一种碲化铋纳米片水凝胶组合药剂及其制备方法和应用

1.本发明涉及生物医学技术领域，具体而言，涉及一种基于光热-热释电疗法协同的碲化铋纳米片水凝胶组合药剂及其制备方法和在肿瘤治疗中的应用。


背景技术：

2.癌症是临床医学的重大疾病，严重危害人类健康，阻碍社会发展。癌症导致巨大的疾病负担，不仅是全球主要死因之一，也是阻碍人类期望寿命延长的重要因素。
3.黑色素瘤是人类常见的恶性肿瘤之一，恶性黑色素瘤的患病率很高。它占皮肤癌发病率的4％，但占皮肤癌死亡率的79％。对于皮肤癌的临床治疗，手术切除和放/化疗仍然是重要的方法。手术会带来的大面积皮肤缺损，另一方面手术虽然能够清除绝大部分可见的肿瘤组织，但术后残留的肿瘤细胞会导致高复发率；放/化疗存在较高的毒副作用，例如在黑色素瘤化疗中，口服和注射是常见的给药途径，这种全身给药方法会引起严重的药物不良反应包括心脏毒性和神经毒性。以上治疗手段都严重限制了黑色素瘤的治疗效果。
4.科研工作者提出的另一种新的治疗策略是将药物直接注入肿瘤，一种称为“肿瘤内”或“病灶内”治疗的药物递送策略。黑色素瘤病变通常是皮肤性的，有皮肤/皮下扩散的倾向，这为直接注射在肿瘤部位提供了机会。这种给药途径可以增加局部药物浓度，刺激局部免疫反应，并减少全身性毒性。瘤内治疗有可能诱发全身免疫反应，使注射和未注射的病变都发生消退。因此，选择有效的策略来进行肿瘤局部给药，降低治疗中严重毒性、副作用以及肿瘤复发率具有重要意义。
5.近年来，光热治疗(ptt)作为一种传统的癌症治疗方法因其具有疗效明显、毒副作用小、时空选择性等特点，而备受关注。但热休克蛋白(hsps)可以使癌细胞抵抗热诱导的细胞凋亡，严重降低了ptt的治疗效果。另外光热剂在传统的尾静脉注射治疗中，在肿瘤部位的累积浓度低，会极大削弱了肿瘤部位的光热治疗效果。受光穿透深度限制，大多数近红外一区(nir-1)感光水凝胶药物系统的治疗效果均不理想，波长范围为1000-1350nm的近红外生物窗口ii(nir-ii)由于发射波长更长，具有更大皮肤可承受光暴露能量上限，也可显著降低光在穿透生物组织时光散射及自荧光效应的影响，使探测深度更深、空间分辨率更高。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提出一种用于光热-热释电疗法协同抗肿瘤的原位交联水凝胶组合药剂及其制备方法和其在肿瘤治疗材料中的应用，以解决上述背景技术提出的问题，该组合药剂在肿瘤部位原位交联形成水凝胶，可以用于攻击hsps和具有nir-ii光热响应性。
7.第一方面，本发明提供了一种可注射的热释电碲化铋纳米片水凝胶组合药剂，所述可注射的组合药剂包括药液a和能够促使药液a原位交联的药液b；所述药液a为碲化铋纳米片和海藻酸钠的复合溶液；所述药液b为包含钙离子(ca
2+
)的水溶液；所述药液a包括：碲化铋纳米片、以及分散在碲化铋纳米片溶液的海藻酸钠，该复合溶液可以与钙离子快速简单的交联形成水凝胶。
8.本公开中，首次将碲化铋纳米片作为热释电催化剂在近红外光激发(nir-ii)下用于肿瘤光热-热释电疗法的协同治疗。碲化铋纳米片具有优异的光热转换性能，可以通过热疗消除癌细胞。此外，在nir-ii激光条件下碲化铋纳米片的热释电转换是碲化铋纳米片光热和冷却过程中产生的温差会引起的电荷分离和随后在热释电材料内部产生的电压引发自由基(ros)的产生，产生的ros攻击hsps和癌细胞。
9.相比与商业化块状的碲化铋，本发明所采用纳米级别的碲化铋纳米片具有更大的比表面积，提供丰富的催化位点，同时超薄的结构可以使热载流子从内部迁移到表面，缩短电荷转移距离，提高催化性能。以上说明通过碲化铋纳米片可以吸收大量1064nm近红外光，能高效地将光能转变为热能，将热能集中在肿瘤位点，并产生大量的自由基，有效地将肿瘤细胞杀死。
10.在一具体实施方案中，所述碲化铋纳米片的粒径优选为≤1μm，最优选为≤500nm。
11.在一具体实施方案中，所述碲化铋纳米片的制备方法为：所述碲化铋纳米片的制备方法为：将三氯化铋(bicl3)、亚碲酸钾(k2teo3)、氢氧化钠(naoh)、聚乙烯吡咯烷酮(pvp)和乙二醇(eg)按比例添加到高压釜中，磁力搅拌1～3小时；然后将所得均匀混合物在180℃下加热6小时，然后冷却至室内温度，通过离心收集所得产物碲化铋纳米片。
12.在一具体实施方案中，所述药液a中碲化铋纳米片的浓度为50～2000μg/ml，优选为50～800μg/ml，进一步优选为50～300μg/ml。
13.在一具体实施方案中，所述药液a中海藻酸钠的浓度为5～20μg/ml，当药液a中海藻酸钠的浓度过低难以成型，无法形成足够的水凝胶负载药液中纳米片水凝胶，当浓度过高时则药液a的粘度增大不利于药液a的注射。
14.在一具体实施方案中，所述药液b为氯化钙水溶液，氯化钙的浓度为5～40μg/ml。
15.在一具体实施方案中，所述碲化铋纳米片的粒径优选为≤1μm，厚度优选为5～20nm，最优选地，碲化铋纳米片的粒径为≤500nm。
16.水凝胶具有较高的含水量及其与天然细胞外基质(ecm)的结构相似性，因此在药物输送、组织工程和伤口愈合等领域得到了广泛的研究和应用。海藻酸钠(sa)是一种的天然多糖，可用作伤口敷料和支架，因为它具有出色的止血能力，高亲水性、和优异的生物相容性，并且可以与钙离子快速简单的交联，使得碲化铋-海藻酸钠复合溶液完成溶胶-凝胶的快速转化，用于固定碲化铋纳米片。
17.第二方面，本发明提供了一种的上述用于光热-热释电协同治疗的碲化铋纳米片水凝胶组合药剂的制备方法，分别制备所述药液a和药液b；其中药液a是由将碲化铋纳米片水溶液与海藻酸钠均匀混合后得到，药液b为包含钙离子的水溶液。碲化铋纳米片水溶液与海藻酸钠的复合溶液通过注射器缓慢打入氯化钙溶液中后，该复合溶液与ca
2+
离子后交联后迅速可形成水凝胶。
18.在一具体实施方案中，所述药液a中，碲化铋纳米片浓度为50～800μg/ml，进一步优选为50～300μg/ml，所述水凝胶中海藻酸钠的浓度为5～20mg/ml；氯化钙溶液为5～40mg/ml。
19.在一具体实施方案中，所述碲化铋纳米片的粒径优选为≤1μm，厚度优选为5～20nm，最优选地，碲化铋纳米片的粒径为≤500nm。
20.在一具体实施方案中，所述碲化铋纳米片的制备方法为：所述碲化铋纳米片的制
备方法为：将312mg bicl3、332mg k2teo3、600mg naoh、400mg pvp和50ml eg添加到高压釜中，磁力搅拌1～3小时；然后将所得均匀混合物在180℃下加热6小时，然后冷却至室内温度，通过离心收集所得产物碲化铋纳米片。
21.第三方面，本发明还提供上述碲化铋纳米片水凝胶组合药剂在肿瘤治疗中的应用，在肿瘤治疗过程中，所述碲化铋纳米片水凝胶组合药剂用于光热-热释电疗法协同抗肿瘤。
22.所述的碲化铋纳米片水凝胶组合药剂的在肿瘤治疗中应用中的使用方法为：通过注射器将所述药液a注射在肿瘤部位，继而在肿瘤部位注射药液b，使得药液a中的海藻酸钠原位交联形成水凝胶。
23.在一具体实施方案中，所述药液a中碲化铋纳米片浓度为100μg/ml，所述药液a中海藻酸钠的浓度为20mg/ml；通过注射器将碲化铋-海藻酸钠复合溶液药液a注射在肿瘤部位，继而在原来部位注射氯化钙溶液药液b，使得原位交联形成水凝胶。
24.在一具体实施方案中，所述的碲化铋纳米片水凝胶组合药剂的在皮肤性肿瘤治疗中应用，尤其是黑色素瘤肿瘤中的应用。
25.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
26.本发明制备了一种光热-热释电疗法协同的碲化铋纳米片水凝胶组合药剂，具有优异的光热性能和ros生成能力，可以实现高效的ptt和pedt(pyroelectric dynamic therapy，热释电动态疗法)协同肿瘤治疗，通过热疗杀伤癌细胞，ros的产生破坏癌细胞和hsps，有效消除hsps副作用，光热疗法与热释电疗法协同具有优异的肿瘤治疗效果；与现有抗肿瘤材料的性能相比较，具有优异近红外光响应(nir-ii)和热响应性，生物相容性好、负载药物多等优点，且具有可注射性，可将光热转换材料有效的固定在病灶位置可以减少治疗过程中药物对正常组织的毒副作用，也可据肿瘤的恶化程度选择光热治疗的时间，即便多次激光照射后凝胶也具有优异的光热稳定性，可实现“一次注射，多次治疗”的目的，有效减轻肿瘤的复发。
附图说明
27.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
28.图1(a)和图1(b)分别是实施例1中碲化铋纳米片的透射电镜(tem)照片和原子力显微镜(afm)图片。
29.图2示出实施例1中碲化铋纳米片的xps元素分析能谱。
30.图3示出实施例1中碲化铋纳米片在水的粒径。
31.图4(a)和图4(b)分别示出实施例2中不同浓度碲化铋纳米片分散液在功率为1.0w/cm2的nir i区(808nm)和nir ii区(1064nm)激光辐射下液体温度随辐照时间的变化图；4(c)示出碲化铋纳米片分散液在nir ii区(1064nm)激光循环照射下的温度变化图，循环照射材料5次，每个循环照射5min，停止照射5min。
32.图5示出实施例3中加入xtt钠盐的碲化铋纳米片溶液经加热处理后xtt钠盐紫外
特征吸收峰随不同温度的变化图。
33.图6示出实施例3中加入abda的碲化铋纳米片溶液经加热处理后abda紫外特征吸收峰随不同温度的变化图。
34.图7示出实施例3中碲化铋纳米片与dmpo自旋诱引剂混合后在加热下的电子自旋共振(esr)图。
35.图8示出实施例3中碲化铋纳米片与temp自旋诱引剂混合后在加热下的电子自旋共振图。
36.图9(a)和图9(b)分别示出实施例4中不同浓度的碲化铋制备的水凝胶在功率为1.0w/cm2的nir i区(808nm)和nir ii区(1064nm)激光辐射下水凝胶温度随辐照时间的变化图；9(c)示出碲化铋纳米片水凝胶在nir ii区(1064nm)激光循环照射下的温度变化图，以检测水凝胶的光热稳定性，循环照射材料5次，每个循环照射3min，停止照射3min。
37.图10示出实施例5中水凝胶的流变性能，碲化铋水凝胶的流变行为在kinexus ultra+流变仪上进行评估，图10(a)检测高剪切速率下的粘度，图10(b)和图10(c)在一定频率范围内分别检测加入氯化钙溶液前后水凝胶的储能模量(g')和损耗模量(g")。
38.图11示出实施例6中不同碲化铋纳米片含量的水凝胶分别和正常细胞与肿瘤细胞孵育8小时后细胞的活性变化图。
39.图12示出实施例7中用cck-8法检测不同治疗处理对肿瘤细胞的杀伤效果对照图；图12中的“对照组”、“碲化铋凝胶+激光组”、“碲化铋凝胶+激光+自由基清除组”分别表示空白对照、碲化铋纳米片水凝胶+近红外ii区1064nm激光照射组、碲化铋纳米片水凝胶+近红外ii区1064nm激光照射+自由基清除组。
40.图13示出实施例8中用dcfh检测法检测不同治疗处理组中肿瘤细胞ros的水平；图13中的“对照组”、“碲化铋凝胶组”、“激光组”、“碲化铋凝胶+激光组”、“碲化铋凝胶+激光+自由基清除组”分别表示空白对照、仅碲化铋纳米片水凝胶组、仅近红外ii区1064nm激光照射组、碲化铋纳米片水凝胶+近红外ii区1064nm激光照射组、碲化铋纳米片水凝胶+近红外ii区1064nm激光照射+自由基清除组。
41.图14(a)示出实施例9中不同分组中肿瘤治疗的数码照片，图14(b)展示经不同治疗后裸鼠的肿瘤体积随时间的变化关系；图中的“对照组”、“碲化铋凝胶组”、“激光组”、“碲化铋凝胶+激光组”分别表示空白对照、仅碲化铋纳米片水凝胶组、仅近红外ii区1064nm激光照射组、碲化铋纳米片水凝胶+近红外ii区1064nm激光照射组。
具体实施方式
42.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
43.本发明涉及一种碲化铋纳米片水凝胶组合药剂的制备方法和应用。更具体地涉及将光热和热释电疗法联合治疗的多功能性药剂，用于人体或者其他哺乳动物肿瘤或癌症的诊断和高效治疗。
44.实施例1：合成碲化铋纳米片
45.将312mg bicl3、332mg k2teo3、600mg naoh、400mg pvp和50ml eg添加到100ml不锈钢高压釜中。将混合物在600r/s下磁力搅拌1小时。然后将所得均匀混合物在180℃下加热6小时，然后冷却至室内温度。通过离心收集所得产物，用丙酮洗涤三次，再用乙醇洗涤三次，后保存在4℃冰箱中。
46.图1(a)是实施例1中碲化铋纳米片的透射电镜(tem)照片；图1(b)碲化铋纳米片的原子力显微镜(afm)图片；
47.图1(a)为实施例1所制备碲化铋纳米片的tem图片，图1(b)为实施例1所制备碲化铋纳米片的afm图片。从图1(b)可以看出，本发明通过水热反应形成了均匀的六边形纳米片，afm图像还证实合成的碲化铋纳米片的厚度约为8nm。
48.图2为本实施例碲化铋纳米片的bi、te、c和o元素的分布图，表明所制备碲化铋纳米片中各组分间的有机结合。
49.图3为是本实施例碲化铋纳米片在水的粒径分布，可以看出粒子具有很好的稳定性和分散性，可以长期保存。
50.实施例2
51.将碲化铋纳米片分散于96孔板中，得碲化铋纳米片浓度为200、100、50和25μg/ml的悬浮液，取蒸馏水作为对照。分别用功率密度为1.0w/cm2的nir i区(808nm)和nir ii(1064nm)波长的近红外激光照射，通过红外相机记录水温随时间的变化。为检测材料的光热稳定性，重复照射材料次，记录每次照射后水的温度变化值。
52.图4(a)和图4(b)为功率密度在1.0w/cm2的nir i和nir ii近红外激光照射下，浓度分别为200、100、50和25μg/ml的碲化铋纳米片分散液以及去离子水水温的变化情况。很明显，相同功率密度的激光照射下，碲化铋纳米片的能更加有效地进行光热转换而升高水温。蒸馏水不具备光热转换的能力，而经过10分钟照射后，功率密度在1.0w/cm2，碲化铋纳米浓度为200μg/ml，nir ii(1064nm)近红外激光照射的碲化铋纳米片的可以使蒸馏水温度升高至63.5℃。nir i(808nm)近红外激光照射的碲化铋纳米片的可以使蒸馏水温度升高至56.3℃，从而判断在相同浓度和功率下，nir ii(1064nm)近红外激光效果更佳。此外，图4(c)示出200μg/ml的碲化铋纳米片分散液在nir ii(1064nm)近红外激光循环照射下的水温变化情况，nir ii(1064nm)重复照射碲化铋纳米片分散液五次，每次照射5min，停止5min，碲化铋纳米片显示出了良好的热稳定性。
53.实施例3：碲化铋纳米片热释电性能测试
54.将碲化铋纳米片的分散于离心管中，碲化铋纳米片浓度为160μg/ml，总体积为1ml，再加入xtt钠盐(3,3'-[1-(苯氨酰基)-3,4-四氮唑]-二(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸钠)，xtt钠盐的浓度为100μm。然后在分别使用25、35、45、55、65℃的温度进行加热，同时使用不加入碲化铋纳米片的单纯的xtt钠盐溶液在相同条件下进行对比实验。
[0055]
从图5中可以看出，加入碲化铋纳米片后再进行加热会产生超氧自由基，其特征峰上升，且温差越大，效果更加明显。
[0056]
将碲化铋纳米片分散于离心管中，碲化铋纳米片浓度为160μg/ml，总体积为1ml，再加入9,10-蒽二基-双(亚甲基)二丙二酸(abda)，abda的浓度为25μm。然后分别在25、35、45、55、65℃温度下进行加热，同时使用不加入碲化铋纳米片的单纯的abda溶液在相同条件下进行对比实验。
[0057]
从图6中可以看出，加入碲化铋纳米片后再进行加热会产生单线态氧，其特征峰降低，且温差越大，效果更加明显。
[0058]
以下通过电子自旋共振(esr)技术来进一步验证碲化铋纳米片的在加热状态下产生活性氧，将50μl碲化铋纳米片溶液(浓度为160μg/ml)与2μl的5,5-二甲基-1-吡咯啉-n-氧化物(dmpo)混合，在65℃温度下加热5分钟，图7说明碲化铋纳米片能够在加热条件产生超氧阴离子自由基。
[0059]
将1ml的碲化铋纳米片(浓度为160μg/ml)与1μl的四甲基哌啶酮(2,2,6,6-tetramethyl-4-piperidine,，temp)混合，在65℃温度下加热5分钟，图8说明碲化铋纳米片能够在加热条件下产生单线态氧。
[0060]
以上说明本发明碲化铋纳米片显示出了良好的热释电催化性能，表明其在热释电催化催化产生活性氧方面具有良好的应用前景。
[0061]
实施例4：碲化铋纳米片水凝胶的制备以及光热性能检测
[0062]
将不同浓度的碲化铋纳米片与海藻酸钠混合均匀，海藻酸钠在混合溶液浓度为20μg/ml，随后在氯化钙溶液(5mg/ml)中浸泡4小时后，去除氯化钙溶液，得到钙交联凝胶颗粒。为了测试碲化铋纳米片水凝胶的光热性能，将上述制备的水凝胶加入96孔板中，用808和1064nmnir激光照射，红外热像仪记录碲化铋纳米片水凝胶的温度变化。
[0063]
图9(a)和图9(b)为功率密度在1.0w/cm2的nir i和nir ii近红外激光照射下考察了不同浓度碲化铋纳米片(0、25、50、100和200μg/ml)制备的水凝胶的温度变化，200μg/ml的碲化铋纳米片制备的水凝胶，nir ii(1064nm)近红外激光照射的碲化铋纳米片水凝胶温度升高至58.5℃。nir i(808nm)近红外激光照射的碲化铋纳米片水凝胶温度升高至52.5℃，从而判断在相同浓度和功率下，nir ii(1064nm)近红外激光效果更佳。与碲化铋纳米片水溶液相比，相同浓度碲化铋纳米片制备的水凝胶升高的最终温度略低，这是因为水凝胶的形成过程吸收了氯化钙的溶液中的水分降低了整体浓度。此外，图9(c)示出碲化铋纳米片水凝胶在nir ii(1064nm)近红外激光循环照射下的温度变化情况，使用nir ii(1064nm)重复照射碲化铋纳米片水凝胶五次，每次照射3min，停止3min，碲化铋纳米片水凝胶显示出了良好的热稳定性。
[0064]
实施例5：碲化铋纳米片水凝胶的流变性能检测
[0065]
水凝胶的流变特性在kinexus ultra+流变仪上进行评估，图10(a)表明随着剪切速率的增加，碲化铋纳米片与海藻酸钠复合溶液的粘度逐渐降低，这表明其具有剪切稀化特性，具有可注射性。接下来，测量凝胶形成过程中的流变特性。图10(b)表明在不添加ca
2+
离子的情况下，损耗模量(g”)大于储能模量(g')并发生粘性变形，图10(c)表明添加ca
2+
离子后，储能模量(g')大于损耗模量(g”)，说明碲化铋纳米片与海藻酸钠复合溶液在ca
2+
存在下，交联形成的水凝胶经历了溶胶-凝胶转变。
[0066]
实施例6：材料生物相容性性检测
[0067]
用cck-8法评估不同碲化铋纳米片含量的水凝胶对细胞的毒性。将b16f10、rpe细胞接种于6孔板(每孔2*105个细胞)中，并培养过夜。将0.5ml不同浓度的碲化铋纳米片水溶液(0、10、20、40、80、160、320、640、1280μg/ml)中分别加入一定量的海藻酸钠进行混合，海藻酸钠在混合溶液浓度为20μg/ml，然后采用注射器将不同浓度的混合液分别均匀打出至氯化钙溶液中，形成水凝胶，去除氯化钙溶液后，将由不同浓度碲化铋纳米片所形成水凝胶
(碲化铋纳米片含量分别为0、5、10、20、40、80、160、320、640μg)分别装载到6孔板上，每个孔含有2ml培养基，碲化铋水凝胶与细胞再孵育8小时。然后与cck-8溶液共孵育后，用酶标仪在450nm的吸光度下评估细胞活力，从图11可以看出，不同碲化铋纳米片含量的水凝胶和b16f10、rpe细胞孵育8小时后，其细胞活性始终维持在高水平，说明本发明的碲化铋纳米片，本身对细胞的毒性是微小的，在实验浓度范围内碲化铋纳米片显示出了良好的生物相容性。
[0068]
实施例7：cck-8法评估碲化铋纳米片水凝胶对肿瘤细胞的杀伤效果
[0069]
为了用cck-8法评估碲化铋纳米片水凝胶在不同处理方式下对b16f10肿瘤细胞的杀伤效果，将b16f10肿瘤细胞按照不同的处理方式分为3组(仅碲化铋纳米片水凝胶组，碲化铋纳米片水凝胶+近红外ii区1064nm激光照射组，碲化铋纳米片水凝胶+近红外ii区1064nm激光照射+自由基清除组)。将肿瘤细胞接种于6孔板(2*105个细胞)中附着在培养皿上，并培养过夜。将0.5ml不同浓度的碲化铋纳米片水溶液(0、40、80、160、320μg/ml)中分别加入一定量的海藻酸钠进行混合，海藻酸钠在混合溶液浓度为20μg/ml，然后采用注射器将不同浓度的混合液分别均匀打出至氯化钙溶液中，形成水凝胶，去除氯化钙溶液后，将由不同浓度碲化铋纳米片所形成水凝胶(碲化铋纳米片含量分别为0、20、40、80、160μg)分别装载到6孔板上，每个孔含有2ml培养基，碲化铋水凝胶与细胞孵育2小时。之后，按照上述分组的方法进行不同的处理(ros清除组添加2μm n-乙酰基-l-半胱氨酸(n-acetyl-l-cysteine/nac)用于清除ros)。最后，在与cck-8溶液共孵育4小时后，通过吸光度为450nm的微孔板读取器评估细胞活力。
[0070]
图12显示应用了碲化铋纳米片水凝胶后，近红外ii区1064nm激光照射可以降低肿瘤细胞活性，经过ros清除的组也有杀伤效果，证明单纯的光热也有杀伤性能，由于激光照射后有温差的产生，碲化铋纳米片水凝胶能够产生ros协同光热疗法效果更佳。
[0071]
实施例8：dcfh检测法评估经过不同方法处理后肿瘤细胞内ros水平，评估不同处理的肿瘤细胞产生ros的性能
[0072]
将b16f10肿瘤细胞按照不同的处理方式分为5组(用新鲜培养基处理的对照组，仅近红外ii区1064nm激光照射组，仅碲化铋纳米片水凝胶组，碲化铋纳米片水凝胶+近红外ii区1064nm激光照射组，碲化铋纳米片水凝胶+近红外ii区1064nm激光照射+自由基清除组)。将肿瘤细胞接种于6孔板(2*105个细胞)中附着在培养皿上，并培养过夜。然后将负载碲化铋的水凝胶装载到6孔板上，孵育2小时。之后，按照上述方法进行不同的处理，图13显示，碲化铋纳米片水凝胶组+近红外ii区1064nm激光照射组产生强烈的ros，证明在激光照射下碲化铋纳米片水凝胶能够使肿瘤细胞内ros水平显著提高。
[0073]
实施例9体内抗肿瘤评估
[0074]
通过将b16f10细胞(1x 106个细胞，在100μl无血清细胞培养基中)皮下注射到balb/cude小鼠中来建立黑色素肿瘤模型。当肿瘤大小达到大约50-60mm3时开始治疗，并将20只小鼠随机分成不同的组进行不同的治疗(n＝5)。分组如下(1)pbs为对照组、(2)仅碲化铋纳米片水凝胶组、(3)仅近红外ii区1064nm激光照射组(1.5w/cm2，10min)、(4)碲化铋纳米片水凝胶+近红外ii区1064nm激光照射组(1.5w/cm2，10min)，第四组中将碲化铋纳米片分散于含有海藻酸钠的生理盐水注射液中，取100ul通过原位注射到荷黑色素瘤肿瘤模型balb/c裸鼠内后打入一定量的cacl2溶液，治疗后每2天测量每只小鼠的肿瘤大小和重量，
并第12天在对不同的治疗组进行肿瘤的解剖并称重。
[0075]
请参阅图14(a)-14(b)，实验结果表明，注射碲化铋纳米片水凝胶荷瘤鼠肿瘤体积的增长受到明显抑制。而同等条件下仅注射生理盐水组中荷瘤鼠肿瘤增长明显。
[0076]
通过上述实施例的细胞和动物实验验证了本发明碲化铋纳米片水凝胶组合药剂，具有优异的光热性能和ros生成能力，可以实现ptt和pedt协同可高效进行肿瘤治疗，通过热疗杀伤癌细胞，ros的产生破坏癌细胞和hsps，有效消除hsps副作用。
[0077]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。