双硫仑药物在治疗骨关节炎中的应用的制作方法

1.本发明涉及医药技术领域，特别是涉及一种双硫仑药物在治疗骨关节炎中 的应用。


背景技术：

2.骨关节炎(osteoarthritis，oa)是一种以关节软骨的变性、破坏及骨质 增生为特征的慢性关节病，是严重的医学问题，是我国第四大致残疾病和欧美 第三大致残疾病。
3.软骨下骨是关节的骨床，关节软骨位于其上。传统上，骨关节炎(oa)被 认为是关节软骨的磨损和撕裂，但最近的证据表明，软骨下骨紊乱和滑膜炎症 可以引发并导致疾病进展。
4.骨关节炎的特征是炎症、免疫和中枢神经系统功能障碍在整个关节损伤、 损伤进展、疼痛和残疾中起核心作用的多种疾病。而软骨下骨硬化、增厚则是 骨关节炎的主要诱因之一。软骨下骨是骨软骨连接处的过渡部分，介于软组织 和硬组织之间，用于吸收关节加载过程中的应力，当加载异常时，则会导致骨 软骨连接处的微骨折，出现骨质塌陷，随后则出现软骨下骨硬化现象。很多实 验证明，软骨下骨重朔或者硬化发生在关节软骨退变之前，关节软骨的完整性 取决于其下方骨床的生物力学特性，因此软骨下骨硬化可能是oa发病的始发 因素。
5.现有技术中常将双硫仑药物用于治疗肿瘤，而采用注射空载生物凝胶的方 式来改善骨关节炎的症状，由于空载生物凝胶不包含治疗性药物，因此，其治 疗骨关节炎的效果有限。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于克服现有技术中存在的不足，并提供一种双硫仑药物在 治疗骨关节炎中的应用，该双硫仑药物、载药微凝胶球及载药支架能够增强或 诱导软骨下骨重朔，恢复关节骨床，从而治疗及缓解骨关节炎的症状，使双硫 仑药物在治疗骨关节炎方面得到了新的应用。
7.为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
8.双硫仑纳米药物在治疗骨关节炎中的应用。
9.进一步地，所述双硫仑药物包括药物和递药系统，所述药物包括双硫仑或 双硫仑衍生物，所述递药系统包括plga和plga-b-peg。
10.进一步地，所述plga、plga-b-peg、以及药物的质量比为25-50：25-50： 10。
11.进一步地，所述plga、plga-b-peg、以及药物的质量比为45：45：10。
12.进一步地，所述双硫仑药物用于增强或诱导损伤之后的软骨下骨重朔。
13.进一步地，所述双硫仑药物用于改善软骨细胞功能。
14.进一步地，所述改善软骨细胞功能具体包括改善骨小梁平均厚度、改善骨 小梁数量、改善骨小梁分离度、以及改善骨密度或骨矿物质密度参数。
15.进一步地，所述双硫仑药物用于治疗损伤引起的骨关节炎。
16.进一步地，所述损伤包括膝、髋、踝或肘关节的损伤。
17.进一步地，所述双硫仑药物通过局部注射的方式导入病灶部位。
18.本发明提供一种双硫仑药物的新应用，用于治疗骨关节炎，通过本发明的 实验数据显示本发明的双硫仑药物在治疗骨关节炎方面的应用真实有效，其能 够改善软骨细胞功能具体包括改善骨小梁平均厚度、改善骨小梁数量、改善骨 小梁分离度、以及改善骨密度或骨矿物质密度等参数，还能够用于治疗损伤引 起的骨关节炎，具有重大的意义，为双硫仑药物提供了新的、广阔的应用前景。
附图说明
19.图1中a为双硫仑药物对软骨细胞的毒性实验结果图，b为不同浓度的双 硫仑药物对oa软骨细胞的改善效果对照图。
20.图2为大鼠碘乙酸骨关节炎模型建立后21天，采用不同组合物治疗4周后 各组骨关节的micro-ct图。
21.图3为为大鼠碘乙酸骨关节炎模型建立后21天，采用不同组合物治疗4周 后对软骨下骨重朔重要参数测定的对比图。
22.图4为oa相关炎症因子表达对照图。
23.图5为oa软骨细胞相关炎症蛋白表达量对照图。
24.图6为免疫荧光检测炎症相关蛋白1l-1β、asc表达对照图。
25.图7为注射载药支架1至3天时，软骨细胞的数量与正常数量的对比图。
26.图8为对oa动物胫骨平台和股骨髁进行h&e染色和safranin-o染色组织 学分析图。
27.图9为对膝关节组织切片进行免疫组化染色后aggrecan与collagenⅱ的 表达评估图。
具体实施方式
28.为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。 附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实 现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本 发明的公开内容的理解更加透彻全面。
29.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术 领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术 语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
30.实施例1：本实施例提供一种双硫仑药物在治疗骨关节炎中的应用，所述 双硫仑药物包括双硫仑和/或双硫仑衍生物。所述双硫仑药物能够用于增强或 诱导损伤之后的软骨下骨重朔。所述双硫仑药物能够用于改善软骨细胞功能； 所述改善软骨细胞功能具体包括改善骨小梁平均厚度、改善骨小梁数量、改善 骨小梁分离度、以及改善骨密度或骨矿物质密度参数。所述双硫仑药物用于治 疗损伤引起的骨关节炎；所述损伤包括膝、髋、踝或肘关节的损伤。所述双硫 仑药物可以通过局部注射的方式导入病灶部位。
31.所述双硫仑药物可以制备成纳米颗粒的形式，比如可以包括药物和递药系 统，所述药物包括双硫仑或双硫仑衍生物，所述递药系统包括plga和plga-b
‑ꢀ
peg。所述plga、plga-b-peg、以及药物的质量比为25-50：25-50：10，较佳 地，所述plga、plga-b-peg、以及药物的质量比为45：45：10。
32.但由于纳米颗粒形式的药物释放速度过快，其缓释效果有限，因此，直接 利用其进行体内治疗的效果较差，可以将纳米颗粒作为包载药物，比如可以用 凝胶包载上述纳米颗粒来增强缓释效果。本技术仅对双硫仑药物在治疗骨关节 炎中的新应用进行说明，并不对双硫仑药物的具体形式作要求。
33.目前双硫仑类药物多用于治疗肿瘤，而发明人在长期的研究中发现，双硫 仑及其衍生物对治疗骨关节炎具有非常好的疗效，使其应用范围更广。
34.首先对双硫仑药物进行药物毒性实验，如图1中的a所示，为cck-8检测 双硫仑药物对软骨细胞的毒性实验，图中横坐标为双硫仑药物浓度，纵坐标是 cck检测后的吸光度值，根据吸光度的大小能够判断软骨细胞的存活数量。由 图中可以看出，当双硫仑的药物浓度在100ng/ml以下时，软骨细胞的存活数量 较大，也就是在此浓度范围内药物毒性较小。
35.如图1中的b所示，为白介素1β诱导软骨细胞成炎症软骨细胞(oa)后， 经不同浓度的双硫仑药物治疗后的效果图，其中nc为正常组，由图中可以看出， 当双硫仑药物浓度为50ng/ml时，其数据最接近nc组，也就是在此浓度时治疗 效果最佳，在浓度为1ng/ml、10ng/ml、以及100ng/ml时，软骨细胞的存活数 量均较没有添加双硫仑药物时有所增加，说明在双硫仑药物浓度为100ng/ml以 下时均能起到治疗效果。但当浓度为200ng/ml时，则软骨细胞的存活数量均较 没有添加双硫仑药物时有所降低，则此浓度范围对治疗无效。
36.下面，通过骨关节图片来直观地观察双硫仑的治疗效果，由图2可以观察 到，oa组的股骨髁和胫骨平台可以观察到oa的特征，例如糜烂和骨赘形成， 而nc(正常)组中的正常软骨呈现平整，光滑的表面，没有任何缺陷和骨赘形 成。然而实验组中经双硫仑药物(纳米颗粒)或载药支架(凝胶包载纳米颗粒) 干预4周后，可以看到，软骨损伤明显减少，骨赘和关节面粗糙程度也明显下 降。由此说明，双硫仑药物对治疗软骨损伤具有一定的效果，且载药支架的治 疗效果更佳。
37.下面通过对大鼠损伤性关节炎的治疗效果证明双硫仑药物对治疗骨关节炎 及改善软骨细胞功能切实有效，具体如下：
38.大鼠碘乙酸骨关节炎模型建立：采用8个月龄的无胸腺大鼠，使用腹膜内 注射戊巴比妥麻醉，取仰卧位，显露膝关节，将100ul碘乙酸(1g/l)注射入 大鼠膝关节内，术后2周，关节囊肿大，关节表面暗淡，术后4周关节软骨发 黄，关节内出现小裂缝，第6周可以摸到骨刺和关节韧带粘连。
39.大鼠碘乙酸骨关节炎模型上组合物治疗：大鼠碘乙酸骨关节炎模型建立后 21天，使用组合物(空载微凝胶、双硫仑药物或载药支架)治疗2周和4周， 进行改善骨小梁平均厚度、骨小梁数量、骨小梁分离度、骨密度/骨矿物质密 度等关节状态关键参数的测定。具体检测结果如图7所示。
40.图3为大鼠碘乙酸骨关节炎模型建立后21天，治疗4周后对软骨下骨重朔 重要参数的测定，其中，图3a为tb.th(骨小梁平均厚度)测定，图3b为tb.n (骨小梁数)测定，图3c
为tb.sp(骨小梁分离数)测定，图3d为bmd(骨密 度/骨矿物质密度)测定，图3e为bv/tv(相对骨体积/骨体积分数)测定。分 组如下：nc代表正常大鼠组，oa代表21天时的碘乙酸大鼠骨关节炎模型组， gelma代表空载微凝胶治疗组，nps/dsf代表双硫仑药物治疗组，gelma-nps/dsf 代表载药支架治疗组。
41.由图3a可以看到oa组的骨小梁平均厚度相比nc(正常)组下降，而 nps/dsf组和gelma-nps/dsf组则相比oa组上升，接近nc(正常)组。由图3b 可以看到oa组的骨小梁数相比nc(正常)组下降，而nps/dsf组和gelma
‑ꢀ
nps/dsf组则相比oa组上升，接近nc(正常)组。由图3c可以看到oa组的骨 小梁分离数相比nc(正常)组上升，而nps/dsf组和gelma-nps/dsf组则相比 oa组下降，接近nc(正常)组。由图3d可以看到oa组的骨密度/骨矿物质密 度相比nc(正常)组下降，而nps/dsf组和gelma-nps/dsf组则相比oa组上 升，接近nc(正常)组。由图3e可以看到oa组的相对骨体积/骨体积分数相 比nc(正常)组下降，而nps/dsf组和gelma-nps/dsf组则相比oa组上升， 接近nc(正常)组。
42.由上述结果可知，双硫仑药物对治疗骨关节炎、以及改善软骨细胞功能均 有效果，且由于载药支架相对于双硫仑药物的缓释效果更好，因此载药支架的 治疗、改善效果更为显著。
43.如图4所示，分别为五个与骨关节相关的炎症基因mmp13、1l-6、1l-1β、 nlrp3和aggrecan的因子表达，其中三组数据分别是：nc代表正常组，只加正 常的培养基的因子表达；1l-1β代表造模组，指经1l-1β处理、oa造模24小 时后的因子表达；1l-1β+dsf 50ng/ml代表治疗组，指上述的1l-1β代表造 模组经50ng/ml浓度的双硫仑药物治疗两小时后的因子表达。由图中可以看出， 1l-1β代表造模组的因子表达照nc组明显升高，而1l-1β+dsf 50ng/ml代表 治疗组的因子表达照1l-1β代表造模组则明显下降，与nc组接近。由此说明， 50ng/ml浓度的双硫仑药物能够对骨关节炎症进行改善。
44.如图5所示，为elisa检测有无双硫仑药物条件下oa软骨细胞相关炎症的 蛋白表达量。三组相关的炎症蛋白分别是tnf-α、1l-6和1l-1β。其中，oa 代表骨关节炎组，oa+50ng/ml dsf代表经50ng/ml浓度的双硫仑药物治疗组。 由图中可以看出，经50ng/ml浓度的双硫仑药物治疗后的相关炎症蛋白表达量 照oa组均有所下降。由此说明，50ng/ml浓度的双硫仑药物能够对骨关节炎症 进行改善。
45.如图6所示，为免疫荧光检测炎症相关蛋白1l-1β、asc表达，彩图中绿 色的为有表达，图中可以看出oa炎症组有表达，而治疗组和正常组则没有表达。 说明，双硫仑药物对治疗骨关节炎有效。
46.图7为注射载药支架1至3天时，载药支架对软骨细胞数量的影响图。其 中，nc-d1表示第一天正常软骨细胞的数量，nc-d2表示第二天正常软骨细胞的 数量，nc-d3表示第三天正常软骨细胞的数量，gelma-d1表示注射载药支架一 天时软骨细胞的数量，gelma-d2表示注射载药支架两天时软骨细胞的数量， gelma-d3表示注射载药支架三天时软骨细胞的数量。由图中可以看到，载药支 架对软骨细胞生长没有刺激生长或抑制生长的作用。
47.如图8所示，为对oa动物胫骨平台和股骨髁进行h&e染色和safranin-o 染色组织学分析图。其中，oa代表骨关节炎组，gelma代表空载微凝胶球治疗 组，dsf/nps代表双硫仑药物纳米颗粒治疗组，gelma-dsf/nps代表载药支架治 疗组。由彩图能够看出，根据其组织病理学检查显示，成骨呈绿色，软骨呈红 色，oa组蛋白多糖(红色)含量下降。可以看到，oa
组中关节软骨层表面粗糙， 完整性破坏，出现部分基质纤维化，及可见的纤维肉芽组织填充；而相比较于 载药支架治疗组可见明显减少oa相关软骨变形性(关节面光滑)，软骨破坏和 蛋白多糖损失也明显减少。
48.如图9所示，为对膝关节组织切片进行免疫组化染色后aggrecan与 collagenⅱ的表达评估图。aggrecan又称蛋白聚糖，存在于结缔组织胞外基 质中的大分子蛋白聚糖，为软骨的主要结构大分子；collagenⅱ又称二型骨胶 质，是软骨和关节的主要有机成分，富含骨骼结缔组织特需的氨基酸，可帮助 人体软骨组织再生，在软骨修复的评估中应用广泛。由图中可以看出，治疗组 相比较于oa组中阳性表达蛋白明显升高，载药支架治疗组中aggrecan和 collagenⅱ均明显表达增多。软骨细胞的形态和数量也相对于oa组增加。通过 以上结果可以推断，本发明的双硫仑药物纳米颗粒、载药微凝胶球、以及载药 支架能够显著的缓解骨关节炎对软骨的炎症损伤，有效的治疗骨关节炎，修复 软骨。
49.通过上述实验数据能够说明双硫仑药物对治疗骨关节炎具有一定的有效性， 为双硫仑药物打开了新的应用场景，使双硫仑药物的应用更为广泛。
50.本发明实施例采用关节腔等局部注射的方式导入载药支架，促进了软骨下 骨的重朔，进而达到治疗骨关节炎的目的。且通过实验检测证实了载药支架能 够诱导、增强软骨下骨重塑，改善骨小梁平均厚度、骨小梁数量、骨小梁分离 度、骨密度/骨矿物质密度等关节状态关键参数，证实了双硫仑搭载可注射微 凝胶可以诱导、增强软骨下骨重塑，从而治疗骨关节炎。本发明的载药支架为 治疗骨关节炎提供了一种全新且安全有效的治疗方法，在骨关节炎的治疗上具 有重大意义，其具有广阔的应用前景。
51.以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述 实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特 征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
52.以上实施例仅表达了本发明的优选的实施方式，其描述较为具体和详细， 但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的 普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改 进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权 利要求为准。