶液，超声40分钟使其混合均匀，将混合溶液在12000转/分钟下离心30分钟后取下层沉淀物，冷冻干燥36小时后得到由壳聚糖修饰氧化石墨烯的蚕丝-蛛丝复合丝素蛋白纳米微球。
55.该方法中所用蚕丝丝素蛋白较少，蛛丝丝素蛋白较多，得到的复合纳米微球的机械性能较强，拉伸强度为2.1mpa，伸长率达到126.31%。壳聚糖修饰的氧化石墨烯的用量合适，体外通过负载抗菌剂四环素的释放试验中在第1、3、7和12天分别累计释放了约14.3%、38.9%、61.6%和79.1%，在第24天累积释放含量约为89.3%。将该复合纳米微粒制作为敷料覆盖于烧伤的大鼠表皮创面上，14天后创面闭合率达82.7%，在第4周无明显创面。
56.本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
57.以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。