1.本发明涉及生物利用度测定
技术领域：
：，具体涉及一种测定硫化汞或含硫化汞物质中汞经口绝对生物利用度的方法。
背景技术：
：：2.汞是自然界中普遍存在的一种重金属元素，其化学形态有单质汞、有机汞(如甲基汞)、可溶性无机汞(如氯化汞)以及难溶性无机汞(如硫化汞)，其中难溶性的硫化汞被多种传统医药用来治疗疾病，并且具有上千年的应用历史。如中药中的朱砂及众多朱砂制剂安宫牛黄丸、小儿惊风散、复方芦荟胶囊、朱砂安神丸、柏子养心丸、一捻金等；藏药中的佐太及众多佐太制剂七十味珍珠丸、仁青常觉、仁青芒觉、坐珠达西、当佐、二十味珊瑚丸等；蒙药中的银珠及其复方雄银散、嗄木珠尔、孟根乌苏-18味丸等；印度医药中的kajjali、ras-sindoor及其复方制剂。这些含硫化汞药物目前仍然在传统医学临床上经常使用。然而，现代科学认为汞是一种有毒元素，能够对机体产生多种损害作用。那么这些含硫化汞药物对机体是否产生以及产生何种程度的有效汞暴露风险，仍不清楚。3.美国环保总署(epa)和世界卫生组织(who)等机构研究报告给出了单质汞、可溶性无机汞、有机汞的口服生物利用度(吸收率)，具体研究现状如下：4.(1)金属态单质汞口服生物利用度：epa研究报告指出液态的金属汞元素被消化道吸收的量非常有限，如bornmann等人研究发现大鼠口服单质汞其生物利用度小于0.01％(bornmann,g.,g.henke,h.alfes,etal.1970.concerningtheenteralabsorptionofmetallicmercury.arch.toxicol.26:203-209)。5.(2)可溶性无机汞口服生物利用度：epa和who研究报告指出，可溶性无机汞在胃肠道内的生物利用度较高。如rohla等人采用放射性203hg标记的可溶无机汞发现人胃肠道对汞的生物利用度为7～15％(miettinen,j.k.1973.absorptionandeliminationofdietary(hg++)andmethylmercuryinman.in:mercury,mercurial,andmercaptans,m.w.millerandt.w.clarkson,ed.springfield,il.p.233-243；rahola,t.,t.hattula,a.korolainenandj.k.miettinen.1973.eliminationoffreeandprotein-boundionicmercuryinman.ann.clin.res.5:214-219)。kostial等人和nielsen等人采用放射性203hg标记方法在大鼠和小鼠上发现，胃肠道对口服可溶性无机汞的真实生物利用度接近于20％，但是实际测定结果略低(kostial,k.,d.kello,s.jugo,etal.1978.influenceofageonmetalmetabolismandtoxicity.environ.healthperspect.25:81-86；nielsen,j.b.1992.toxicokineticsofmercuric-chlorideandmethylmercuricchlorideinmice.j.toxicol.environ.health.37(1):85-122)。piotroski等人采用203hg标记的氯化汞研究hg2+在肠道中的吸收，估算在0.2～12.5mg/kg体重时约有3～4％的氯化汞被吸收，在17.5mg/kg体重时约有8.5％的氯化汞被吸收，在20mg/kg体重时约有6.5％的氯化汞被吸收(piotrowskijk,szymańskaja,skrzypińska-gawrysiakm,koteloj,spornys.intestinalabsorptionofinorganicmercuryinrat.pharmacoltoxicol.1992jan；70(1):53-5.doi:10.1111/j.1600-0773.1992.tb00426.x.pmid:1594537)。6.(3)甲基汞口服生物利用度：epa和who研究报告指出，甲基汞能够在肠道内被高效吸收。如ablerg等人和miettinen等人通过放射性203hg标记甲基汞发现大约鱼身体95％的甲基汞能够被测试对象胃肠道吸收(aberg,b.,l.ekman,r.falk,u.greitz,g.perssonandj.snihs.1969.metabolismofmethylmercury203hgcompoundsinman:excretionanddistribution.arch.environ.health19:478-484；miettinen,j.k.1973.absorptionandeliminationofdietary(hg++)andmethylmercuryinman.in:mercury,mercurial,andmercaptans,m.w.millerandt.w.clarkson,ed.springfield,il.p.233-243)。另外，aberg等人利用放射性203hg标记的硝酸甲基汞研究其被机体吸收情况，结果发现在水溶液中有超过95％硝酸甲基汞被机体吸收(b.,l.ekman,r.falk,u.greitz,g.perssonandj.snihs.1969.metabolismofmethylmercury(203hg)compoundsinman:excretionanddistribution.arch.environ.health19:478-484)。7.尽管epa和who关于汞的研究报告和研究文献给出了单质汞、可溶性无机汞和有机汞的口服生物利用度度，但是没有给出硫化汞的生物利用度。硫化汞是典型的极难溶性共价硫化物，黑色β-hgs的hgs溶度积(ksp)为1.6×10-52，红色α-hgs的hgs溶度积(ksp)为4×10-53(lange’shandbookofchemistry(15thed))。epa的研究报告(hassett-sipple,b,swartout,j,andschoeny,r.mercurystudyreporttocongress.volume5.healtheffectsofmercuryandmercurycompounds.unitedstates:n.p.,1997.web.doi:10.2172/575119.；pu.s.epa.provisionalpeer-reviewedtoxicityvaluesformercuricsulfide.u.s.environmentalprotectionagency,washington,dc,epa/690/r-02/011f,2002.)和who指南(guidanceforidentifyingpopulationsatriskfrommercuryexposure，who，2008)指出硫化汞是不溶性化合物，其中的汞很难被胃肠道吸收。revis等采用放射性203hg标记的硫化汞给予5只雄性小鼠单次灌胃，连续收集10天粪便，然后处死小鼠取出肠道；接着采用反向计算的方法计算硫化汞吸收率，具体为首先计算出灌胃摄入硫化汞中总汞量与粪便和肠道中汞总量的差值，然后用这个差值除以灌胃硫化汞中总汞量，得到的值作为硫化汞口服吸收率(硫化汞口服吸收率＝(灌胃摄入硫化汞中总汞量-粪便和肠道中总汞量)/灌胃摄入硫化汞中总汞量)，经计算具体为0.4％(revis,n.w.,osborne,t.r.,holdsworth,g.etal.mercuryinsoil:amethodforassessingacceptablelimits.arch.environ.contam.toxicol.19,221-226(1990))。然而，epa的报告(epa/690/r-02/011f)指出，采用该反向计算方法获得的硫化汞口服吸收率不可靠，因为误差非常大，不具有统计学意义。具体的，灌胃摄入硫化汞中汞的总放射性强度为336,580±39,304dpm(mean±sd)，粪便和肠道中汞的总放射性强度为335,276±46,498dpm(mean±sd)，这两组数据之差得出的硫化汞口服吸收率为0.4％；然而这两组数据标准差(sd)均大于平均值的10％，故这两组数据仅有的0.4％差异不具有统计学意义。8.综上可知，目前尚不清楚经口暴露硫化汞以及含硫化汞药物中汞的生物利用度，且缺乏可靠的、适用于硫化汞的汞胃肠生物利用度的测定方法。生物利用度是反映所给药物进入人体循环的药量比例，它描述口服药物由胃肠道吸收及经过肝脏而到达体循环血液中的药量占口服总量的百分比。生物利用度分为绝对生物利用度与相对生物利用度。绝对生物利用度是药物吸收进入体循环的量与给药量的比值，实际工作中以血管外给药的药-时曲线下面积(auc)与静脉注射的药-时曲线下面积的比值作为绝对生物利用度，通常认为静脉制剂绝对生物利用度为100％；；而相对生物利用度则是指同一种药物不同制剂之间比较吸收程度与速度而得到的生物利用度值。其中，绝对生物利用度是评估含硫化汞药物、环境硫化汞等暴露风险不可替代的重要指标。然而，由于硫化汞是典型性极难溶性化合物，通过口服途径与静脉注射的药-时曲线下面积(auc)比值方法不适用于测定其口服绝对生物利用度。因此，如何准确测定硫化汞以及含硫化汞物质中汞的口服绝对生物利用度，是目前亟需解决的技术问题。技术实现要素：9.本发明的目的在于提供一种测定硫化汞或含硫化汞物质中汞经口绝对生物利用度的方法，采用本发明提供的方法能够实现硫化汞或含硫化汞物质中汞经口绝对生物利用度的准确测定，为硫化汞和含硫化汞传统药物中汞的暴露风险评估和毒理药理研究奠定了基础。10.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：11.本发明提供了一种测定硫化汞或含硫化汞物质中汞经口绝对生物利用度的方法，包括以下步骤：12.将糊化淀粉液与待测样品混合，得到药物淀粉混悬液，所述待测样品为硫化汞或含硫化汞物质；13.将所述药物淀粉混悬液灌胃给药于实验动物，作为实验组动物；将所述糊化淀粉液灌胃给药于实验动物，作为空白对照组动物；14.分别收集灌胃给药后所述实验组动物和空白对照组动物的尿液以及血液，然后去除所得实验动物的消化道，收集实验动物剩余身体；其中，在灌胃给药前将所述实验动物刺激排尿并将所得尿液丢弃，在灌胃给药后与收集血液前间隔预定时间连续收集尿液；将所述实验动物剩余身体经第一清洗后置于溶解剂中进行浸泡处理，之后依次经第二清洗和匀浆，得到实验动物剩余身体组织匀浆；所述溶解剂为可溶性碱金属硫化物溶液或硫化铵溶液；15.将所述实验动物剩余身体组织匀浆以及收集得到的尿液、血液分别进行检测，分别得到实验动物剩余身体、尿液以及血液中汞的质量；根据式i所示公式计算得到待测样品中汞的经口绝对生物利用度：16.汞的经口绝对生物利用度＝(m1-m2)/m0×100％式i；17.其中，m1—实验组动物吸收汞总质量，所述实验组动物吸收汞总质量为实验组动物的血液、尿液以及实验动物剩余身体中汞质量的总和；18.m2—空白对照组动物吸收汞总质量，所述空白对照组动物吸收汞总质量为空白对照组动物的血液、尿液以及实验动物剩余身体中汞质量的总和；19.m0—待测样品经口摄入的汞总质量，所述待测样品经口摄入的汞总质量为实验组动物灌胃给药所用药物淀粉混悬液中汞的总质量。20.优选地，所述糊化淀粉液中糊化淀粉的浓度为1～10wt％；所述药物淀粉混悬液中待测样品的浓度为0.1～200mg/ml。21.优选地，饲养所述实验动物所需的笼具在使用前依次进行预清洗、灭菌和干燥。22.优选地，饲养所述实验动物时在所需笼具的底部铺设垫料，饲养所述实验动物时所需饲料以及所述垫料中汞含量《5ng/g。23.优选地，所述灌胃给药后相邻两次收集尿液的间隔时间为15min～2.5h；首次收集尿液的时间为灌胃给药后15min～2.5h。24.优选地，所述灌胃给药后收集血液的时间为灌胃给药后1～240h；所述血液为心脏采集方法得到的血液。25.优选地，所述溶解剂的浓度≥1wt％；所述浸泡处理的时间为1s～30min。26.优选地，将所述实验动物剩余身体组织匀浆以及尿液、血液进行检测采用的设备为具有热裂解原理的直接测汞仪。27.优选地，所述m0的获取方法包括：将所述药物淀粉混悬液进行消解，将所得消解液进行检测，得到消解液中汞的浓度，根据所述消解液中汞的浓度以及实验组动物灌胃给药所用药物淀粉混悬液的体积，得到m0。28.优选地，所述消解采用的消解剂硝酸与盐酸的混合液；将所述消解液进行检测采用的设备为具有热裂解原理的直接测汞仪。29.本发明提供了一种测定硫化汞或含硫化汞物质中汞经口绝对生物利用度的方法。本发明通过克服从样品采集、前处理和检测过程中可能产生的汞污染干扰因素，建立了基于体内保留汞量和尿液排泄汞量为基础的口服硫化汞或含硫化汞物质的汞绝对生物利用度(吸收率)检测方法，该方法为硫化汞和含硫化汞传统药物中汞的暴露风险评估和毒理药理研究奠定了基础，适用于药物、环境、食品等领域对经口暴露硫化汞或含硫化汞物质中汞绝对生物利用度的测定。与现有技术相比，本发明提供的方法至少具有以下优势：30.本发明采用可溶性碱金属硫化物溶液或硫化铵溶液作为溶解剂，可以溶解硫化汞，能够有效解决其他常规方法难以清除吸附在实验动物体表(皮毛、四肢、耳鼻喉等)的、排泄物源的硫化汞(该吸附在实验动物体表的硫化汞会对测定汞经口绝对生物利用度造成的严重背景汞干扰)问题；31.本发明计算待测样品中汞的经口绝对生物利用度时，将尿汞也包括在已被吸收利用的汞内，因为尿汞也是通过胃肠吸收经循环系统并被机体利用的汞，这样比传统单纯用体内总汞保留值来计算汞的经口绝对生物利用度更加精确；32.本发明对实验动物整个身体组织中保留总汞分析的策略是移除整个消化道后再测试，因为消化道内残留了大量未吸收的并且未排泄出去的硫化汞或其他形态汞物质，从而排除其对身体组织中保留总汞量的严重干扰。33.进一步地，本发明采用的尿液收集方法能够有效避免代谢笼法引起的粪便等对尿液造成的汞污染问题，而且能够收集几乎所有尿液，可最大限度降低尿汞损失；34.进一步地，本发明提供的方法能够有效降低笼具、垫料、饲料等因素引起的背景汞干扰，有利于提高检测结果准确性；35.进一步地，本发明采用具有热裂解原理的直接测汞仪测定汞含量，有效减少了样品前处理过程对测试结果的干扰，且不需要具有辐射风险以及不易获得的放射性汞同位素，有利于推广应用。具体实施方式36.本发明提供了一种测定硫化汞或含硫化汞物质中汞经口绝对生物利用度的方法，包括以下步骤：37.将糊化淀粉液与待测样品混合，得到药物淀粉混悬液，所述待测样品为硫化汞或含硫化汞物质；38.将所述药物淀粉混悬液灌胃给药于实验动物，作为实验组动物；将所述糊化淀粉液灌胃给药于实验动物，作为空白对照组动物；39.分别收集灌胃给药后所述实验组动物和空白对照组动物的尿液以及血液，然后去除所得实验动物的消化道，收集实验动物剩余身体；其中，在灌胃给药前将所述实验动物刺激排尿并将所得尿液丢弃，在灌胃给药后与收集血液前间隔预定时间连续收集尿液；将所述实验动物剩余身体经第一清洗后置于溶解剂中进行浸泡处理，之后依次经第二清洗和匀浆，得到实验动物剩余身体组织匀浆；所述溶解剂为可溶性碱金属硫化物溶液或硫化铵溶液；40.将所述实验动物剩余身体组织匀浆以及收集得到的尿液、血液分别进行检测，分别得到实验动物剩余身体、尿液以及血液中汞的质量；根据式i所示公式计算得到待测样品中汞的经口绝对生物利用度：41.汞的经口绝对生物利用度＝(m1-m2)/m0×100％式i；42.其中，m1—实验组动物吸收汞总质量，所述实验组动物吸收汞总质量为实验组动物的血液、尿液以及实验动物剩余身体中汞质量的总和；43.m2—空白对照组动物吸收汞总质量，所述空白对照组动物吸收汞总质量为空白对照组动物的血液、尿液以及实验动物剩余身体中汞质量的总和；44.m0—待测样品经口摄入的汞总质量，所述待测样品经口摄入的汞总质量为实验组动物灌胃给药所用药物淀粉混悬液中汞的总质量。45.在本发明中，所述经口绝对生物利用度(或吸收率)是指经口服用的某种物质通过胃肠道吸收进入机体循环的总量与口服摄入该物质的总量之比。46.现有技术中氯化汞(hgcl2)和氯化甲基汞(mehgcl)口服吸收率，一般基于测定体内的保留总汞量计算得到，但是对于硫化汞(hgs)而言，若采用直接测定体内保留总汞量的方法来获得经口绝对生物利用度(吸收率)，则困难重重。申请人研究发现一个关键原因就是实验动物服用hgs后，排泄物来源的汞会吸附在体表和四肢等处；同时，由于hgs溶解度极低，因而通过口服而吸收进入机体的汞量本处于微量级别、甚至痕量级别。上述吸附在实验动物体表总汞量远远高于体内吸收的汞量，即使通过常规清洗也很难排除这种干扰，从而对测试结果造成严重干扰。而hgcl2和mehgcl的口服吸收率非常高(如hgcl2的口服吸收率为7～15％，mehgcl的口服吸收率》95％)，尽管实验动物体表吸附排泄物来源的汞，但是在经过常规清洗后，不会对体内汞保留测试值产生明显影响。本发明通过克服从样品采集、前处理和检测过程中可能产生的汞污染干扰因素，建立了基于体内保留汞量和尿液排泄汞量为基础的口服硫化汞或含硫化汞物质的汞绝对生物利用度(吸收率)检测方法。下面进行具体说明。47.本发明将糊化淀粉液与待测样品混合，得到药物淀粉混悬液，所述待测样品为硫化汞或含硫化汞物质。在本发明中，所述糊化淀粉液中糊化淀粉的浓度优选为1～10wt％，更优选为1～5wt％。在本发明中，所述糊化淀粉液的制备方法，优选包括以下步骤：将淀粉与水混合，得到淀粉液；将所述淀粉液加热至沸腾，得到糊化淀粉液。在本发明中，所述淀粉优选包括马铃薯淀粉或土豆淀粉。本发明对所述硫化汞以及含硫化汞物质的种类没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的硫化汞以及含硫化汞物质均可；在本发明的实施例中，具体是以含硫化汞药物佐太、朱砂以及硫化汞为例进行说明。在本发明中，所述药物淀粉混悬液中待测样品的浓度优选为0.1～200mg/ml，更优选为10～183mg/ml，进一步优选为18.3～50mg/ml。本发明基于糊化淀粉液制备药物淀粉混悬液，有利于使待测样品均匀分散，避免灌胃给药时待测样品浓度不均一的问题。在本发明中，所述糊化淀粉液以及药物淀粉混悬液优选于18～28℃条件下保存。48.得到糊化淀粉液以及药物淀粉混悬液后，本发明将所述药物淀粉混悬液灌胃给药于实验动物，作为实验组动物；将所述糊化淀粉液灌胃给药于实验动物，作为空白对照组动物。在本发明中，所述实验动物优选为小鼠；在本发明的实施例中，具体采用8～12周龄健康spf级别cd-1小鼠。在本发明中，设置实验动物组别时，每组优选包括6～12只实验动物。在本发明中，所述实验组动物所需药物淀粉混悬液的体积与实验动物的体重比优选为(0.1～0.3)ml：10g；本发明对所述灌胃给药的操作方式没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的方式即可；在本发明的实施例中，具体是采用1ml规格注射器将所述药物淀粉混悬液精确灌胃给药于实验动物。在本发明中，所述空白对照组动物所需糊化淀粉液的体积以及灌胃给药的操作方式优选与实验组动物相同，在此不再赘述。在本发明中，灌胃给药结束后，优选记录下每只实验动物灌胃体积和灌胃时间。需要说明的是，在进行所述灌胃给药前，本发明优选将所述药物淀粉混悬液充分震荡摇匀，避免灌胃给药时待测样品浓度不均一的问题。49.在本发明中，饲养所述实验动物所需的笼具在使用前优选依次进行预清洗、灭菌和干燥，以消除背景汞干扰。在本发明中，所述笼具优选包括笼盒、金属网盖和饮水瓶。在本发明中，所述预清洗优选包括依次进行的去污剂清洗、自来水清洗和纯水清洗。在本发明中，所述去污剂清洗优选是将笼具置于含有去污剂的自来水中浸泡10～30min，刷洗干净；所述去污剂具体可以为洗洁精、洗衣液或肥皂。在本发明中，所述自来水清洗优选是采用自来水冲洗3～5次；所述纯水清洗优选是采用纯水润洗3～5次。在本发明中，所述灭菌优选是将预清洗后的笼具置于脉冲高压灭菌锅中在高压条件下进行灭菌；本发明对所述干燥没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的干燥方式即可。50.在本发明中，饲养所述实验动物时优选在所需笼具的底部铺设垫料，具体是将笼具依次进行预清洗、灭菌和干燥后，在所述笼具的底部铺设垫料，将灌胃给药后的实验组动物以及空白对照组动物放入对应编号的笼具中，在每个笼盒中放置饲料以及装有纯水的饮水瓶，进行饲养。在本发明中，所述垫料和饲料中汞含量优选《5ng/g，更优选《3ng/g；所述饲料优选为无菌饲料。本发明优选采用无汞或低汞垫料和饲料，能够有效降低背景干扰。本发明优选按照12h光照以及12h黑暗的方式饲养实验组动物以及空白对照组动物；所述饲养的温度优选为18～28℃，更优选为22℃；湿度优选为30～70％，更优选为40％。51.灌胃给药后，本发明分别收集灌胃给药后所述实验组动物和空白对照组动物的尿液以及血液，然后去除所得实验动物的消化道，收集实验动物剩余身体。本发明在灌胃给药前将所述实验动物刺激排尿并将所得尿液丢弃，在灌胃给药后与收集血液前间隔预定时间连续收集尿液。本发明采用该方式可有效避免传统代谢笼法引起的粪便等对尿液造成的汞污染问题，同时能收集几乎所有尿液，可最大限度降低尿汞损失。本发明对所述刺激排尿的方式没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的方式即可，具体如通过压迫实验动物膀胱刺激排尿；本发明每次收集尿液时优选均采用压迫实验动物膀胱的方式刺激排尿。在本发明中，所述灌胃给药后相邻两次收集尿液的间隔时间优选为15min～2.5h，更优选为45min～1.5h；首次收集尿液的时间优选为灌胃给药后15min～2.5h，更优选为45min～1.5h。本发明优选将尿液收集于预先称重的一次性洁净容器内，-20℃冻存，备用。需要说明的是，在收集尿液时应小心操作，避免粪便对收集的尿液造成汞污染。52.在本发明中，所述灌胃给药后收集血液的时间优选为灌胃给药后1～240h，更优选为24～48h；所述血液为心脏采集方法得到的血液。本发明优选通过将实验动物麻醉或安乐死，以实现血液收集；所述麻醉所用麻醉剂优选包括水合氯醛、戊巴比妥钠或乌拉坦，所述安乐死优选采用试剂优选为二氧化碳。将所述实验动物麻醉或安乐死后，本发明优选快速剖开实验动物胸腔，暴露心脏，用1ml规格注射器插入心脏采集0.2～1ml血液，置于抗凝采血管内，混匀，-20℃冻存，备用。53.收集完血液后，本发明去除所得实验动物的消化道，收集实验动物剩余身体，本发明采用该方式可以避免消化道内容物泄漏而造成的汞污染干扰。本发明优选移除实验动物从食道到肛门的消化道，将所得实验动物剩余身体称重，置于干净的自封袋内，-20℃冻存，备用。54.得到实验动物剩余身体后，本发明将所述实验动物剩余身体经第一清洗后置于溶解剂中进行浸泡处理，之后依次经第二清洗和匀浆，得到实验动物剩余身体组织匀浆；所述溶解剂为可溶性碱金属硫化物溶液或硫化铵溶液。本发明利用可溶性碱金属硫化物溶液或硫化铵溶液作为溶解剂，可以溶解硫化汞，去除实验动物剩余身体体表(皮毛、四肢、尾巴、耳鼻口等)残留的、排泄物来源的硫化汞，消除其对汞经口绝对生物利用度准确测定的干扰。在本发明中，所述第一清洗优选为采用流动自来水冲洗3～7次。在本发明中，所述溶解剂的浓度优选≥1wt％，更优选为4～18wt％，进一步优选为6.5～10wt％；所述可溶性碱金属硫化物溶液中可溶性碱金属硫化物优选为na2s；所述浸泡处理的时间优选为1s～30min，更优选为0.5～4min，进一步优选为1～2min。在本发明中，所述第二清洗优选为采用流动纯水冲洗3～7次。所述第二清洗后，本发明可以将所得实验动物剩余身体直接匀浆，也可以将所得实验动物剩余身体与纯水混合进行匀浆；当将所述实验动物剩余身体与纯水混合进行匀浆时，所述纯水的质量不超过所述实验动物剩余身体质量的10倍，所述纯水的质量优选为实验动物剩余身体质量的20～50％。在本发明的实施例中，所述匀浆具体在组织匀浆捣碎机中进行。所述匀浆后，本发明优选将所得实验动物剩余身体组织匀浆转移至容量规格为50～1000ml的干净容器内备用。55.匀浆得到实验动物剩余身体组织匀浆以及收集得到尿液、血液后，本发明将所述实验动物剩余身体组织匀浆、尿液以及血液分别进行检测，分别得到实验动物剩余身体、尿液以及血液中汞的质量。在本发明中，将所述实验动物剩余身体组织匀浆以及尿液、血液进行检测采用的设备优选为具有热裂解原理的直接测汞仪，如意大利milestonedma-80。本发明优选采用该测汞仪器，其可以对固体以及液体样品进行直接进样测试，无需样品前处理或仅需简单前处理即可；与常规的电感耦合等离子体质谱(icp-ms)法、电感耦合等离子体发射光谱仪(icp-oes)法、原子荧光光谱仪(afs)法、原子吸收光谱(abs)法、比色法等相比较，该法操作简单，可以有效减少样品复杂前处理过程对测试结果的干扰，从而保证了对硫化汞中汞的经口绝对生物利用度分析的准确性。56.具体的，本发明优选称取10～1000mg实验动物剩余身体组织匀浆进行检测，得到实验动物剩余身体组织匀浆中汞的浓度，然后根据此浓度计算出实验动物剩余身体中汞总质量。本发明优选量取10～1000μl尿液进行检测，得到尿液中汞的浓度，然后根据尿液总重量计算出尿液中汞总质量。本发明优选量取10～1000μl血液进行检测，得到血液中汞的浓度，然后根据实验动物体重推算出体内全部血液体积(参考英国natinalcenterforthereplacementrefinement&reductionofanimalsinresearch数据：micehavearound58.5mlofbloodperkgofbodyweight；ratshavearound64mlofbloodperkgofbodyweight.https://www.nc3rs.org.uk/3rs-resources/blood-sampling)，并以此计算出实验动物血液中汞总质量。57.本发明根据式i所示公式计算得到待测样品中汞的经口绝对生物利用度：58.汞的经口绝对生物利用度＝(m1-m2)/m0×100％式i；59.其中，m1—实验组动物吸收汞总质量，所述实验组动物吸收汞总质量为实验组动物的血液、尿液以及实验动物剩余身体中汞质量的总和；60.m2—空白对照组动物吸收汞总质量，所述空白对照组动物吸收汞总质量为空白对照组动物的血液、尿液以及实验动物剩余身体中汞质量的总和；61.m0—待测样品经口摄入的汞总质量，所述待测样品经口摄入的汞总质量为实验组动物灌胃给药所用药物淀粉混悬液中汞的总质量。62.本发明计算待测样品中汞的经口绝对生物利用度时，将尿汞也包括在已被吸收利用的汞内，因为尿汞也是通过胃肠吸收并被机体利用的汞，这样比传统单纯用体内总汞保留值来计算汞的经口绝对生物利用度更加精确。63.在本发明中，所述m0的获取方法优选包括：将所述药物淀粉混悬液进行消解，将所得消解液进行检测，得到消解液中汞的浓度，根据所述消解液中汞的浓度以及实验组动物灌胃给药所用药物淀粉混悬液的体积，得到m0。在本发明中，所述消解采用的消解剂优选硝酸与盐酸的混合液，所述硝酸优选为up纯度或ups纯度，所述盐酸优选为up纯度或ups纯度，所述硝酸与盐酸体积比优选为1：(0.1～10)，更优选为1：(0.5～5)，进一步优选为1：3；本发明优选采用上述组成的消解剂，在室温条件下即可很好地消解样品。在本发明中，所述药物淀粉混悬液与消解剂的用量比优选为100～1000μl：4ml，更优选为100～200μl：4ml。本发明优选将100～1000μl的药物淀粉混悬液置于洁净烧瓶中，然后加入1ml浓硝酸(up纯度或ups纯度)和3ml浓盐酸(up纯度或ups纯度)，进行消解，至完全溶解，得到消解液；本发明优选设置3～10个平行样。在本发明中，将所述消解液进行检测采用的设备优选为具有热裂解原理的直接测汞仪，如意大利milestonedma-80。64.下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。65.实施例166.(1)将2g马铃薯淀粉(青岛万家香食品有限公司，食品级)分散于100ml水中，搅拌加热至沸腾，得到糊化淀粉液；将含硫化汞药物佐太(采购日期为2020-11-04，购自于金诃藏药股股份有限公司，含54.32％hgs)混悬于所述糊化淀粉液中，得到药物浓度为18.3mg/ml的佐太淀粉混悬液，以消除灌胃时药物浓度不均一的问题，室温保存。67.(2)将笼具(包括小鼠笼盒、金属网盖和饮水瓶)在添加洗洁精的自来水中浸泡30min，刷洗干净，之后用自来水冲洗5遍，纯水润洗3遍，然后置于脉冲高压灭菌锅中在高压条件下进行灭菌、干燥，以消除可能引入的汞污染干扰。68.(3)设置小鼠组别与灌胃给药，具体是选取8～12周龄健康spf级别雄性cd-1小鼠，分为空白对照组和实验组，每组动物12只；实验组小鼠：灌胃体积与小鼠体重比为0.1ml：10g，采用1ml规格注射器精确灌胃给予佐太淀粉混悬液；空白对照组小鼠：灌胃体积与小鼠体重比为0.1ml：10g，采用1ml规格注射器精确灌胃给予糊化淀粉液，记录下每只小鼠灌胃体积和灌胃时间。注意在给每只动物灌胃前充分震荡摇匀佐太淀粉混悬液，以消除灌胃产生的药物浓度不均一问题。69.(4)在清洗干净的笼具底部铺上经检测过的低汞垫料(hg浓度为2.35ng/g)，然后将灌完胃小鼠放入对应编号的笼具中，在每个笼具上放上装有纯水的饮水瓶和无菌低汞饲料(hg浓度为4.18ng/g)，按照12h光照、12h黑暗的方式饲养，饲养温度为22℃，湿度为40％。70.(5)样品收集71.a)灌胃所用佐太淀粉混悬液。充分摇匀灌胃所用佐太淀粉混悬液，精密吸取100μl所述佐太淀粉混悬液于15ml洁净离心管，密封，设置10个平行样。72.b)尿液。在每只小鼠灌胃给药前，通过压迫膀胱刺激排尿，此尿液丢弃；在灌胃给药后每间隔1.5h通过压迫膀胱收集尿液于一次性洁净培养皿(预先称量每一个培养皿重量)内，连续收集尿液至麻醉采样前，收集的尿液于-20℃冻存，备用。注意小心操作，避免粪便对收集的尿液产生汞污染。73.c)血液。在每只小鼠给药24h后，采用水合氯醛麻醉，快速剖开胸腔，暴露心脏，用1ml规格注射器插入心脏采集0.5ml血液，置入抗凝采血管内，混匀，-20℃冻存，备用。74.d)去除消化道的小鼠剩余身体。首先小心移除小鼠从食道到肛门的消化道，以避免消化道内容物泄漏而造成的汞污染干扰，再将剩余的小鼠身体称重，置于干净的自封袋内，-20℃冻存，备用。75.(6)样品前处理76.a)灌胃所用佐太淀粉混悬液。向盛有100μl佐太淀粉混悬液的15ml洁净离心管中加入1ml浓硝酸(苏州晶瑞化学股份有限公司，up纯度)和3ml浓盐酸(苏州晶瑞化学股份有限公司，up纯)，在室温条件下进行消解，至完全消解后得到佐太淀粉混悬液的消解液。77.b)采用硫化钠(na2s)溶液浸泡小鼠剩余身体，溶解去除体表残留的硫化汞。用含有洗洁精的水清洗小鼠剩余身体，再用流动自来水清洗7遍，然后将小鼠剩余身体放入浓度为10wt％的硫化钠(天津恒兴化学试剂有限公司，分析纯)水溶液中，浸泡反应1min，然后用流动纯水冲洗7遍，以消除皮毛、四肢、尾巴、耳鼻口等部位可能产生的汞污染；将清洗后的整个小鼠剩余身体放入250ml容量规格的组织匀浆捣碎机中，并按照小鼠剩余身体与纯水的质量比为5：1的比例向组织匀浆捣碎机中加入纯水，充分捣碎成匀浆糊状，得到小鼠剩余身体组织匀浆，然后转移至50ml干净容器内，备用。78.(7)测定总汞79.a)灌胃所用佐太淀粉混悬液的消解液。将佐太淀粉混悬液的消解液用5wt％硝酸稀释1000倍(以体积计)后，量取100μl稀释液，直接加入具有热裂解原理的固体液体直接测汞仪(意大利milestone，dma-80)进行测试，得到佐太淀粉混悬液的消解液中汞的浓度，根据灌胃总体积计算出每只小鼠灌胃摄入的药物中汞的总质量。80.b)尿液。量取100μl尿，直接加入具有热裂解原理的固体液体直接测汞仪(意大利milestone，dma-80)进行测试，得到尿液中汞的浓度，根据尿液总重量计算出24h内每只小鼠尿液中汞的总质量。81.c)血液。量取100μl血液，直接加入具有热裂解原理的固体液体直接测汞仪(意大利milestone，dma-80)进行测试，得到血液中汞的浓度；根据小鼠体重推算出小鼠体内全部血液的体积(参考英国natinalcenterforthereplacementrefinement&reductionofanimalsinresearch数据：micehavearound58.5mlofbloodperkgofbodyweight.https://www.nc3rs.org.uk/mouse-decision-tree-blood-sampling)，并以此计算出每只小鼠血液中汞的总质量。82.d)小鼠剩余身体组织匀浆。称取150mg小鼠剩余身体组织匀浆，直接加入具有热裂解原理的固体液体直接测汞仪(意大利milestone，dma-80)进行测试，得出小鼠剩余身体组织匀浆中的汞浓度，再根据此汞浓度计算出每只小鼠剩余身体组织中汞的总质量。83.(8)根据式i计算出小鼠口服佐太的汞绝对生物利用度(吸收率)为0.0015±0.0004％(mean±sd)，即十万分之一点五；所述式i如下所示：84.汞的经口绝对生物利用度(％)＝(m1-m2)/m×100％式i；85.其中，m1—实验组小鼠吸收汞总质量，所述实验组小鼠吸收汞总质量为实验组小鼠血液、剩余身体和尿液中汞质量的总和；86.m2—空白对照组小鼠吸收汞总质量，所述空白对照组小鼠吸收汞总质量为空白对照组小鼠血液、剩余身体和尿液中汞质量的总和；87.m—药物经口摄入的汞总质量，所述药物经口摄入的汞总质量为灌胃摄入的药物中汞的总质量。88.实施例289.按照实施例1的方法进行操作，不同之处仅在于：90.步骤(1)中佐太淀粉混悬液中药物浓度为183mg/ml；91.步骤(3)中设置小鼠组别时每组动物9只；92.步骤(5)中的a)具体是设置5个平行样；b)具体是在灌胃给药后每间隔1h收集一次尿液；93.步骤(6)中的b)用含有洗洁精的水清洗小鼠剩余身体后，再用流动自来水清洗3遍，然后将小鼠剩余身体放入浓度为18wt％的硫化钠水溶液中，浸泡反应30s；94.步骤(7)中的a)具体是将佐太淀粉混悬液的消解液用5wt％硝酸稀释10000倍；95.步骤(8)中根据式i所示公式计算得到小鼠口服佐太的汞绝对生物利用度(吸收率)为0.0018±0.0004％，即十万分之一点八。96.实施例397.按照实施例1的方法进行操作，不同之处仅在于：98.步骤(1)中将佐太替换为朱砂(购自于亳州市京皖中药饮片厂，非水飞，含99.08％hgs)，具体是将所述朱砂混悬于糊化淀粉液中，得到药物浓度为10mg/ml的朱砂淀粉混悬液(即本实施例后续均以朱砂淀粉混悬液代替实施例1中佐太淀粉混悬液)；99.步骤(3)中设置小鼠组别时每组动物6只；100.步骤(5)中的a)具体是设置5个平行；b)具体是在灌胃给药后每间隔1h收集一次尿液；101.步骤(6)中的b)用含有洗洁精的水清洗小鼠剩余身体后，再用流动自来水清洗5遍，然后将小鼠剩余身体放入浓度为6.5wt％的硫化钠水溶液中，浸泡反应2min；102.步骤(8)中根据式i所示公式计算得到小鼠口服朱砂的汞绝对生物利用度(吸收率)为0.0157±0.0068％，即万分之一点五点七。103.实施例4104.按照实施例1的方法进行操作，不同之处仅在于：105.步骤(1)中将佐太替换为硫化汞(黑色，ar，alfaaesar公司)，具体是将所述硫化汞悬于糊化淀粉液中，得到药物浓度为10mg/ml的硫化汞淀粉混悬液(即本实施例后续均以硫化汞淀粉混悬液代替实施例1中佐太淀粉混悬液)；106.步骤(3)中设置小鼠组别时每组动物6只；107.步骤(5)中的a)具体是设置5个平行；b)具体是在灌胃给药后每间隔2h收集一次尿液；108.步骤(6)中的b)用含有洗洁精的水清洗小鼠剩余身体后，再用流动自来水清洗5遍，然后将小鼠剩余身体放入浓度为4wt％的硫化钠水溶液中，浸泡反应4min，然后用流动纯水冲洗5遍；109.步骤(8)中根据式i所示公式计算得到小鼠口服硫化汞的汞绝对生物利用度(吸收率)为0.0656±0.0211％(mean±sd)，即万分之六点五六。110.测试例111.为了比较本发明中硫化钠水溶液清洗方法与常规清洗对实验动物体表吸附的硫化汞类物质的清除效果，设计如下实验：112.(1)将8～12周龄的cd-1雌性小鼠分为3组，分别为佐太涂抹+硫化钠水溶液清洗组、佐太涂抹+常规清洗组、空白+常规清洗组，每组动物10只。113.(2)将佐太涂抹+硫化钠水溶液清洗组和佐太涂抹+常规清洗组的小鼠周身用浓度为18.3mg/ml的佐太淀粉混悬液涂抹，而空白+常规清洗组对照组小鼠则无此处理。114.(3)麻醉处死各组小鼠，除去消化道，获得无消化道的小鼠剩余身体。115.(4)将佐太涂抹+硫化钠水溶液清洗组的小鼠剩余身体用含有洗洁精的水清洗，再用流动自来水清洗5遍，然后用浓度为10wt％的硫化钠水溶液浸泡反应1min，接着在流动自来水中清洗5遍；将佐太涂抹+常规清洗组的小鼠剩余身体用含有洗洁精的水清洗，再用流动自来水清洗5遍，接着在流动自来水中清洗5遍(即不采用硫化钠水溶液进行清洗)；将空白对照组的小鼠剩余身体用含有洗洁精的水清洗，再用流动自来水清洗5遍，接着在流动自来水中清洗5遍。116.(5)将清洗后各组小鼠剩余身体放入250ml容量规格的组织匀浆捣碎机中，充分捣碎成匀浆糊状，然后转移至50ml干净离心管内，称取150mg所得小鼠剩余身体组织匀浆，直接加入具有热裂解原理的固体液体直接测汞仪(意大利milestonedma-80)进行测试，得出小鼠剩余身体组织匀浆中的汞浓度，再根据此汞浓度计算出每只小鼠剩余身体组织中汞的总质量，具体如表1所示。117.表1小鼠剩余身体组织匀浆中汞浓度结果(n＝10，mean±sd)118.[0119][0120]注：与空白+常规清洗组比较，“***”表示p《0.001。[0121]从上述结果可知：采用硫化钠水溶液可以彻底清除吸附在体表的残留硫化汞，而常规清洗方法则不能完全清除，并且样本间清洗效果变异比较大(rsd＝159.78％)。这表明本发明提供的硫化钠清除动物体表残留硫化汞方法，能够保证硫化汞类物质中汞的口服绝对生物利用度测定的准确性。[0122]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
：的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12当前第1页12