一种总黄酮调节佐剂性关节炎大鼠肠道菌群的应用

1.本发明涉及总黄酮调节佐剂性关节炎大鼠肠道菌群的应用。


背景技术：

2.类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，ra)是以损害滑膜、软骨和骨的一种慢性、炎症性自身免疫疾病。大鼠佐剂性关节炎模型在临床表现、病理学、免疫学改变和病理机制等方面与人ra有许多相似特征，是研究ra病理机制和评价治疗ra药物的较理想动物模型。
3.目前关于在药物作用下，佐剂性关节炎大鼠体内维生素c水平与“菌-肠-关节轴”之间的关系尚未见报道。


技术实现要素：

4.针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种总黄酮调节佐剂性关节炎大鼠肠道菌群的应用。
5.为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案：
6.一种总黄酮调节佐剂性关节炎大鼠肠道菌群的应用。
7.进一步的，所述调节包括升高大鼠肠道内厚壁菌门和别样棒菌属中一种或多种菌的丰度，降低大鼠肠道内变形菌门和劳尔氏菌属中一种或多种菌的丰度。
8.进一步的，所述调节与炎症的减少相关。
9.进一步的，所述调节与维生素c含量升高相关。
10.进一步的，炎症的减少为大鼠血清中炎性细胞因子含量降低。
11.进一步的，炎性细胞因子为tnf-α、il-1β、il-6中至少一种。
12.进一步的，总黄酮通过降低大鼠血清中炎性细胞因子含量、提高大鼠血清中维生素c含量、升高大鼠肠道内厚壁菌门及别样棒菌属丰度、降低大鼠肠道内变形菌门及劳尔氏菌属丰度，从而达到预防或治疗佐剂性关节炎的作用。
13.相比于现有技术，本发明的优点在于：
14.1、总黄酮通过降低大鼠(sd)血清中炎性细胞因子含量、提高大鼠血清中vc含量、升高大鼠肠道内厚壁菌门及别样棒菌属(allobaculum)丰度、降低大鼠肠道内变形菌门及劳尔氏菌属(ralstonia)丰度，从而达到预防或治疗佐剂性关节炎的作用。
15.2、大鼠的肠道微生物菌群失调与ra炎症反应密切相关，肠道菌群通过调节远端器官的免疫功能或代谢物通过受损的肠上皮细胞直接进入血液循环系统，合成并释放炎症相关因子，诱发炎症反应，促进ra继发性炎症的发展。
16.vc能够降解肠道微生物功能与ra程度，并且其功能与促炎细胞因子水平tnf-α、il-6呈正相关。总黄酮能够有效改善佐剂性关节炎大鼠体vc含量下降，增加肠屏障保护功能菌的丰度，如厚壁菌门的丰度，可降低肠源性内毒素释放，减轻炎症。
附图说明
17.图1所示为维生素c标准曲线图；
18.图2所示为维生素c标准品高效液相色谱图；
19.图3所示为维生素c供试品溶液高效液相色谱图；
20.图4所示为venn分析；
21.图5所示为α多样性稀释曲线；
22.图6所示为β多样性分析；
23.图7所示为肠道菌群门分类水平物种分布图；
24.图8肠道菌群属分类水平物种分布图；
25.图9所示为lda柱形图；
26.图10所示为群落丰度cladogram图。
具体实施方式
27.下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
28.采用下述实验研究总黄酮调节佐剂性关节炎大鼠的肠道内菌群、炎性细胞因子、大鼠血清中维生素c含量三者之间的关系。
29.1 仪器与材料
30.1.1 仪器
[0031][0032]
1.2 试剂及耗材
[0033][0034][0035]
2方法
[0036]
2.1大鼠血清维生素c含量测定
[0037]
2.1.1供试品溶液的制备
[0038]
造模：购买36只sd雄性大鼠，随机分为6组。每4只大鼠饲养于一笼内，笼底铺满无菌杨木刨花垫料，12h∶12h昼夜交替光照，温度23℃～25℃，湿度50％～60％，饲养期间大鼠自由饮水和进食，适应性饲养一周。大鼠适应良好后，随机选取6只为空白对照组，除空白对照组外的其他大鼠75％乙醇消毒后，利用1ml微量注射器于每只大鼠右后足掌处皮下注射0.1ml 1g/l fca致炎(记为第0d)，注射时针头与皮肤夹角成5
°
斜向下刺入，数小时后即可观察到注射部位出现肉眼可见的肿胀。空白对照组大鼠使用相同方法在相同部位注射同体积0.9％氯化钠注射液。于第8d将每只大鼠右后足掌处皮下注射0.05ml 1g/l fca加强免疫。
[0039]
分组：造模成功大鼠随机分为6组，每组6只，分为空白对照组(cg)、模型组(mg)、甲氨蝶呤组(wpg)、雷公藤多苷组(cpg)、乌苏里瓦韦总黄酮高剂量组(lhg)、乌苏里瓦韦总黄酮低剂量组(llg)。
[0040]
wpg组灌胃9.45mg/kg/d，cpg组灌胃0.5mg/kg/3d，lhg组灌胃472.86mg/kg/d，llg组灌胃283.5mg/kg/d，均利用三蒸水配制，模型组及空白对照组灌胃三蒸水，从第15d开始按10ml/kg对大鼠进行灌胃给药，每天早晨9点灌胃，至28d。
[0041]
取大鼠血清，每组取3只大鼠血清等量合并为一个样品，每个样品500μl，共6个样品，分别加入170μl 10％偏磷酸溶液，混匀，4000r/min，4℃，离心10min，取上清液，利用hplc法进样测定vc含量，每个样品测定3次，取平均峰面积值。
[0042]
2.1.2标准品溶液的配制及标准曲线的建立
[0043]
精密称取2.02mg维生素c标准品，溶于10ml 2.5％偏磷酸中，得维生素c标准储备液备用。分别配制5μg/ml、10μg/ml、12.5μg/ml、15μg/ml、20μg/ml、30μg/ml维生素c系列标准溶液，每个浓度进样3次，以维生素c标准品(μl/ml)为横坐标，色谱峰平均峰面积为纵坐标建立标准曲线。
[0044]
2.1.3hplc色谱条件的确定
[0045]
色谱条件：kromasil c18色谱柱(4.6mm
×
250mm,5μm)；流动相为100mmol/lkh2po4∶甲醇(90∶10)；流速0.6ml/min；进样量5μl；柱温25℃；检测波长243nm。
[0046]
2.1.4精密度试验
[0047]
精密吸取15μl/ml维生素c对照品溶液，连续进样6次，色谱条件同上，测定峰面积值，计算rsd值。
[0048]
2.1.5重复性试验
[0049]
按上述方法制备供试品，重复6次。将供试品按上述色谱条件进样，测定峰面积值，计算rsd。
[0050]
2.1.6加样回收率试验
[0051]
在6份已知维生素c含量的血清样本中分别加入已知量的维生素c标准品，色谱条件同上，测定峰面积值，计算回收率。
[0052]
2.1.7大鼠血清中维生素c含量测定方法
[0053]
将各样品按上述hplc色谱条件和方法进样，测定各样品峰面积，代入线性方程，计算各组大鼠血清中维生素c含量。
[0054]
2.2 16s rrna测序技术检测大鼠肠道菌群变化
[0055]
2.2.1大鼠粪便样品的收集
[0056]
于第28d抚摸大鼠腹部刺激排便，收集各组大鼠粪便，置于干冰中，后移至-80℃冰箱保存备用。
[0057]
2.2.2 dna的提取和pcr扩增
[0058]
采用ctab法提取样本基因组dna，利用1％琼脂糖凝胶电泳检测dna纯度和浓度，使用无菌水稀释样品至1ng/μl。用341f(5
’‑
cctaygggrbgcascag-3’)和806r(5
’‑
ggactacnngggtatctaat-3’)引物对v3+v4可变区进行pcr扩增。
[0059]
2.2.3 illumina novaseq测序
[0060]
将pcr产物进行等浓度混样并使用琼脂糖凝胶电泳纯化，利用dna pcr-free sample preparation kit试剂盒进行文库的构建，经过qubit定量和文库检测合格后，使用novaseq 6000pe250进行上机测序(深圳微科盟科技集团有限公司)。使用uparse软件根据97％的相似度对序列进行操作分类单元(operational taxonomic units,otu)聚类，并使用uchime软件剔除嵌合体。利用qiime2、lefse、r软件对测序结果进行alpha多样性、beta多样性、差异菌属等生物信息学分析。上述分析运用默认参数。
[0061]
2.3统计学分析
[0062]
用spss 26.0软件对实验数据进行统计学分析，组间比较采用单因素方差分析(one-way anova)，结果以均数
±
标准差表示，p《0.05表示差异有统计学意义。
[0063]
3结果与讨论
[0064]
3.1大鼠血清维生素c含量测定结果
[0065]
3.1.1标准品线性及线性范围
[0066]
以进样浓度(mg/ml)为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制维生素c标准曲线，见图1，线性回归方程为：y＝8.2736x+36.043，r＝0.9995，维生素c浓度在5～25mg/ml范围内线性关系良好。维生素c标准品的高效液相色谱图见图2，出峰时间为3.6596min。
[0067]
3.1.2精密度试验
[0068]
精密度试验结果见表9，rsd为0.70％。表明此仪器精密性良好。
[0069]
表1 精密度实验结果
[0070][0071]
3.1.3重复性试验
[0072]
重复性试验结果见2，峰面积平均值为175.9，rsd为2.5％。
[0073]
表2 重复性实验结果
[0074][0075]
3.1.4加样回收率试验
[0076]
从加样回收实验可知，加标后样品中的vc含量均提高，说明大鼠血清中含有vc。加样回收率试验结果见表3，rsd值为1.47％，符合实验要求。
[0077]
表3 加样回收率试验结果
[0078][0079]
3.1.5大鼠血清维生素c含量测定
[0080]
按上述色谱条件测定样品中vc含量，分离度大于1.5，理论塔板数大于6000。大鼠血清中的维生素c高效液相色谱图见图3，出峰时间为3.705min。
[0081]
将供试品维生素c峰面积代入3.1.1项下回归方程中，各组大鼠血清维生素c平均含量见表4。测定结果显示，与cg组比较，mg组、cpg组、llg组大鼠血清中维生素c含量具有极显著差异(p＜0.01)，wpg组大鼠血清中维生素c含量具有显著差异(p＜0.05)，lhg组无显著差异。与mg组比较，所有治疗组大鼠血清中维生素c含量均具有极显著差异(p＜0.01)。证明乌苏里瓦韦总黄酮、雷公藤、甲氨蝶呤均可有效提高佐剂性关节炎大鼠体内维生素c含量，且高剂量乌苏里瓦韦总黄酮组效果最佳。
[0082]
表4 供试品维生素c含量测定结果(n＝3)
[0083][0084]
注：1)空白组比较，aa：p《0.01，a：p《0.05。2)与模型组比较，bb：p《0.01，b：p《0.05。
[0085]
3.2大鼠肠道菌群变化
[0086]
3.2.1 otu分析
[0087]
在给定相似度下聚类所得到的每个样品的otu绘制venn图，6组共有9496个otu，共有otu为555个，说明各组皆有被归类为相同otu的序列。cg、cpg、lhg、llg、wpg、mg组特有otu个数分别为1690个、1831个、1474个、1328个、1392个、1226个，见图4。
[0088]
3.2.2 alpha多样性分析
[0089]
alpha多样性指数可以反映肠道菌群的丰富度和多样性，其中，observed otus、chao1指数可用于衡量物种丰富度的指标，observed otus、chao1指数越大，说明物种的丰富度越高。shannon指数用于衡量物种多样性，shannon指数值越大，说明物种多样性越高。如表5所示，shannon指数显示了各组的肠道菌群多样性无显著性差异(p》0.05)，说明雷公藤多苷、甲氨蝶呤、乌苏里瓦韦对肠道菌群的多样性无明显影响。observed otus和chao 1指数分析显示，与mg组比较，cpg、wpg、lhg组菌群丰度显著升高(p《0.05)，其中cpg和lhg组具有极显著差异(p《0.01)，与cg组的菌群多样性无显著性差异(p》0.05)。说明lhg组物种丰度趋近于正常对照组而有别于模型组，提示乌苏里瓦韦(lu)总黄酮具有改善佐剂性关节炎大鼠物种丰度作用。
[0090]
表5α多样性分析
[0091][0092]
注：1)空白组比较，aa：p《0.01，a：p《0.05。2)与模型组比较，bb：p《0.01，b：p《0.05。
[0093]
alpha多样性稀释曲线(rarefaction curve)是从样品中随机抽取一定测序量的数据，统计它们所代表物种数目或多样性指数，以测序数据量与物种多样性来构建的曲线，曲线的平缓程度反映了测序深度对于观测样本多样性的影响大小，曲线越平缓，表明测序结果已足够反映当前样本所包含的多样性，继续增加测序深度已无法检测到大量的尚未发现的新otu。本次实验alpha多样性稀释曲线如图5所示，曲线趋向平坦，说明本发明测序数据量合理，样本测序深度充分。
[0094]
3.2.3β多样性分析
[0095]
β多样性分析中的pca主成分分析常用于样本多样性分析，样本间距离越远代表样本间多样性差异越大。如图6中主坐标分析图所示，cpg、wpg、lhg组样本与cg组样本相距较近，多样性差异较小，菌群特征接近，而与mg组样本间多样性差异较大。证明经乌苏里瓦韦总黄酮治疗干预后，可引起大鼠肠道菌群结构的变化。
[0096]
3.2.4物种组成分析
[0097]
3.2.4.1门水平上差异
[0098]
测序结果显示，在门分类水平主要检测出21个菌门，分别为：firmicutes(厚壁菌门)、proteobacteria(变形菌门)、bacteroidetes(拟杆菌门)、tenericutes(软壁菌门)、actinobacteria(放线菌门)、acidobacteria(酸杆菌门)、verrucomicrobia(疣微菌门)、tm7、chloroflexi(绿弯菌门)、gemmatimonadetes(芽单胞菌门)、unclassified、nitrospirae、cyanobacteria、euryarchaeota、elusimicrobia、armatimonadetes、chlorobi、ws3、planctomycetes、ad3、other，见图7。与cg组比较，mg组大鼠厚壁菌门丰度明显降低，拟杆菌门、变形菌门丰度明显升高。与mg组比较，各给药组大鼠厚壁菌门均明显上调，拟杆菌门和变形菌门丰度明显下调。说明在门水平上firmicutes、proteobacteria、bacteroidetes菌门可能参与了乌苏里瓦韦总黄酮抗ra过程。
[0099]
3.2.4.2属水平上差异
[0100]
测序结果显示，在属分类水平主要检测出21个菌属，分别为：unclassified、allobaculum(别样棒菌属)、ralstonia(劳尔氏菌属)、oscillospira(颤螺菌属)、ruminococcus(胃瘤菌属)、lactobacillus(乳酸杆菌属)、streptococcus(链球菌属)、coprococcus(粪球菌属)、paraprevotella(帕拉普氏菌属)、aggregatibacter(结肠杆菌)、bifidobacterium(双歧杆菌属)、clostridium(梭状芽孢杆菌属)、turicibacter、blautia(布劳特氏菌属)、dorea(多尔氏菌属)、pseudomonas(假单胞菌属)、desulfovibrio(脱硫弧菌属)、prevotella(普雷沃菌属)、kaistobacter(凯斯通氏菌属)、bacillus(芽孢杆菌属)、other，见图8。与cg组比较，mg组大鼠unclassified、oscillospira、lactobacillus菌属丰度明显降低，allobaculum、ralstonia菌属丰度明显升高。与mg组比较，cpg组、lhg组、llg组大鼠unclassified、ralstonia、oscillospira菌属丰度上调，wpg组ralstonia菌属丰度下调。说明在属水平上unclassified、ralstonia、oscillospira菌属可能参与了乌苏里瓦韦总黄酮抗ra过程。
[0101]
3.2.5物种差异判别分析
[0102]
为进一步评估分组间细菌群落的显著性，选用多级物种差异判别分析(linear discriminate analysis size effect,lefse)在属水平上筛选各组显著差异的细菌类群，见图9和10。lda柱形图中每一横向柱形体代表一个物种，柱形体长度对应lda值，lda值越大表示差异越大，在各组中丰度较高的菌属为该属特征微生物。cladogram图由内到外分别对应界门纲目科属不同的分类层级，层级间连线代表所属关系，每个圆圈点代表一个物种，非黄色节点为该组特征微生物。
[0103]
分析结果显示，与cg组比较，cpg组、lhg组差异菌属增多。其中cpg组gammaproteobacteria(γ-变形菌属)、pseudomonadales(假单胞菌属)、vibrionaceae(弧菌属)、pseudomonadaceae、vibrio(弧菌属)、pseudomonas(假单胞菌属)、stenotrophomonas(寡养单胞菌属)、bdellovibrionales(蛭弧菌)、delftia(戴尔福特菌
属)、enhydrobacter(水栖菌属)、moraxellaceae(莫拉菌属)、serratia(沙雷氏菌属)丰度增加，lhg组faecalibacterium(普拉梭菌)、bacteroides(拟杆菌属)、bacteroidaceae、porphyromonadaceae、parabacteroides、dialister、butyricimonas、eubacterium(真杆菌属)、sarcina、gemmiger丰度增加。与mg组比较，wpg组、cpg组、lhg组差异菌属均增多。
[0104]
综上所述，lu总黄酮治疗通过降低大鼠血清中细胞因子含量、提高大鼠血清中vc含量、升高大鼠肠道内厚壁菌门及别样棒菌属(allobaculum)丰度、降低大鼠肠道内变形菌门及劳尔氏菌属(ralstonia)丰度，显着抑制aa大鼠的ra状态。关节囊、半月板、软骨、滑膜等均能产生炎性介质，与炎性细胞因子密切相关，进而炎性细胞因子产生关节炎，反之，关节炎又刺激各种炎性细胞因子生成，互为因果。tnf-α、il-1β、il-6是三种常见的炎性细胞因子，在发生关节炎时，这三种炎性因子含量会显著增加。vc是一种经典的抗氧化剂，可通过减少炎性细胞因子含量和氧化应激来缓解各种器官损伤和包括关节炎在内的各种炎症反应。有研究证明，机体内vc含量较高时，可显着降低tnf-α、il-1β、il-6的表达，并有效缓解炎性细胞因子导致的机体内的各种炎性反应。ra患者通常缺乏vc且需要高剂量补充以维持血浆内的vc水平。所以，降低体内细胞因子含量，逆转由于炎症反应导致的体内vc含量降低，可以有效阻止ra的发生。本实验测定结果表明mg组大鼠血清中vc含量显著低于cg组(p＜0.01)，并且mg组大鼠血清中vc含量明显低于cg组。而经lu高剂量总黄酮治疗后，大鼠体内的炎性因子含量有所降低且与cg组极为接近，无显著差异；lhg组大鼠血清中vc含量也与cg组较为接近。证实lu高剂量总黄酮可有效改善佐剂性关节炎大鼠体内vc含量下降。
[0105]
肠道菌群的改变可能会导致ra的早期发展，而vc能够降解肠道微生物功能与ra程度，并且其功能与促炎细胞因子水平tnf-α、il-6呈正相关。肠道微生物菌群失调与ra炎症反应密切相关，肠道菌群通过调节远端器官的免疫功能或代谢物通过受损的肠上皮细胞直接进入血液循环系统，合成并释放炎症相关因子，诱发炎症反应，促进ra继发性炎症的发展。增加肠屏障保护功能菌丰度，如厚壁菌门的丰度，可降低肠源性内毒素释放，减轻炎症。在本实验中，mg组大鼠变形菌门丰度最高，而经过lu高剂量黄酮治疗后，大鼠体内变形菌门丰度则显著降低，接近cg组。且ra患者体内变形菌门丰度高于正常人体内变形菌门的丰度，与本实验结果一致。目前国内外对于别样棒菌属的研究较少，在本发明中，经过lu高剂量黄酮治疗后，大鼠体内别样棒菌属丰度显著升高，说明其可能与ra的发病机制密切相关，值得进一步深究该菌属在ra防治中的意义。目前对于劳尔氏菌属的报道多集中于其对植物的病害研究上，而关于其与ra的相关作用则甚少有人研究，本发明首次发现在ra小鼠与正常小鼠中劳尔氏菌属丰度的变化，也可为后续有关ra的防治方面提供一定的理论数据。
[0106]
本实验所采用的阳性药物有两种，分别是甲氨蝶呤与雷公藤，甲氨蝶呤被欧洲抗风湿病联盟和美国风湿病学会定位于早期ra治疗的首选用药，但其肝毒性较大，高剂量可致肾衰竭。雷公藤多苷可防治类风湿性关节炎，其毒性主要表现在对肝脏具有直接损伤作用，并具有肾毒性反应，可损伤肾小管与肾间质。本发明结果表明，wpg组和cpg组大鼠脏器均出现不同程度损伤，而lhg组大鼠未出现此不良反应，lu总黄酮用于治疗ra疗效显著，且较甲氨蝶呤、雷公藤多苷更具安全性，值得临床推广应用。
[0107]
通过对大鼠佐剂性关节炎模型中各实验组的促炎细胞因子、血清中维生素c含量、大鼠肠道菌群变化研究结果推测乌苏里瓦韦高剂量总黄酮可通过上调大鼠肠道菌群中unclassified、ralstonia、oscillospira菌属丰度，进而提高佐剂性关节炎大鼠体内维生
素c含量，降低tnf-α、il-1β、il-6含量，从而发挥抗ra作用。