一种含有间充质干细胞及血小板裂解液的阴道复合凝胶及其制备方法与流程

1.本发明属于药物制备技术领域，尤其涉及一种含有间充质干细胞及血小板裂解液的阴道复合凝胶及其制备方法。


背景技术：

2.女性在进入绝经期后常常会出现相应的生理和心理变化，与生理症状紧密相连的改变主要有泌尿生殖道症状、血管舒缩症状、骨质疏松、精神神经症状、代谢异常和心血管疾病。萎缩性阴道炎是绝经期女性容易患的疾病之一，它常见于自然绝经及卵巢去势后妇女，其主要病理改变是雌激素减少导致的阴道鳞状上皮萎缩，并且常伴随糖原减少和阴道内ph值增高。变薄的上皮对阴道内菌群变化的抵抗力下降，使得致病菌容易侵犯阴道导致炎症的发生，常见的致病菌包括：链球菌、葡萄球菌、大肠杆菌等。大多数患者发病没有症状，但主要发病症状是阴道少量流血、瘙痒、排尿困难或性交困难。阴道萎缩的表现为黏膜苍白、瘀斑及皱襞消失。镜下可见表层及中间层细胞不同程度的减少或消失。伴急性炎症及和肉芽组织构成的小溃疡散在分布在完好的上皮中，也可见粘膜下层淋巴细胞及浆细胞浸润。
3.目前对与萎缩性阴道炎的治疗根据病情的严重程度分为激素治疗和非激素治疗。激素治疗主要是通过补充雌激素的方式来弥补卵巢功能减退导致的雌激素减少。根据用药方式可以分为全身激素治疗和局部激素治疗，因为全身激素的使用会导致激素相关肿瘤发生几率增加，因此一般在无明显禁忌症的时候通常采用局部激素治疗，即阴道雌激素治疗。阴道雌激素治疗可以有效对的缓解阴道萎缩等症状，但是有研究也表明局部激素的治疗也会可能导致肿瘤、脑卒中和静脉栓塞的风险，因此有相关风险的患者禁用激素治疗。
4.间充质干细胞可以通过分泌蛋白质和激素的旁分泌活动，或者通过隧道纳米管或微泡传递线粒体，以及通过含有核酸的外泌体或微泡的方式参与组织修复过程。间充质干细胞作为细胞因子的丰富来源，研究以证明其可以分泌fgf2、igf-1、hgf、vegf、pdgf等在内的多种细胞因子。而这些细胞因子在组织修复中都起到了重要作用。
5.在免疫调节方面，间充质干细胞可以抑制t细胞的增殖和分泌il-2来调节免疫活性，同时还可以通过激活fas-fasl配体轴来诱导炎性t细胞凋亡，单核细胞趋化蛋白-1是间充质干细胞向外界分泌一种重要的细胞因子，通过该细胞因子可以刺激t细胞定向迁移，当炎性t细胞凋亡后，其细胞碎片被吞噬细胞所吞噬，并刺激吞噬细胞向周围环境分泌tgfβ，而这一过程可以导致间充质干细胞所诱导的t细胞转变为促进全身免疫耐受的treg细胞。
6.血小板裂解液是一种含有生长因子、蛋白质、细胞因子和与关键愈合过程有关的趋化因子的饱和溶液，用于治疗各种疾病，如脱发、口腔粘膜炎、根性疼痛、骨关节炎、软骨和肌腱疾病。目前未见在阴道凝胶产品中应用。


技术实现要素：

7.本发明实施例提供一种含有间充质干细胞及血小板裂解液的阴道复合凝胶及其制备方法，旨在解决有效改善阴道组织的萎缩现象的药剂凝胶缺乏的问题。
8.本发明实施例是这样实现的：
9.一种含有间充质干细胞及血小板裂解液的阴道复合凝胶的制备方法，具体包括以下步骤：
10.1)称取0.05g-0.1g的凝胶剂，使用10ml pbs缓冲液(phosphate buffered saline，磷酸缓冲盐溶液)溶解混匀，于37℃条件下振荡混匀过夜，获得第一凝胶；
11.2)将步骤1)获得的第一凝胶与血小板裂解液按(8-9.9):(0.1-2)的比例混合；
12.3)待凝胶剂全部溶解后调节ph至7；
13.4)选取间充质干细胞，使用trypletmexpress酶进行消化，pbs清洗，台盼蓝计数；
14.5)使用配好的凝胶调整间充质干细胞密度为10
6-107/ml，获得含有间充质干细胞及血小板裂解液的阴道复合凝胶。
15.步骤1)中所述凝胶剂为卡波姆、海藻酸钠、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、黄原胶、卡拉胶、瓜尔胶中的任意一种或几种的混合物；优选地，所述凝胶剂为卡波姆。
16.步骤2)中所述第一凝胶与血小板裂解液优选的混合比例为9:1。
17.步骤3)中所述调节ph优选采用三乙醇胺、氢氧化钠、或盐酸中的一种。
18.步骤4)中所述间充质干细胞，为羊膜间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞的任意一种或几种的混合物；优选地间充质干细胞为羊膜间充质干细胞。
19.作为优选的实施方式，所述间充质干细胞，选用对数生长期的间充质干细胞。进一步地，所述间充质干细胞为对数生长期的羊膜间充质干细胞。
20.上述的羊膜间充质干细胞的分离与培养，具体步骤如下：
21.取产妇剖宫产后的羊膜，使用含有1％双抗的dpbs清洗羊膜，去除凝固的血块和多余组织；将羊膜剪碎，加入0.5％的胰酶于37℃条件下振荡消化1h，随后将消化后的组织通过200目的筛网过滤，使用含有1％双抗的dpbs充分清洗，随后将组织碎片收集，使用1mg/ml的胶原酶i于37℃条件下振荡消化1h；将消化后的组织于200目筛网过滤，取滤过液，于1500rpm/min条件下离心5min，收集细胞沉淀；将细胞沉淀使用dmem/f12培养基重悬，培养于37℃5％co2细胞培养箱中；定期给羊膜间充干细胞换液，获得羊膜间充质干细胞。
22.所述含有1％双抗的dpbs为dpbs溶液中含有青霉素100u/ml，链霉素0.1mg/ml。
23.一种含有间充质干细胞及血小板裂解液的阴道复合凝胶由上述制备方法获得。
24.本发明的含有间充质干细胞及血小板裂解液的阴道复合凝胶，是通过提取间充质干细胞和血小板裂解液使用凝胶剂制成外泌体凝胶，该凝胶无刺激性气味呈粘稠状，并且具有很好的水溶性和粘附性，可以很好的吸附于女性阴道内，并且该凝胶ph值为中性，在阴道酸性环境下该凝胶粘稠度缓慢下降，逐渐释放所包被的物质并覆盖受损阴道组织。使用时将凝胶挤入阴道深处，覆盖在子宫颈或者苍穹部位，通过凝胶的附着间充质干细胞可以局部不断释放多种细胞因子，并随着凝胶的溶解，间充质干细胞可以到达阴道黏膜层表面，通过与阴道黏膜上皮细胞的接触促进其生长。通过间充质干细胞的旁分泌作用于受损的阴
道上皮，促进上皮细胞的修复，从而对阴道炎症进行有效控制和治疗，通过凝胶附着于病变部位，从而达到保护创面的作用。通过间充质干细胞、血小板裂解液和凝胶的联合作用，提升病变部位阴道上皮对病原微生物的抵抗力，修复受损阴道上皮，恢复阴道微环境的稳态，从而达到治疗女性阴道炎、宫颈糜烂，修复受损阴道的作用。
25.本发明的技术方案与现有技术对比如下：
26.1.现有技术发明专利申请说明书cn202111011722.3,一种用于促进外伤愈合的间充质干细胞外用凝胶、给药方式和应用。通过对比该发现，本发明优势在于，通过向凝胶添加了血小板裂解液，该裂解液可以起到促进组织修复的同时，还可以维持凝胶中间充质干细胞的存活，促进间充质干细胞在局部不断释放细胞因子。
27.2.现有技术发明专利申请说明书cn202111135546.4，一种脐带干细胞来源外泌体的提取及水凝胶的制备方法。与该专利相比，本发明优势在于，外泌体是间充质干细胞向外分泌的一种细胞囊泡，但是同时间充质干细胞还可以向外界分泌多种细胞因子起到促进组织修复作用，通过凝胶包被间充质干细胞应用于局部，可以为局部损伤提供持续的细胞因子。
28.本发明的技术方案与现有技术相比具有以下有益效果：
29.本发明的含有间充质干细胞及血小板裂解液的阴道复合凝胶，通过将血小板裂解液与(羊膜)间充质干细胞凝胶进行复合，可以增加(羊膜)间充质干细胞在凝胶中的存活时间，同时血小板裂解液自身所含有的细胞因子可以有效促进损伤组织的修复。本发明专利通过使用凝胶剂复合间充质干细胞通过添加血小板裂解液有效提升了羊膜间充质干细胞的存活时间，并且在应用于萎缩性阴道炎的治疗中，可以有效改善阴道组织的萎缩现象。
附图说明
30.图1是本发明实施例1使用流式细胞仪对羊膜间充质干细胞表面标记进行鉴定的鉴定结果图。
31.图2是本发明实施例1的羊膜间充质干细胞成脂肪分化结果图；其中，左：成脂分化培养基；右：完全培养基。
32.图3是本发明实施例1的羊膜间充质干细胞成骨分化结果图；其中，左：成骨分化培养基；右：完全培养基。
33.图4是本发明实施例1的羊膜间充质干细胞成软骨分化结果图；其中，左：成软骨分化培养基；右：完全培养基。
34.图5是本发明实施例1的复合凝胶和卡波姆凝胶进行台盼蓝计数细胞统计结果图。
35.图6是本发明实施例1的各类阴道凝胶对阴道萎缩大鼠的治疗效果图。
具体实施方式
36.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。另外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法
实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。
37.目前，存在有效改善阴道组织的萎缩现象的药剂凝胶缺乏的问题。为了解决上述技术问题，本发明提出了一种含有间充质干细胞及血小板裂解液的阴道复合凝胶及其制备方法。
38.实施例1
39.1.人羊膜间充质干细胞的分离与培养：
40.取产妇剖宫产后的羊膜，使用还有1％双抗的dpbs(dpbs溶液中含有青霉素100u/ml，链霉素0.1mg/ml)清洗羊膜，并使用组织剪和镊子去除凝固的血块和多余组织；将羊膜通过组织剪剪碎，加入0.5％的胰酶于37℃条件下振荡消化1h，随后将消化后的组织通过200目的筛网过滤，使用含有1％双抗的dpbs充分清洗，随后将组织碎片收集，使用1mg/ml的胶原酶i于37℃条件下振荡消化1h；将消化后的组织于200目筛网过滤，取滤过液，于1500rpm/min条件下离心5min，收集细胞沉淀；将细胞沉淀使用dmem/f12培养基重悬，培养于37℃5％co2细胞培养箱中；定期给羊膜间充干细胞换液。
41.2.羊膜间充质干细胞鉴定：
42.通过流式细胞术对羊膜间充质干细胞表面标记进行鉴定，通过三系分化对羊膜间充质干细胞分化能力进行鉴定，通过显微镜观察对羊膜间充质干细胞形态进行鉴定。
43.3.含有间充质干细胞及血小板裂解液的阴道复合凝胶的制备：
44.1)称取0.05g卡波姆，使用10ml pbs溶解混匀，于37℃条件下振荡混匀过夜，获得卡波姆第一凝胶；
45.2)将卡波姆第一凝胶与血小板裂解液按9:1的比例混合；
46.3)卡波姆全部溶解后使用三乙醇胺调节ph至7；
47.4)选取对数生长期的羊膜间充质干细胞，使用tryple
tm express酶进行消化，pbs清洗，台盼蓝计数；
48.5)使用配好的卡波姆凝胶调整细胞密度为10
6-107/ml，获得含有间充质干细胞及血小板裂解液的阴道复合凝胶。
49.4.羊膜间充质干细胞的表面标记物鉴定：
50.1、取生长良好的羊膜间充质干细胞，使用tryple
tm express酶进行消化，使用pbs清洗3遍，吸取适量细胞悬液，随后吸取相同量的台盼蓝，混匀，计数，调整密度为107/ml；
51.2、使用bd
tm accutase
tm cell detachment solution细胞分离溶液对细胞进行清洗，随后在bd pharmingen中以1x107个细胞/ml的浓度重新悬浮；
52.3、使用流式细胞仪对羊膜间充质干细胞表面标记进行鉴定其鉴定结果如下：使用流式细胞术鉴定羊膜间充质干细胞表面标志，其结果如图1所示。cd90、cd105、cd73、cd44呈阳性表达，而cd34、cd11b、cd19、cd45、hla-dr呈阴性表达。
53.5.羊膜间充质干细胞的三系分化：
54.1)取生长良好的羊膜间充质干细胞，使用tryple
tm express酶进行消化，pbs清洗3遍，吸取适量细胞悬液，随后吸取相同量的台盼蓝，混匀，计数，调整密度为105/ml；
55.2)取24孔板，吸取混匀后的羊膜间充质干细胞悬液0.5ml至每个鉴定孔内，于37℃、5％co2培养箱内培养；
56.3)羊膜间充质干细胞汇合度达到70％左右开始诱导，间充质干细胞分化培养基按
说明书进行配制；弃去实验孔中培养基，添加0.5ml分化培养基至实验孔内，对照组中添加完全培养基，将24孔板转至37℃、5％co2培养箱内；
57.4)每隔3天实验孔更换1次新鲜分化培养基，对照孔更换新鲜完全培养基；
58.5)对分化的间充质干细胞进行染色，于显微镜下观察结果。
59.6.羊膜间充质干细胞成脂肪分化：
60.羊膜间充质干细胞通过成脂肪分化培养基诱导分化后，其分化结果如图2所示，在成脂肪诱导分化培养基中，细胞形成脂滴大约需要21天，但是其脂滴以微小脂滴为主，在油红o染色后，其脂滴呈现为橘红色(图2左)。而对照组(图2右)中，羊膜间充质干细胞中未见到脂滴。
61.7.羊膜间充质干细胞成骨分化：
62.羊膜间充质干细胞通过成骨分化培养基诱导分化后，其分化结果如图3所示，羊膜间充质干细胞出现明显的骨组织沉淀大约需要21天，在诱导过程中(图3左，可见有颗粒状沉淀，并随着诱导时间其颗粒状沉淀会变为块状，在茜素红s染色下，其沉淀会变成橘红色块状。在对照组中(图3右)，相同染色条件未见橘红色块状沉淀。
63.8.羊膜间充质干细胞成软骨分化：
64.羊膜间充质干细胞通过成软骨分化培养基诱导分化后，其分化结果如图4所示，分化过程中，羊膜间充质干细胞的生长会出现定向迁移的现象，随着诱导时间的延长，细胞之间会形成细胞团(图4左)，在生成细胞团后如果进行一步培养，细胞团会脱离培养皿，在培养基中成悬浮生长。而在对照组中(图4右)，通过msc-t4人类间充质干细胞无血清培养基+10％ultragrotm-advanced+青霉素-链霉素(青霉素浓度为100u/ml,链霉素浓度为0.1mg/ml)的培养，细胞不会发生成团现象。
65.9.羊膜间充质干细胞在血小板裂解液凝胶中存活时间测定：
66.(1)称取0.05g卡波姆，使用10ml pbs溶解混匀，于37℃条件下振荡混匀过夜，使用三乙醇胺调节ph到7；配置成单纯的卡波姆凝胶；
67.(2)称取0.05g卡波姆，使用10ml pbs溶解混匀，于37℃条件下振荡混匀过夜，卡波姆凝胶与血小板裂解液按9:1的比例混合；卡波姆全部溶解后使用三乙醇胺调节ph至7，配置成含有血小板裂解液的卡波姆凝胶；；
68.(3)分别使用两种凝胶混匀羊膜间充质干细胞至细胞密度为106/ml；
69.(4)将两种间充质干细胞凝胶分别接种于12孔板中，每孔接种1ml；于细胞培养箱中培养24小时；
70.(5)通过台盼蓝计数细胞；
71.(6)如图5结果显示，通过添加血小板裂解液可以有效促进凝胶中细胞的存活。其中，步骤(2)中获得的凝胶为复合凝胶；步骤(1)中获得的凝胶为卡波姆凝胶。
72.10.羊膜间充质干细胞对阴道上皮的修复作用：
73.1)通过对大鼠进行去势手术，建立萎缩性阴道炎模型；
74.2)通过羊膜间充质干细胞凝胶与卡波姆凝胶和羊膜间充质干细胞上清液凝胶进行对比，观察羊膜间充质干细胞凝胶治疗萎缩性阴道炎的疗效；
75.3)其中将萎缩性阴道炎大鼠分为4组，其中a组使用羊膜间充质干细胞血小板裂解液凝胶；b组使用血小板裂解液液凝胶；c组使用单纯的卡波姆凝胶；d组不做处理；选取没有
做去势手术的正常大鼠作为空白对照。
76.4)其羊膜间充质干细胞对阴道萎缩大鼠的治疗作用如图6所示，其中图6中1为羊膜间充质干细胞血小板裂解液凝胶组；图6中2为血小板裂解液液凝胶凝胶组；图6中3为卡波姆凝胶组；图6中4为去势组；图6中5为未做去势手术的空白对照组。羊膜间充质干细胞血小板裂解液凝胶组、血小板裂解液液凝胶组相对于单纯去势组，其阴道上皮厚度都出现了增厚。而在这三组中，羊膜间充质干细胞血小板裂解液凝胶组治疗后阴道上皮厚度最大。
77.本发明的技术方案与现有技术对比如下：
78.1.现有技术发明专利申请说明书cn202111011722.3,一种用于促进外伤愈合的间充质干细胞外用凝胶、给药方式和应用。通过对比该发现，本发明优势在于，通过向凝胶添加了血小板裂解液，该裂解液可以起到促进组织修复的同时，还可以维持凝胶中间充质干细胞的存活，促进间充质干细胞在局部不断释放细胞因子。
79.2.现有技术发明专利申请说明书cn202111135546.4，一种脐带干细胞来源外泌体的提取及水凝胶的制备方法。与该专利相比，本发明优势在于，外泌体是间充质干细胞向外分泌的一种细胞囊泡，但是同时间充质干细胞还可以向外界分泌多种细胞因子起到促进组织修复作用，通过凝胶包被间充质干细胞应用于局部，可以为局部损伤提供持续的细胞因子。
80.实施例2
81.1.脂肪间充质干细胞的培养：
82.取生长良好的脂肪间充质干细胞待生长丰度达到80％去除细胞培养基，加入新鲜的完全培养基，培养细胞24-48h,收集间充质干细胞；本实施例通过采用脂肪间充质干细胞替换实施例1中的羊膜间充质干细胞，制备获得含有间充质干细胞及血小板裂解液的阴道复合凝胶。
83.实施例3
84.按实施例1收集羊膜间充质干细胞；
85.3.含有间充质干细胞及血小板裂解液的阴道复合凝胶的制备：
86.1)称取0.1g卡波姆，使用10ml pbs溶解混匀，于37℃条件下振荡混匀过夜，获得卡波姆第一凝胶；
87.2)将卡波姆第一凝胶与血小板裂解液按9:1的比例混合；
88.3)卡波姆全部溶解后使用氢氧化钠调节ph至7；
89.4)选取对数生长期的羊膜间充质干细胞，使用tryple
tm express酶进行消化，pbs清洗，台盼蓝计数；
90.5)使用配好的卡波姆凝胶调整细胞密度为10
6-107/ml，获得含有间充质干细胞及血小板裂解液的阴道复合凝胶。
91.其他的制备检测步骤同实施例1。
92.实施例4：
93.按实施例1收集羊膜间充质干细胞；
94.3.含有间充质干细胞及血小板裂解液的阴道复合凝胶的制备：
95.1)称取0.05g海藻酸钠，使用10ml pbs溶解混匀，于37℃条件下振荡混匀过夜，获得海藻酸钠第一凝胶；
96.2)将海藻酸钠第一凝胶与血小板裂解液按9:1的比例混合；
97.3)海藻酸钠全部溶解后使用盐酸调节ph至7；
98.4)选取对数生长期的羊膜间充质干细胞，使用tryple
tm express酶进行消化，pbs清洗，台盼蓝计数；
99.5)使用配好的海藻酸钠凝胶调整细胞密度为10
6-107/ml，获得含有间充质干细胞及血小板裂解液的阴道复合凝胶。
100.其他的制备检测步骤同实施例1。
101.本发明的技术方案与现有技术相比具有以下有益效果：
102.本发明的含有间充质干细胞及血小板裂解液的阴道复合凝胶，通过将血小板裂解液与(羊膜)间充质干细胞凝胶进行复合，可以增加(羊膜)间充质干细胞在凝胶中的存活时间，同时血小板裂解液自身所含有的细胞因子可以有效促进损伤组织的修复。本发明专利通过使用凝胶剂复合间充质干细胞通过添加血小板裂解液有效提升了羊膜间充质干细胞的存活时间，并且在应用于萎缩性阴道炎的治疗中，可以有效改善阴道组织的萎缩现象。
103.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。