脂肪活性蛋白在制备治疗宫腔粘连药物中的应用的制作方法

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技术实现要素：

18.本发明所要解决的技术问题是提供一种脂肪活性蛋白在制备治疗宫腔粘连药物中的应用，以克服现有技术中治疗宫腔粘连药物有不良反应、治疗不佳、效果不稳定等缺陷，本发明提供一种治疗效果、安全性、稳定性俱佳，且易于量化生产的自体脂肪组织提取的复合物，改善iua女性的生育能力。
19.本发明提供一种脂肪活性蛋白在制备治疗宫腔粘连药物中的应用。
20.优选地，所述脂肪活性蛋白用量为25-30ug/次，给药周期为术后单次给药，无连续给药。
21.优选地，所述脂肪活性蛋白为：通过去除脂肪组织中细胞成分而提取的活性蛋白复合物。
22.优选地，所述药物以脂肪活性蛋白为活性组分，配以药学上可接受的辅料或辅助性成分制备成制剂使用。
23.优选地，所述制剂选自片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、液体制剂、缓释剂中的一种。
24.有益效果
25.本发明将脂肪脱细胞活性蛋白用于iua小鼠模型的治疗，主要治疗效果包括子宫内膜细胞及血管增多，子宫内膜容受性增加及生育力的提高。脂肪脱细胞活性蛋白为iua的临床治疗提供了新的治疗方法。
26.此外，脂肪脱细胞活性蛋白可以通过患者自体脂肪提取，保留生物学活性蛋白的同时去除了细胞成分，可以避免异体组织来源的细胞因子治疗时带来的免疫排斥反应和伦理争议。
附图说明
27.图1为本发明ceffe制备流程图。
28.图2为本发明iua动物模型构建与检测流程图。
29.图3为本发明小鼠iua单侧造模后第14天对小鼠子宫形态评估结果，其中，(a)为小鼠iua造模后第14天小鼠子宫典型照片(图中#1，#2，#3为3只小鼠子宫的代表性图像)，(b)小鼠iua造模后第14天小鼠子宫宫角积液统计。
30.图4为本发明小鼠iua单侧造模后第14天对小鼠子宫病理评估结果，其中，(a)为小鼠iua造模后第14天小鼠子宫的he染色，masson染色，波形蛋白ihc分析及cd31ihc分析的典型图片，(b)为子宫内膜厚度，胶原水平及波形蛋白和cd31染色强度分析。
31.图5为本发明小鼠iua单侧造模并与雄鼠交配后第4天小鼠子宫内膜扫描电镜图(a)以及胞饮突数量统计(b)。
32.图6为本发明小鼠iua造模并与雌鼠交配后第10天对小鼠妊娠评估结果，其中，(a)为小鼠iua造模后并与雄鼠交配后第10天小鼠子宫的典型图片(图中#1，#2，#3为3只小鼠妊娠子宫的代表性图像)，(b)为妊娠子宫角的数量统计。
33.图7为本发明于治疗后第14天对iua组和治疗组小鼠子宫形态观察结果(图中#1，#2，#3为3只小鼠子宫的代表性图像)(a)以及宫角积液情况统计(b)。
34.图8为本发明iua组小鼠及iua治疗组第14天对小鼠子宫病理评估结果，其中，(a)为iua组小鼠及iua治疗组小鼠子宫的he染色、masson染色、波形蛋白ihc分析及cd31ihc分析的典型图片，(b)为子宫内膜厚度、胶原水平、波形蛋白和cd31染色强度分析。
35.图9为本发明iua小鼠及iua治疗组交配后4天的子宫扫描电镜图(a)以及胞饮突数量统计(b)。
36.图10为本发明对iua组小鼠及iua治疗组交配后10天小鼠妊娠评估结果，其中，(a)为iua小鼠及治疗组小鼠与雄鼠交配后第10天小鼠子宫的典型图片(图中#1，#2，#3为3只小鼠妊娠子宫的代表性图像)，(b)为妊娠子宫角的数量统计。
具体实施方式
37.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。
38.实施例1
39.脂肪脱细胞活性蛋白(ceffe)提取：
40.于患者腹部、大腿内侧等脂肪富集处行抽脂手术，无菌环境下生理盐水冲洗去除脂肪组织中的血液和组织碎片，以1200g离心3分钟将混合物分为三层。仅保留中间脂肪层并通过机械法进行常温下乳化处理30min。然后将乳化的脂肪置于-80℃保存，并在37℃快速解冻以破坏细胞膜。在一个冻融循环后，样品以1200g离心5分钟，离心后的混合物分为四层。仅收集第三层液体并通过0.22μm过滤膜过滤以去除细菌和其他碎屑，此时的产物即为ceffe。通过bca方法对ceffe进行蛋白定量至1.25μg/μl后将其冷冻在-80℃以供进一步实验。
41.宫腔粘连的动物模型构建及治疗：
42.小鼠饲养：8周龄c57bl/6n雌性小鼠，饲养于spf实验室中，恒温(25
±
2℃)，恒湿45-55％，昼夜规律(每天光照12小时)，适应一周。
43.宫腔粘连的动物模型构建：使用1％异戊巴比妥，按照5ul/g的剂量麻醉动物，于超净台中仰卧固定小鼠；75％乙醇消毒小鼠腹部，使用无菌手术器械依次剪开腹部组织以暴露子宫；双侧子宫角下缘剪口，使用金属刷(直径0.5-2cm)搔刮左侧，作为造模组；右侧子宫仅剪口作为对照组；手术线缝合腹部，补充足够的饮水及食物供应。造模后的小鼠随机分为三部分进行检测，以判断iua模型是否构建成功：1)造模后12天经腹腔注射10iu pmsg后，2天后处死小鼠观察子宫大体形态，统计子宫积液率，he染色检测内膜厚度、masson染色检测内膜纤维化及免疫组化检测血管密度；2)12天后注射10iu pmsg，2天后注射hcg并与雄鼠按照1：1的比例进行交配，交配4天后处死小鼠通过电镜观察胞饮突，推测小鼠子宫内膜容受性；3)12天后注射10iu pmsg，2天后注射hcg并与雄鼠按照1：1的比例进行交配，交配10天后观察小鼠胚胎的着床。具体检测如下：
44.子宫形态观察：
45.通过颈椎脱臼方法处死小鼠，取仰卧位，75％乙醇消毒后分别剖开小鼠皮肤层及腹膜肌肉层，充分暴露腹腔，分离脂肪组织，取出子宫，迅速放入pbs中清洗，剥离剩余脂肪组织，观察子宫形态，拍照记录，统计子宫积液率。
46.子宫组织he染色：
47.组织固定：将子宫组织裁断(0.5-1cm/段)，取造模侧小鼠子宫粘连处子宫固定于4％pfa中。对照组或治疗组取子宫相对应位置进行固定。
48.组织脱水包埋：已在4％pfa中浸润超2天的组织依次经过不同浓度的酒精及醇苯，二甲苯和石蜡进行固定包埋。
49.组织切片脱蜡：使用石蜡切片机行蜡块切片，厚度为7.5μm，并依次经过二甲苯，及不同浓度乙醇直至双蒸水清洗。
50.染色：苏木素染色5min后自来水冲洗，盐酸乙醇分化，清水冲洗后伊红液染色。
51.脱水，透明，封片：不同浓度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片镜检。
52.子宫组织masson染色：
53.组织固定、脱水包埋、切片、脱蜡步骤同上。
54.苏木素核染液染色60s后冲洗。加入酸性品红染液染色后冲洗。
55.磷钼酸分色液分色，加入苯胺蓝复染液染色后，用无水乙醇冲洗，吹干封片镜检。
56.子宫组织免疫组织化学染色：
57.组织固定、脱水包埋、切片、脱蜡步骤同上。
58.抗原修复及非特异信号封闭：通过柠檬酸盐缓冲液(10mm；ph6.0)煮沸、3％过氧化氢孵育、5％山羊血清室温封闭进行抗原修复及非特异信号封闭。
59.抗体孵育：tbs洗涤三次后，添加相应抗体或同型对照抗体孵育，抗体信息见下表。
60.应用于ihc的抗体稀释比例货号anti-vim1:100ab92547,abcam,ca,usaanti-cd311:2000ab182981,abcam,ca,usa兔igg1:200碧云天，a7016，中国
61.二抗孵育与苏木素复染：tbs洗涤三次后，与相应的二抗孵育，并用苏木精复染色。
62.扫描电镜观察：
63.通过颈椎脱臼方法处死小鼠，取出小鼠子宫(步骤同上)，用锋利的手术刀片获取小鼠子宫内膜组织(组织块体积《3mm2),尽量避免挤压，将组织用pbs清洗1次后置于电镜固定液中室温固定2h，再转入4℃内保存。脱水冷冻干燥喷金后使用扫描电镜观察结果。
64.小鼠妊娠试验：
65.小鼠iua造模治疗12天后经腹腔注射10iu pmsg，48h后经腹腔注射hcg并与雄鼠按照1：1的比例进行交配。
66.次日检查阴道栓并将雌鼠与雄鼠分笼。阴道见栓日定义为day1,day10处死小鼠，暴露子宫，观察各组着床胚胎数。
67.图3表明：造模侧(iua组)约有80％子宫角由于输卵管内阻塞及内循环不畅而形成远端积水。
68.图4表明：与对照组(ctrl组)子宫比，ha染色显示造模侧(iua组)小鼠内膜厚度降低，masson染色显示胶原含量增加，ihc染色显示波形蛋白标记的间质细胞减少，ihc染色显示cd31标记的血管染色减少。
69.图5表明：造模后胞饮突的数量较对照组显著减少。
70.图6表明：与对照组相比，iua组小鼠妊娠子宫数显著减少，单侧妊娠数也显著减少。
71.宫腔粘连的动物模型治疗：麻醉后暴露双侧子宫(步骤同上)；双侧子宫角上缘剪口，使用金属刷(直径0.5-2cm)搔刮双侧；使用微量注射器经切口注射20μl pbs，右侧注射20μl脂肪脱细胞活性蛋白(含活性蛋白25μg)，给药一次，无重复给药；手术线缝合腹部，补充足够的饮水及食物供应。检测指标同上。
72.图7表明：cf治疗侧(iua+cf)约有40％子宫角由于输卵管内阻塞及内循环不畅而形成远端积水，显著低于造模未治疗侧(iua)。
73.图8表明：与iua未治疗组(iua组)子宫比，ha染色显示治疗组(iua+cf组)小鼠内膜
厚度增加，masson染色显示胶原含量减少，ihc染色显示波形蛋白标记的间质细胞数目增加，ihc染色显示cd31标记的血管染色强度增加。
74.图9表明：治疗后胞饮突的数量较造模未治疗组显著增加。
75.图10表明：与iua未治疗组相比，治疗组小鼠妊娠子宫数显著增加，单侧妊娠胚胎个数也显著增加。