具有改善菌群和黏膜修护的原籍菌与肽协同保健品及应用的制作方法

1.本发明涉及生物医药技术领域。更具体地说，本发明涉及一种具有改善菌群和黏膜修护的原籍菌与肽协同保健品及其制备方法和应用。


背景技术：

2.阴道微生态是由阴道解剖结构、菌群、机体内分泌系统及局部免疫调节构成的多层面防御系统。阴道菌群是该防御系统的关键组成部分，与其他部位微生物群有所不同，健康人的阴道微生物群的多样性越低，越有利于保持阴道健康状态。女性泌尿生殖道是一个较复杂的微生态体系。在环境、机体免疫等多种因素影响下，阴道内的微生态平衡很容易被打破，从而导致阴道内菌群失调，引起细菌性阴道病、滴虫阴道炎、需氧菌性阴道炎等多种生殖道疾病。
3.细菌性阴道病是目前女性生殖道感染的常见病、多发病，以阴道主要益生菌即乳杆菌减少，致病菌如加德纳菌、阿托波菌、普雷沃菌等过度繁殖为主要微生物特点的临床症候群。目前多个国家指南推荐细菌性阴道病的治疗方案首选为甲硝唑或克林霉素，但研究显示其治愈率仅有50％-80％，复发率高达40％-50％，且伴有严重副作用。抗生素的替代策略，益生菌制剂的使用能够有效的解决这一问题。如何提高益生菌制剂对于阴道菌群紊乱的治疗效果同时提高其阴道黏膜修护效果是目前急需解决的问题，进一步，在制备过程中由于菌种稳定性差，导致其存在如何在保证菌种活性的条件下，保证分散效果的问题。


技术实现要素：

4.本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
5.本发明还有一个目的是提供一种具有改善菌群和黏膜修护的原籍菌与肽协同保健品，具有治疗阴道菌群紊乱和修护阴道黏膜的作用。
6.本发明还有一个目的是提供一种具有改善菌群和黏膜修护的原籍菌与肽协同保健品的制备方法，在保证菌种和肽的活性的基础上，提高分散效果。
7.本发明还有一个目的是提供一种具有改善菌群和黏膜修护的原籍菌与肽协同保健品在制备用于治疗阴道菌群紊乱的保健品中的应用。
8.本发明还有一个目的是提供一种具有改善菌群和黏膜修护的原籍菌与肽协同保健品在制备用于修护阴道黏膜的保健品中的应用。
9.为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种具有改善菌群和黏膜修护的原籍菌与肽协同保健品的制备方法，包括以下步骤：s1、按重量份计，将10-15份壳聚糖、1-3份羧甲基纤维素分散到纯水中，而后加入1-3份海藻酸钠、20-35份木糖醇，搅拌均匀得混合料，混合料均质得基质混悬液；
10.s2、向基质混悬液中加入0.5-2.5份罗伊氏乳杆菌、0.5-2.5份青春双歧杆菌、1-2份长双歧杆菌、0.3-1.5份嗜热链球菌、0.2-1份鼠李糖杆菌、0.1-0.5份珍珠蛋白肽、0.1-0.5份胶原蛋白ⅲ型、0.1-0.3份弹性蛋白肽，而后在搅拌的条件下进行超声分散，得益生菌
与肽混悬液，其中，超声频率为25-30khz，振幅为20％-30％，时间为25-27min；
11.s3、将益生菌与肽混悬液加入2-5份卡波姆制备成凝胶制剂。
12.优选的是，步骤s1中均质条件为：物料温度24～26℃、物料流量50-100ml/min，均质压力500～1500bar。
13.优选的是，步骤s2中超声频率为30khz，振幅为30％。
14.具有改善菌群和黏膜修护的原籍菌与肽协同保健品。
15.具有改善菌群和黏膜修护的原籍菌与肽协同保健品在制备用于治疗阴道菌群紊乱的保健品中的应用。
16.具有改善菌群和黏膜修护的原籍菌与肽协同保健品在制备用于修护阴道黏膜的保健品中的应用。
17.本发明至少包括以下有益效果：
18.以原籍菌配合肽协同配合作用，具有治疗阴道菌群紊乱和修护阴道黏膜的作用，提高阴道益生菌数量，减少有害菌数量，毒性较低，且依从性好；
19.辅料中：首先以壳聚糖、羧甲基纤维素配合海藻酸钠作为载体，提高对益生菌与肽的负载量同时，利于益生菌和肽的分散；其次，先将壳聚糖、羧甲基纤维素配合海藻酸钠搅拌、均质制得混悬液，而后在温和条件下混入益生菌和肽，满足分散效果的同时，不影响益生菌和肽的活性；进一步，壳聚糖、羧甲基纤维素配合海藻酸钠作为载体，配合卡波姆，形成对益生菌和肽较优的包裹效果，同时促进凝胶制剂与阴道黏膜的粘着性。
20.本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
21.图1为本发明的其中一种技术方案所述模型组和治疗组的菌群组成主成分分析图；
22.图2为本发明的其中一种技术方案所述模型组和治疗组样本与物中共线性关系图。
具体实施方式
23.下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
24.《实施例1》
25.具有改善菌群和黏膜修护的原籍菌与肽协同保健品的制备方法，包括以下步骤：
26.s1、按重量份计，将12份的壳聚糖、2份羧甲基纤维素分散到43份纯水中，而后加入2份海藻酸钠、30份木糖醇，搅拌均匀得混合料，混合料均质得基质混悬液，其中，步骤s1中均质条件为：物料温度控制在24～26℃范围内、物料流量80ml/min，均质压力1200bar；
27.s2、向基质混悬液中加入1.5份罗伊氏乳杆菌、1.5份青春双歧杆菌、1.5份长双歧杆菌、0.9份嗜热链球菌、0.6份鼠李糖杆菌、0.3份珍珠蛋白肽、0.3份胶原蛋白ⅲ型、0.2份弹性蛋白肽，而后在搅拌的条件下进行超声分散，得益生菌与肽混悬液，其中，超声频率为30khz，振幅为30％，超声25min；
28.s3、将益生菌与肽混悬液加入4份卡波姆，控制转速为350r/min搅拌15min，而后加入三乙醇胺调节后制备成凝胶制剂；
29.在上述实施例中，壳聚糖(单元体的分子量为：161.2，脱乙酰度89％)；珍珠蛋白肽，又名珍珠肽。
30.《实施例2》
31.具有改善菌群和黏膜修护的原籍菌与肽协同保健品的制备方法，包括以下步骤：
32.s1、按重量份计，将10份壳聚糖、1份羧甲基纤维素分散到28份纯水中，而后加入1份海藻酸钠、20份木糖醇，搅拌均匀得混合料，混合料均质得基质混悬液，其中，步骤s1中均质条件为：物料温度24～26℃范围、物料流量50ml/min，均质压力500bar；
33.s2、向基质混悬液中加入0.5份罗伊氏乳杆菌、0.5份青春双歧杆菌、1份长双歧杆菌、0.3份嗜热链球菌、0.2份鼠李糖杆菌、0.1份珍珠蛋白肽、0.1份胶原蛋白ⅲ型、0.1份弹性蛋白肽，而后在搅拌的条件下进行超声分散，得益生菌与肽混悬液，其中，超声频率为25khz，振幅为30％，超声27min；
34.s3、将益生菌与肽混悬液加入2份卡波姆，控制转速为350r/min搅拌15min，而后加入三乙醇胺调节后制备成凝胶制剂。
35.《实施例3》
36.具有改善菌群和黏膜修护的原籍菌与肽协同保健品的制备方法，包括以下步骤：
37.s1、按重量份计，将15份壳聚糖、3份羧甲基纤维素分散到54份纯水中，而后加入3份海藻酸钠、35份木糖醇，搅拌均匀得混合料，混合料均质得基质混悬液，其中，步骤s1中均质条件为：物料温度24～26℃范围内、物料流量100ml/min，均质压力1500bar；
38.s2、向基质混悬液中加入2.5份罗伊氏乳杆菌、2.5份青春双歧杆菌、2份长双歧杆菌、1.5份嗜热链球菌、1份鼠李糖杆菌、0.5份珍珠蛋白肽、0.5份胶原蛋白ⅲ型、0.3份弹性蛋白肽，而后在搅拌的条件下进行超声分散，得益生菌与肽混悬液，其中，超声频率为30khz，振幅为20％，超声30min；
39.s3、将益生菌与肽混悬液加入5份卡波姆，控制转速为350r/min搅拌15min，而后加入三乙醇胺调节后制备成凝胶制剂。
40.《对比例1》
41.具有改善菌群和黏膜修护的原籍菌与肽协同保健品的制备方法，包括以下步骤：
42.s1、按重量份计，将12份壳聚糖分散到43份纯水中，而后加入30份木糖醇，搅拌均匀得混合料，混合料均质得基质混悬液，其中，步骤s1中均质条件为：物料温度24～26℃、物料流量50-100ml/min，均质压力500～1500bar；
43.s2、同实施例1；
44.s3、同实施例1。
45.实验
46.1、测定实施例1、对比例1制备得到的益生菌与肽混悬液的粒径分布、平均粒径，具体如下表1所示：
47.表1益生菌与肽混悬液的平均粒径和粒径分布
[0048] 平均粒径nm粒径分布pdi实施例15630.15
对比例19280.26
[0049]
由表1可知，实施例1制得的益生菌与肽混悬液的平均粒径小于对比例1制得的益生菌与肽混悬液的平均粒径，其主要原因在于实施例1还包括羧甲基纤维素、海藻酸，两者能够配合壳聚糖作为载体，提高对益生菌与肽的负载量同时，利于益生菌和肽的分散。
[0050]
2、动物实验研究
[0051]
实验对象：健康spf级sd大鼠，雄性，体重160
±
10g，昼夜周期12h/12h，室温22
±
1℃，饮食自由，适应环境3天。
[0052]
一、建立抗生素引起的菌群紊乱模型
[0053]
取实验对象，每只分别通过以抗生素药液连续灌胃21天建立抗生素引起的菌群紊乱模型，得菌群紊乱模型大鼠，其中，所述抗生素溶液为亚胺培南-西司他丁钠(泰能)配制得到浓度为10mg/ml的药液，以生理盐水为溶剂，每天给一只大鼠灌喂一次抗生素药液0.5ml/100g。
[0054]
二、菌群紊乱模型的体外培养和复合益生菌培养
[0055]
取3只菌群紊乱模型大鼠的粪便分别用10倍量的无菌pbs缓冲液进行涡旋混悬(即100mg：1000μl)，两层纱布过滤，滤液以2000rpm离心10min，取上清液，得3份粪便混悬液。
[0056]
分别取粪便混悬液3ml/份，分别添加至30ml的bif培养基中，于37℃条件下厌氧培养9h，之后加入550μl的实施例1制备的益生菌与肽混悬液，培养至24h后，分别取菌液作为治疗组；
[0057]
分别取粪便混悬液3ml/份作为空白对照，分别添加至30ml的bif培养基中，于37℃条件下厌氧培养24h后，取菌液作为模型组。
[0058]
三、微生物多样性评估
[0059]
使用16s rrna宏基因组测序分析技术对模型组和治疗组的菌群进行微生物多样性评估；
[0060]
3.1、每组进行3次测定，对测得的结果进行筛选，得到11个优势菌属，并将模型组中11个优势菌属相对治疗组中的对应11个优势菌属的相对丰度进行显著性分析，结果见表1；
[0061]
表1.对大鼠菌群中优势菌属的影响及变化趋势(单位：相对丰度)
[0062]
菌属名称模型组治疗组模型组vs治疗组g__escherichia-shigella32.9200
±
9.7323.3500
±
1.9
↓
g__lactobacillus21.0000
±
14.8024.8100
±
19.49
↑
g__proteus10.3600
±
13.1318.5900
±
14.14
↑
g__streptococcus8.9530
±
4.9912.2100
±
10.11
↓
g__acinetobacter9.5160
±
5.157.2500
±
5.64
↑
g__bacillus4.6340
±
7.385.6260
±
4.88
↑
g__enterococcus2.2680
±
0.934.9750
±
0.87
↓
*
g__morganella2.9200
±
0.642.1720
±
1.15
↓
g__bacteroides3.0950
±
0.400.1820
±
0.07
↓
***
g__lysinibacillus2.1300
±
2.030.1388
±
0.19
↓
g__parabacteroides1.6020
±
0.860.1014
±
0.13
↓
*
[0063]
从表1中可知，相比于治疗组，模型组的优势菌属中g__lactobacillus(乳酸杆菌属)、g__proteus(变形杆菌属)、g__acinetobacter(不动杆菌属)、g__bacillus(芽孢杆菌属)的数量增多了；
[0064]
而g__morganella(摩氏摩根氏菌属)、g__lysinibacillus(赖氨酸芽孢杆菌属)、g__escherichia-shigella(埃希氏-志贺氏菌属)、g__streptococcus(链球菌属)、g__enterococcus(肠球菌属)、g__bacteroides(拟杆菌属)、g__parabacteroides(类芽胞杆菌属)的数量减少了，其中后三种菌属数量的减少是有显著性差异的。结果证明，益生菌与肽协同作用可以调节菌群结构，可以降低有害菌的数量、相对提高有益菌数量，具有改善菌群紊乱的作用。
[0065]
3.2、将序列相似度大于97％的小组归为一个otu(operational taxonomic units，操作分类单元)，对模型组(model)和治疗组(treatment)的菌群otu数据进行基于欧式距离算法的主成分分析(pca)，具体如图1所示，根据图1可知，模型组和治疗组两组样本无重叠且距离较远，说明本技术的凝胶制剂对菌群紊乱有治疗作用。
[0066]
3.3、对模型组(model)和治疗组(treatment)，基于otu数据构建样本与菌群共线性关系图，如图2所示，图中由外至内分为第一、第二、第三圈，其中，第一圈的左半部分代表样本分组，包括模型组(model)和治疗组(treatment)，右半部分代表优势菌属；第二圈的依据灰度不同代表各个分组中的优势菌属，长度代表丰度比例，右半部分的每种灰度代表右半圈的每种灰度代表每个菌属所在的样本分组，长度代表该菌门在对应分组中的丰度比例；第三圈包含圈内的灰色条带，它一端连接左半圈样本，端点宽度代表该菌属在样本中的丰度，另一端连接右半圈菌门，端点宽度代表该样本在对应菌门中的分布情况；依据图2结果分析可知治疗组相较于模型组，菌群数量较少，且治疗组和模型组密度较大的优势菌群结构发生了替换，即经本技术凝胶制剂治疗后菌群种类数量发生了明显改变，提示本技术凝胶制剂能有效改善菌群紊乱，提高有益菌数量和减少有害菌数量。
[0067]
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。