肾叶山蚂蝗或其提取物在制备治疗骨质疏松的药物中的用途

1.本发明涉及肾叶山蚂蝗或其提取物在制备治疗骨质疏松的药物中的用途。


背景技术：

2.骨质疏松症(0steoporosis，op)是一种以骨量低下、骨微结构损坏、骨脆性增加、易发生骨折为特征的全身性骨骼疾病。临床上将其分为原发性op和继发性op。原发性op包括绝经后op、老年op和特异性op；继发性op 则是指由任何可导致骨代谢异常的原因而引起的骨骼疾病。据统计，中国居民女性op明显高于欧美国家，与日本、韩国等亚洲国家相近。由此可见， op严重危害女性健康并给患者家庭带来巨大的经济负担，who已将其列为十大最严重疾病之一。
3.女性op主要见于绝经后的妇女，由于体内雌激素水平急剧下降，导致体内的骨代谢异常，骨吸收大于骨形成，造成骨量丢失而引发绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis，pmop)。目前对于pmop的治疗措施包括基础治疗和药物治疗：基础治疗有饮食的平衡、健康的生活方式、维生素d 和ca的补充、预防跌倒等；药物治疗包括选择性雌激素受体调节剂类、抗吸收类药物(如：雌激素类；双膦酸盐类；隆钙素类等)、促进骨形成药物(甲状旁腺素)、活性维生素d及其类似物、双重作用机制药物(如维生素k；锶盐)等。但此类药物存在价格昂贵，副作用大，患者依从性差等问题。
4.民族医药作为祖国医学的重要组成部分，有着悠久的历史，是各少数民族通过长期摸索、实践而总结形成的宝贵财富；其经验方因其安全有效，被越来越多的研究者所关注。傣医学是四大民族医药之一，在治疗骨骼相关疾病上有其独特的治疗方式和经验用药。根据pmop的临床表现，其与傣医学中的“腰痛”和“骨折”等疾病症状相似。傣医学认为：40岁以后，人体的四塔、五蕴功能渐减，人体内骨骼、筋脉、肌肉失养，将引起一系列疾病的产生；傣医学将人体内的五脏六腑和其他组织器官归入土塔，认为土塔是构成人体的第一物质本源。因此，“pmop”与傣医学中的土塔密切相关，治疗“pmop”主要从土塔入手，对骨骼器官进行调补，以恢复其正常功能。
5.傣药肾叶山蚂蝗(desmodium renifolium(linn.)schindl，drs) (如图1)为豆科(leguminosae)山蚂蝗属植物，别名肾叶山绿豆、圆节山蚂蝗，是云南西双版纳傣族人民常用的民族药物之一；它的主要功能为补气增性，通气止痛等；主治体弱多病，性冷淡等疾病。目前还没有将傣药肾叶山蚂蝗用于治疗骨质疏松症，特别是治疗绝经后骨质疏松症。


技术实现要素：

6.为解决上述问题，本发明提供了肾叶山蚂蝗或其提取物在制备预防和/或治疗骨质疏松的药物中的用途。
7.进一步地，所述提取物为肾叶山蚂蝗水提物或肾叶山蚂蝗醇提物。
8.进一步地，所述肾叶山蚂蝗醇提物是肾叶山蚂蝗经95％乙醇提取的提取物。
9.进一步地，所述药物是预防和/或治疗绝经后骨质疏松症的药物。
10.进一步地，所述药物是增加骨小梁和/或骨密度的药物。
11.更进一步地，所述药物是抑制骨吸收和/或促进骨形成的药物。
12.更进一步地，所述药物是抑制体重增加，提高雌激素水平，升高血清中钙、磷、骨保护素、骨化三醇，和/或降低血清中骨钙素、碱性磷酸酶水平的药物。
13.更进一步地，所述药物是增加骨微结构参数bmd、tb.th，tb.n，和/ 或降低骨微结构参数tb.sp、smi和da的药物。
14.进一步地，所述药物是以肾叶山蚂蝗或其提取物为活性成分，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂；所述制剂为口服制剂；所述口服制剂为颗粒剂、溶液剂、丸剂、膏剂或片剂。
15.本发明肾叶山蚂蝗或其提取物在制备预防和/或治疗骨质疏松的药物中的用途，通过3月龄雌性sd大鼠行双侧卵巢切除术构建的pmop模型，发现肾叶山蚂蝗提取物，尤其是醇提物能抑制大鼠体重的增加，一定程度提高雌激素水平，升高血清中ca、p、opg、1,25(oh)2d3和降低bgp、akp的水平，并促进骨小梁的形成，增加骨微结构参数bmd、tb.th和tb.n并降低tb.sp、 smi和da；从而达到促进骨形成和抑制骨吸，进而增加骨小梁和骨密度，发挥改善pmop的作用。将肾叶山蚂蝗或其提取物制备成预防和/或治疗绝经后骨质疏松症的药物，具有广阔的市场应用前景。
16.显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
17.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
18.图1肾叶山蚂蝗植物和药材图
19.图2手术切口示意图
20.图3大鼠股骨远端病理组织切片图
21.图4大鼠的外观形态
22.图5各组子宫外观形态
23.图6大鼠股骨远端病理图片(一)
24.图7大鼠股骨远端病理图片(二)
25.图8大鼠股骨远端显微ct成像(纵切面)
26.图9大鼠股骨远端显微ct成像(横截面正置前倾30
°
)
27.图10骨髓腔内骨小梁三维重建图像
28.图11各组细胞trap染色的结果(400
×
)
具体实施方式
29.实施例1肾叶山蚂蝗水提物和醇提物对去卵巢大鼠骨质疏松模型的作用研究
30.1.1实验材料
31.1.1.1实验动物
32.50只3月龄雌性sd大鼠，spf级，体重220
±
20g，购买于昆明医科大学，许可证号：scxk(滇)k2015-0002。动物饲养于云南中医药大学医鉴甲楼动物房，每笼10只饲养，每12h昼夜明暗交替，环境清洁、通风良好，自由饮食、饮水，湿度40-60％，温度22
±
2℃。动物饲养和实验均符合《医学实验动物管理实施细则》要求。
33.1.1.2手术器械
34.1ml注射器，无菌巾单，手术刀片，刀柄，手术剪，镊子，持针器，手术镊，止血钳，手外拉钩，组织钳，缝合针，医用羊肠线5/0，手术用慕斯线，消毒棉球，止血纱布，消毒碗和消毒弯盘。
35.1.1.3实验试剂
36.甲醛(上海远慕生物科技有限公司，0605a17)；二甲苯(天津试剂三厂， eb362012)；95％乙醇(天津市致远化学试剂有限公司，2020041021)；无水乙醇(天津市致远化学试剂有限公司，2020042063)；苏木素-伊红染液(上海瑞谷生物科技有限公司，g1120)；水合氯醛(天津市密殴化学试剂有限公司，20200518)；仙灵骨葆片(国药集团同济堂(贵州)制药有限公司，181103)
37.1.1.4实验仪器
38.me104e/02电子天平(梅特勒-拖利多仪器(上海)有限公司)；4℃/-20℃电冰箱(青岛海尔)；数显式电热恒温水浴锅(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；超纯水机(smart2 pure uv/vf，美国thermo)；超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)；excelsior as全自动脱水机(美国thermo)； histostar组织包埋机、finess e+半自动切片机、digital摊片机、slimline 烤片机(美国thermo)；bx53显微镜、图像采集软件(日本olympus)；数字病理切片扫描系统(kf-pro-005，宁波江丰生物信息技术有限公司)；全自动染色机(樱花drs-prisma-p-jcs，樱花医疗科技(泰州)有限公司)；组织包埋盒(海门市神鹰实验器材厂)。
39.1.1.5实验用药剂量换算
40.根据“人与动物体表面积等效剂量”和民间用法用量，计算肾叶山蚂蝗给予大鼠的等效量剂量为1.35g生药/kg，仙灵骨葆的给药剂量为240mg/kg
·
d。
41.1.1.6仙灵骨葆药物制备
42.将仙灵骨葆片研成粉末，按照240mg/kg
·
d的给药剂量称取当天所需要的总量，溶解于0.5％羧甲基纤维素钠(cmc-na)中，现配现用。
43.1.1.7肾叶山蚂蝗的提取
44.1.1.7.1水提肾叶山蚂蝗
45.称取5天用量的原生药材肾叶山蚂蝗(由云南省高校民族医药现代研究重点实验室提供)，水量没过药面，冷水浸泡30min；武火煮沸后，文火保持微沸45min，纱布滤过；药渣加水，继续煮提2次，每次微沸35min，过滤药液；将3次药液合并，分别浓缩至生药0.135g/ml、生药0.27g/ml、生药0.54g/ml的浓度，按日用量分装，-20℃冰箱备用。每次大鼠灌胃前从冰箱取出恢复至室温，摇匀。
46.1.1.7.2醇提肾叶山蚂蝗
47.肾叶山蚂蝗称取5kg后打成粗粉，分别加入95％乙醇10倍、8倍、6倍、 6倍浸泡提取4次，每次72h；4次浸泡后的提取液分别回流浓缩，合并4次浓缩液，置于小型旋转蒸发仪上浓缩挥去大部分的乙醇，至闻不到乙醇味，即得乙醇提取液，再使用真空冷冻干燥机进行冷
冻干燥，得到干燥品221.1g，储存于-4℃备用，醇提取率为4.422％。
48.1.2方法
49.1.2.1实验动物分组
50.大鼠按照随机数字表法分成5组，每组10只，分别为假手术组(sham)、去卵巢模型组(ovx)、仙灵骨葆组(xlgb)、肾叶山蚂蝗水提组(drs-w) 和肾叶山蚂蝗醇提组(drs-e)。
51.1.2.2去势骨质疏松模型的建立
52.大鼠适应性饲养7天后，按经典造模方式复制绝经后骨质疏松模型。假手术组切除大鼠卵巢周围等体积脂肪组织；模型组及药物组切除大鼠双侧卵巢。具体手术操作步骤如下：
53.①
10％水合氯醛按照0.35ml/100g进行麻醉；麻醉起效后，剃除下至左右髂后上棘连线、上至双侧肋缘连线、左右两边为背部后正中线旁开4cm区域的毛，使大鼠呈俯卧位固定在鼠板上。
54.②
以手术切口为中心，顺时针由内向外用碘伏消毒3遍；铺无菌铺单固定后，按图2所示切口位置(以背部后正中线旁开1.5横指与肋弓下一横指的交点作为起点，以大鼠髋关节完全内收状态髌骨于腹部的投影为止点)分别在背部双侧切开一长约1-1.5cm的斜切口。
55.③
将皮下组织和筋膜钝性分离并切开肌层和腹膜，暴露腹腔；在切口内上方处轻柔拉出淡粉色脂肪团块，轻轻分离后可见包裹在脂肪下呈粉红色桑葚样的卵巢；然后用5/0羊肠线结扎卵巢下方的输卵管，取出卵巢，将断端输卵管送回腹腔；缝合线间断缝合肌层和皮肤。
56.④
整个造模期间均对大鼠进行保温处理，术后禁食不禁水12h，每只大鼠每天肌内注射青霉素80万单位，连续6d，每天使用碘伏消毒双侧切口，保持切口干燥，自由饮食。
57.1.2.3实验给药
58.各组大鼠术后恢复性饲养2周后，各组大鼠分别按照10ml/kg的灌胃体积进行灌胃，sham组和ovx组分别给予0.5％cmc-na，xlgb组、drs-w 组和drs-e组分别给予仙灵骨葆、肾叶山蚂蝗水提物和肾叶山蚂蝗醇提物，每天灌胃1次，连续灌胃14周。灌胃期间，每周称重一次。
59.1.2.4标本的采集及保存
60.末次灌胃24h后，处死大鼠，迅速从大鼠身上分离出左右股骨，小心剔除骨头表面的肌腱和肌肉，尽量保持骨膜的完整性，分别将左右股骨浸泡在 4％多聚甲醛和75％的酒精中备用。
61.1.2.5大鼠骨组织he染色
62.①
脱钙取材和洗涤：股骨在4％多聚甲醛中浸泡2周后，取出用甲酸脱钙液 (50％甲酸：蒸馏水＝1：1)脱钙48h；然后流水冲洗1h。
②
固定、脱水、透明和浸蜡：洗涤完成的组织用10％中性福尔马林固定液固定3h。采用浓度从低到高的酒精(浓度梯度分别为70％、80％、95％、100％)进行脱水；使用二甲苯置换出组织中的脱水剂，使组织呈半透明状，然后在熔化的石蜡中浸渍后置换出二甲苯。
③
包埋、切片、展片、贴片和烤片：采用石蜡将
②
中的组织包成一定形状的蜡块；使用切片机将蜡块切成4-5μm的薄片；切下的薄片在50
°
水中展平，然后贴在玻片上，70-80
°
烤箱中烘烤20min。
④
he染色：使用二甲苯脱去切片中的石蜡后，再用浓度从高到低的酒精(浓度梯度分别为100％、95％、80％、70％)将二甲苯置换出
来，流水冲洗1min后放入蒸馏水中待染色，让水进入组织、细胞，便于苏木素浸入细胞核，使细胞核染色；苏木素-伊红染液染色后，流水冲洗；酒精低浓度到高浓度进行脱水(浓度梯度分别为70％、80％、95％、100％)，二甲苯透明，自动封片机进行封片，光学显微镜下观察。
63.1.2.6实验数据处理
64.所有实验数据均使用graphpad prism 7.0进行分析，以表示，当数据符合正态分布和方差齐性检验时则采用单因素方差分析(one-wayanova)；当不符合正态分布时则采用非参数检验，以p《0.05表示差异具有统计学意义。
65.1.3结果
66.1.3.1各组大鼠体重的变化
67.由表1所示：与sham组比较，造模2周后ovx组的体重增加明显(p《0.05)，从第4周至第16周增加最显著(p《0.01)；与ovx组比较，xlgb组从第8 周到第16周，对大鼠体重的增加具有显著的抑制作用(p《0.01)；与ovx 组比较，drs-w组对大鼠体重增加具有抑制作用，第16周时差异具有统计学意义(p《0.05)；与ovx组比较，drs-e组也能显著抑制大鼠体重的增加，在第8周和第16周时差异具有统计学意义(p《0.05，p《0.01)。
68.表1大鼠体重的变化(n＝10)
[0069][0070]
注：与sham组比较，
*
p《0.05，
**
p《0.01；与ovx组比较，
#
p《0.05，
##
p《0.01。
[0071]
1.3.2大鼠股骨远端病理变化
[0072]
股骨远端病理组织切片经he染色后，骨小梁被染为梅红色，紫黑色为软组织。如图3所示，sham组骨小梁致密均匀，呈网状，连续性好。与sham 组比较，ovx组骨小梁显著减少，断裂，排列稀疏，骨小梁之间间距大，连续性差。与ovx组比较，xlgb组骨小梁数量增多，骨小梁之间的间距缩小，连续性较好。与ovx组比较，drs-w组和drs-e组的骨小梁数量显著增多，增粗，连续性较好，骨小梁之间间距减小，但以drs-e组改善更明显。
[0073]
1.4结论
[0074]
实验采用3月龄雌性大鼠去卵巢的方法，成功复制了pmop动物模型；通过筛选结果，肾叶山蚂蝗改善骨质疏松作用的最佳提取方法为醇提法，因此，用肾叶山蚂蝗醇提物开展进一步的药理和相关作用机制研究。
[0075]
实施例2肾叶山蚂蝗醇提物对去卵巢大鼠骨质疏松模型的影响
[0076]
1.实验材料
[0077]
1.1实验动物
[0078]
60只3月龄雌性sd大鼠，spf级，体重230
±
20g，购买于昆明医科大学，许可证号：scxk(滇)k2015-0002。动物饲养于云南中医药大学医鉴甲楼动物房，每笼10只饲养，每12h
昼夜明暗交替，环境清洁、通风良好，自由饮食、饮水，湿度40-60％，温度22
±
2℃。动物饲养和实验均符合《医学实验动物管理实施细则》要求。
[0079]
1.2实验试剂
[0080]
大鼠钙(ca)试剂盒(南京建成生物工程研究所，20201016)；大鼠磷 (pi)试剂盒(南京建成生物工程研究所，20201020)；大鼠碱性磷酸酶 (alp/akp)试剂盒(南京建成生物工程研究所，20201016)；大鼠骨保护素(opg)试剂盒、大鼠雌激素(e2)试剂盒、大鼠1,25二羟基维生素d
3 (1,25(oh)2d3)试剂盒、大鼠骨钙素(bgp)试剂盒(南京建成生物工程研究所，e20201001a)；总rna提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司，u9118)；rt master mix(上海普洛麦格生物产品有限公司， 0000418222)；qpcr master mix kit(上海普洛麦格生物产品有限公司，0000423158)；引物(北京擎科生物科技有限公司)。
[0081]
1.3手术器械
[0082]
同实施例1“1.1.2”。
[0083]
1.4实验仪器
[0084]
酶标仪(美国molecular)；pcr仪(sed1-g)(中国台湾威泰克)；quantstudiotmreal-time pcr(quantstudio 6 flex)(美国abi公司)；skyscan1174 x-raymicrotomograph(micro ct)(比利时bruker公司)。
[0085]
1.5实验用药的配制
[0086]
根据“人与动物体表面积等效剂量”的体表系数换算，计算得出肾叶山蚂蝗给予灌胃大鼠的等效量为1.35g生药/kg，作为本实验灌胃用药的低剂量；选择2倍临床等效量即2.7g生药/kg为中剂量；选择4倍临床等效剂量即5.4g 生药/kg为高剂量。根据实施例1“1.1.7.2”计算的提取率，换算后每组大鼠体重分别称取不同克数的肾叶山蚂蝗醇提物，溶解于0.5％羧甲基纤维素钠中，按照每只大鼠灌胃给药体积为10ml/1000g进行配药，即低剂量组最终浓度为生药0.135g/ml、中剂量组最终浓度为生药0.27g/ml、高剂量组最终浓度为生药0.54g/ml进行现配现用。仙灵骨葆药物的制备方法同实施例1“1.1.6”。
[0087]
2实验方法
[0088]
2.2.1实验动物分组
[0089]
购买的大鼠于云南中医药大学动物科研实验中心适应性喂养1周后，按照随机数字表法分成6组，每组10只，分别为假手术组(sham)，去卵巢模型组(ovx)，仙灵骨葆组(xlgb)，肾叶山蚂蝗醇提物(drs-e)低剂量组(1.35g生药/kg)、中剂量组(2.7g生药/kg)和高剂量组(5.4g生药/kg)。
[0090]
2.2.2去势骨质疏松模型的建立
[0091]
同实施例1“1.2.2“。
[0092]
2.2.3实验给药
[0093]
各组大鼠术后恢复性饲养2周后，各组大鼠分别按照10ml/kg的灌胃体积进行灌胃，sham组和ovx组分别给予等体积的0.5％cmc-na，xlgb组、 drs-e组分别给予仙灵骨葆和不同浓度的肾叶山蚂蝗醇提物，每天灌胃1次，连续灌胃14周。灌胃期间，观察各组大鼠毛发生长和精神活动情况，每周称重一次。
[0094]
2.2.4标本的采集及保存
[0095]
2.2.4.1大鼠外观拍照及血清采集
[0096]
灌胃14周后，称重，10％水合氯醛麻醉大鼠，将大鼠背部朝上置于平面上拍照；腹主动脉取血，室温下静止30min，以3000r/min离心，取上清分装后置于-80℃冰箱备用。
[0097]
2.2.4.2性器官取材
[0098]
腹主动脉取血后，迅速将子宫和阴道从腹腔取出，拍照并称重。按照如下公式计算性器官系数：性器官系数＝性器官体重/大鼠体重
×
100％。
[0099]
2.2.4.3股骨及胫骨取材
[0100]
迅速从大鼠身上分离出左右股骨和胫骨，小心剔除骨头表面的肌腱和肌肉，尽量保持骨膜的完整性，分别将左右股骨浸泡在4％多聚甲醛和75％的酒精中备用；胫骨置于-80℃冰箱备用。
[0101]
2.2.5实验指标测定
[0102]
2.2.5.1血清生化指标检测
[0103]
血清从-80℃冰箱取出恢复至室温，漩涡震荡混匀，按照试剂盒说明书进行检测。
[0104]
1).血清中e2、opg、bgp和1,25(oh)2d3含量的检测方法如下：
①
试剂盒恢复室温后，取出所需板条。
②
分别设置样本孔、标准品孔和空白孔；样本孔先加10μl待测样本，再加40μl样本稀释液；标准品孔中加入50μl不同浓度的标准品；空白孔不加。
③
除空白孔外，其余孔分别加入100μl辣根过氧化物酶(hrp)标记的检测抗体，封板膜封住反应孔，37℃恒温箱温育 1h。
④
去除液体，吸水纸上拍干后每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，重复洗板5次。
⑤
每孔分别加入50μl底物的a和底物b，37℃避光孵育15min。
⑥
每孔分别加入50μl终止液，使用酶标仪在450nm波长下测定各孔的od值。
⑦
根据说明书绘制标准品线性回归方程，按方程计算各样本浓度。
[0105]
2).血清中p含量的检测方法如下：
①
取10mmol/l p标准贮备液用去离子水稀释成不同浓度(0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2mmol/l)的标准品。
②
取0.1ml血清+0.4ml沉淀剂，允分混匀，3500r/min，离心10min，取上清待测。
③
设置测定管和标准管，测定管先加20μl待测样本，再加200μl工作液；标准管各加20μl不同浓度的标准品，再加200μl工作液；空白管加 20μl的去离子水和200μl工作液。
④
混匀，37℃水浴30min，冷却至室温，波长660nm，光径1cm，去离子水调零，测定各管吸光度。
⑤
根据说明书绘制标准品线性回归方程，按方程计算各样本浓度。
[0106]
3).血清中ca含量的检测方法：
①
用去离子水将2.5mmol/l ca标准液稀释成不同的浓度：0.0625mmol/l、0.125mmo1/l、0.25mmol/l、0.5mmol/l、 0.625mmol/l、1mmol/l、2mmol/l；
②
设置测定孔和标准孔，测定孔先加 10μl待测样本，再加250μl工作液ⅰ；标准孔各加10μl不同浓度的钙标准液，再加250μl工作液ⅰ；空白孔加10μl的去离子水和250μl工作液ⅰ。
③
混匀，静置5min，波长610nm，酶标仪比色，测定各孔od值。
④
根据说明书绘制标准品线性回归方程，按方程计算各样本浓度。
[0107]
4).血清中akp含量的检测方法：
①
将akp标准品贮备液用双蒸水稀释为浓度0.022mg/ml、0.055mg/ml、0.11mg/ml、0.22mg/ml、0.44mg/ml、 0.66mg/ml、0.88mg/ml、1.1mg/ml。
②
设置测定孔和标准孔，测定孔先加 5μl待测样本，标准孔各加5μl不同浓度的akp标准液，空白孔加5μl双蒸水，然后各孔分别加入50μl缓冲液和50μl基质液；充分混匀后37℃水浴15 min。
③
各孔分别加入显色剂150μl，轻轻振摇孔板混匀，波长520nm，酶标仪测定各孔吸光度od值。
④
根据说明书绘制标准品线性回归方程，按方程计算各样本浓度。
[0108]
2.2.5.2骨组织he染色
[0109]
同实施例1“1.2.5“。
[0110]
2.2.5.3骨密度及各骨微结构参数的测定
[0111]
采用skyscan1174型micro ct的scaner软件对各样本进行扫描。电压50 kv，电流800μa，以12μm扫描分辨率、1304
×
1024视野大小对大鼠股骨进行扫描。以股骨膝关节侧的生长板最底端定为基线，取300张连续切片，厚度为3.6mm；设定该区域为三维重建兴趣区域(roi)，用n-recon软件进行三维图像重建，用ct-an软件进行三维分析，对感兴趣区域进行骨密度 (bmd)测定，并对骨组织骨微结构参数进行分析。
[0112]
2.2.5.4rt-pcr检测bmp-2/smads信号通路和opg/rank/rankl信号通路相关基因的表达
[0113]
(1)骨组织总rna的提取
[0114]
根据天根生化科技(北京)有限公司总rna提取试剂盒使用说明书提供的操作方法对胫骨近心端组织进行提取，具体操作步骤如下：
①
将胫骨组织在液氮中磨碎，在50-100mg磨碎的胫骨组织中加1ml裂解液rz，用匀浆仪进行匀浆处理。
②
将匀浆样品在15-30℃放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离。
③
4℃12,000rpm离心5min，取上清，转入一个新的无rnase的离心管中。
④
加入200μl氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15s，室温放置3 min
⑤
4℃12,000rpm离心10min，取无色层水相于新的ep管中。
⑥
缓慢加入1/2体积的无水乙醇，混匀后将得到混合液一起转入吸附柱cr3中， 4℃12,000rpm离心30s。
⑦
向吸附柱cr3中加入500μl去蛋白液rd， 4℃12,000rpm离心30s，弃废液，将cr3放入收集管中。
⑧
向吸附柱cr3 中加入500μl漂洗液rw，室温静置2min，4℃12,000rpm离心30s，弃废液；此步骤重复1次。
⑨
将吸附柱放入2ml收集管中，4℃12,000rpm离心 2min，去除残余液体；将吸附柱cr3转入一个新的1.5ml离心管中，加30-100 μl rnase free ddh2o，室温放置2min，4℃12,000rpm离心2min。
[0115]
(2)逆转录
[0116]
按照上海普洛麦格生物产品有限公司rt-master mix kit逆转录试剂盒说明书进行逆转录，步骤如下：
①
去除rna样本中的gdna，反应体系：gdnaremover混合液1μl，1μg rna template，加nuclease-free water至5μl；将反应液轻轻混匀后，37℃温育2min。
②
逆转录反应，反应体系为：rtmaster mix(5
×
)2μl，500ng rna template，加nuclease-free water至10μl；反应条件：37℃15min，98℃5min，4℃hold。
[0117]
(3)实时荧光定量pcr
[0118]
反应体系的配置：qpcr master mix(2
×
)10μl，dna模板2μl，上游引物和下游引物各0.4μl，nuclease-free water 7μl，cxp 100
×
*
0.2μl，总体积为20μl。置于pcr仪中：
①
95℃预变性2min；
②
40个循环，95℃15 s，60℃1min；
③
溶解曲线。所使用的引物由北京擎科生物科技有限公司合成(见表2)。根据公式ratio＝2
‑△
cttarget(samper-cablirator)
/2
‑△
ctβ-actin(samper-cablirator)
计算各骨强度相关基因在股骨组织中的表达量。
[0119]
表2引物名称、序列、退火温度及扩增长度
[0120][0121][0122]
2.6实验数据处理
[0123]
同实施例1“1.2.6”。
[0124]
3结果
[0125]
3.1大鼠毛发生长和精神状态
[0126]
实验期间，sham组大鼠毛发正常有光泽，精神活动良好；ovx组大鼠全身毛发粗糙缺乏光泽，活动减少，反应较为迟钝，以灌胃后期明显；其余药物组活动稍差，灌胃后期明显
改善，其余均无异常。图4为第16周处死大鼠前的大鼠体型和毛发生长情况。
[0127]
3.2体重的变化
[0128]
从表3可知，实验前，各组大鼠体重之间比较差异无统计学意义(p》0.05)；从造模后第2周开始，与sham组比较，ovx组大鼠体重明显增加(p《0.01)，且增加趋势一直持续到实验结束；与ovx组比较，在第4周、第8周、第 12周和第16周，xlgb组、drs-e低剂量组、中剂量组和高剂量组均能一定程度抑制大鼠体重的增长，差异具有统计学意义(p《0.01)。提示drs-e具有一定调节脂代谢的作用。
[0129]
表3drs-e对各组大鼠体重的影响(n＝10)
[0130][0131]
注：与sham组比较，
*
p《0.05，
**
p《0.01；与ovx组比较，
#
p《0.05，
##
p《0.01。
[0132]
3.3子宫外观形态
[0133]
灌胃结束后解剖大鼠，各组大鼠子宫外观形态如图5所示：与sham组比较，ovx组子宫外观形态明显萎缩，说明去卵巢骨质疏松模型复制成功；与 ovx组比较，其余药物组的子宫外观形态均有一定的改善，其中以xlgb组和drs-e高剂量组改善最显著。
[0134]
3.4性器官系数
[0135]
灌胃结束后解剖大鼠，迅速将子宫和阴道剥离后称重，计算性器官系数，结果见表4。从结果中可看出，与sham组比较，ovx组性器官系数显著减少(p《0.01)；与ovx组比较，其他药物组性器官系数升高，以xlgb组及 drs-e高剂量组升高较为显著，但差异均无统计学意义(p》0.05)。
[0136]
表4drs-e对各组性器官系数的影响
[0137][0138]
注：与sham组比较，
*
p《0.05，
**
p《0.01；与ovx组比较，
#
p《0.05，
##
p《0.01。
[0139]
3.5各组大鼠血清指标检测结果
[0140]
表5drs-e对大鼠血清中e2、ca、p、1,25(oh)2d3、opg、akp和bgp的影响(n＝10)
[0141][0142]
注：与sham组比较，
*
p《0.05，
**
p《0.01；与ovx组比较，
#
p《0.05，
##
p《0.01。
[0143]
从表5可知，与sham组比较，ovx组大鼠血清中e2、ca、p、1,25(oh)2d3、 opg水平显著下降(p《0.01)；akp和bgp水平显著升高(p《0.01)。与 ovx组比较，xlgb组和drs-e高剂量组大鼠血清中e2、ca、p、1,25(oh)2d3、opg水平显著升高(p《0.01，p《0.05)；akp和bgp水平显著下降(p《0.01， p《0.05)。drs-e低剂量组与ovx组比较差异不具有统计学意义(p》0.05)。 drs-e中剂量组e2、ca、p、opg和bgp水平与ovx组比较差异不具有统计学意义(p》0.05)；1,25(oh)2d3水平显著升高(p《0.01)；akp水平显著下降(p《0.05)。
[0144]
3.6drs-e对大鼠股骨远端病理变化的影响
[0145]
股骨远端病理组织切片经he染色后，骨小梁被染为梅红色，紫黑色为软组织。结果显示：sham组骨小梁致密均匀，呈网状，连续性好；ovx组骨小梁显著减少，断裂，排列稀疏，骨小梁之间间距大；与ovx组比较，xlgb 组和drs-e各剂量组骨小梁的数量增多，增粗，连续性较好，骨小梁之间间距减小(如图6和图7所示)。
[0146]
3.7大鼠股骨松质骨骨微结构
[0147]
3.7.1micro-ct三维成像图
[0148]
用micro-ct扫描每组分离出来的股骨样品，并对感兴趣区进行三维重建 (如图8、9和10所示)，结果显示：sham组骨小梁数量多，连接紧密，呈网络状；ovx组骨小梁显著减少、断裂，骨小梁之间间距增大。与ovx组比较，xlgb组骨小梁数量较多，连接性较好，骨小梁断裂减少；drs-e各剂量组均能增加骨小梁的数量并能减少骨小梁断裂，其中以drs-e中剂量组和高剂量组改善明显。结果提示，去卵巢后骨小梁数量明显减少，连续性差，骨小梁明显断裂；而xlgb和drs-e均具有不同程度的对抗作用。
[0149]
3.8股骨远端各骨微结构参数比较
[0150]
表6drs-e对大鼠股骨远端骨微结构参数bmd、bv/tv、tb.th、tb.sp和tb.n的影响(n＝10)
[0151][0152]
注：与sham组比较，
*
p《0.05，
**
p《0.01；与ovx组比较，
#
p《0.05，
##
p《0.01。
[0153]
表7drs-e对大鼠股骨远端骨微结构参数smi、bs/tv、conn.d和da的影响(n＝10)
[0154][0155]
注：与sham组比较，
*
p《0.05，
**
p《0.01；与ovx组比较，
#
p《0.05，
##
p《0.01。
[0156]
从表6、表7可知，与sham组比较，ovx组中bmd、bv/tv、tb.th、 tb.n、bs/tv和conn.d值显著下降(p《0.01，p《0.05)，tb.sp、smi和da 值显著升高(p《0.01)。与ovx组比较，xlgb组显著升高bmd、tb.th、 tb.n和conn.d值，显著降低tb.sp、smi和da值，bv/tv、bs/tv值无显著变化；drs-e低剂量组显著升高tb.n值，显著降低da值，其余值无显著变化；drs-e中剂量组显著升高bmd和tb.n值，显著降低tb.sp和da值，其余值无显著变化；drs-e高剂量组显著升高bmd、tb.th和tb.n值，显著降低tb.sp、smi和da值，其余值无显著变化。
[0157]
3.9各组骨组织中bmp-2/smads信号通路和opg/rank/rankl信号通路及相关基因的表达
[0158]
表8drs-e对大鼠骨组织中bmp-2、runx2、osx、opg、rankl mrna表达的影响(n＝10)
[0159][0160]
注：与sham组比较，
*
p《0.05，
**
p《0.01；与ovx组比较，
#
p《0.05，
##
p《0.01。
[0161]
表9drs-e对大鼠骨组织中traf6、nfatc1、ctk和calcr mrna表达的影响(n＝10)
[0162][0163]
注：与sham组比较，
*
p《0.05，
**
p《0.01；与ovx组比较，
#
p《0.05，
##
p《0.01。
[0164]
从表8、表9可知，与sham组比较，ovx组bmp-2、runx2、osx、opgmrna的表达显著降低，rankl、traf6、nfatc1、ctk和calcr mrna 表达显著升高。与ovx组比较，xlgb、低、中、高组bmp-2和opgmrna 表达显著升高；xlgb和高剂量组runx2mrna表达显著升高，低和中剂量组无显著变化；xlgb、中、高组osx mrna表达显著升高，低剂量组无显著变化；xlgb、低、中、高组rankl、traf6、nfatc1和calcr mrna 表达显著降低，xlgb、中、高组ctk mrna表达显著降低，低剂量组无显著变化。
[0165]
4实验结论
[0166]
肾叶山蚂蝗醇提物可通过升高血清中ca、p、opg、1,25(oh)2d3和降低 bgp、akp的水平，并影响骨小梁的形成，增加bmd、tb.th、tb.n值及降低tb.sp、smi、da值来发挥改善骨质疏松的作用；其具体作用机制可能与调节opg/rank/rankl信号通路和bmp-2/smads信号通路相关基因的表达有关。
[0167]
实施例3肾叶山蚂蝗醇提物对rankl诱导raw264.7分化成破骨细胞的影响
[0168]
1实验材料
[0169]
1.1动物和细胞
[0170]
动物：雄性sd大鼠，3月龄，spf级，体重220
±
20g，购买于昆明医科大学，许可证号：scxk(滇)k2015-0002。
[0171]
细胞：小鼠单核巨噬细胞白血病细胞raw264.7(美国atcc细胞库)。
[0172]
1.2药品和试剂
[0173]
肾叶山蚂蝗(云南省傣医药与彝医药重点实验室提供)、dmem高糖培养基(美国hyclone公司，批号2030101)、胎牛血清(德国pan-biotech 公司，批号504090618)、双抗(biological industres公司，批号0040905)、破骨细胞分化因子rankl(receptor activator of nuclear factor-κb ligand) 冻干粉、trap染色试剂盒(广州联科生物技术有限公司，批号a00625)、 pbs(biological industres公司，批号0045218)、0.25％胰蛋白酶(biologicalindustres公司，批号：0053919)、rt-pcr试剂同实施例2“1.2”。
[0174]
1.3实验仪器
[0175]
co2恒温培养箱(美国thermo)、超净工作台(jb-cj-1500px，昆明中净环境工程有限公司)、倒置荧光显微镜成像系统(ti-s，nikon公司)、低速离心机(jw-1004，安徽嘉文仪器装备有限公司)、数显式电热恒温水浴锅 (上海博讯实业有限公司医疗设备厂)、微量移液器(eppendorf公司)、台式高速冷冻离心机(美国thermofisher公司)、rt-pcr仪器同实施例2“1.4”。
[0176]
2实验方法
[0177]
2.1含药血清的制备
[0178]
50只3月龄sd雄性大鼠随机分成5组：空白组、仙灵骨葆组、drs-e 低剂量组、drs-e中剂量组和drs-e高剂量组，每组各10只。大鼠适应性饲养一周后，空白组给予等体积的0.9％生理盐水，仙灵骨葆组、drs-e各组分别按照实施例1“1.1.6”和实施例2“1.5”的剂量给予仙灵骨葆和不同浓度的肾叶山蚂蝗醇提物，每天灌胃1次，连续灌胃7天。末次灌胃2h后，腹主动脉无菌取血，室温下静止30min，以3000r/min离心10min后取上清，56℃水浴30min灭活补体，0.22μm孔径过滤器过滤除菌后，无菌条件下以dmem 高糖培养基将各组血清配成10％的空白血清和含药血清，置于-20℃冰箱保存备用。
[0179]
2.2含药血清干预实验
[0180]
将冻存的raw264.7细胞株，从液氮罐中取出后，迅速置于37℃的水浴箱中，1min内使其完全溶解。将细胞混悬液转移至ep管中，用培养液稀释 10倍混匀，离心(1000r，5min)。倒掉上清液，加dmem完全培养基(高糖dmem基础培养基+10％胎牛血清+1％双抗)，轻轻吹打均匀后，转移至培养瓶中，置于37℃、5％co2恒温培养箱中培养，两天换液一次，待细胞长至 80％时进行铺板。
[0181]
0.25％胰酶消化raw264.7细胞，以1
×
103接种于24孔板，dmem完全培养基培养24h，待细胞全部贴壁后，分为阴性对照组(dmem完全培养基， control组)、空白对照组(dmem完全培养基+50ng/ml rankl，rankl 组)、仙灵骨葆组(dmem完全培养基+50ng/ml rankl+仙灵骨葆含药血清，xlgb组)、drs-e低剂量(dmem完全培养基+50ng/ml rankl+低剂量drs-e含药血清)、drs-e中剂量(dmem完全培养基+50ng/mlrankl+中剂量drs-e含药血清)和drs-e高剂量(dmem完全培养基+50 ng/ml rankl+高剂量drs-e含药血清)，每个组设4个复孔，各组按照上面的分组进行药物干预，隔天换液一次，连续培养10天后行trap染色，观察drs-e对rankl诱导raw264.7分化为破骨细胞的情况。实验重复3次。
[0182]
2.3trap染色
[0183]
根据破骨细胞染色鉴定试剂盒进行操作，具体步骤如下：弃去培养基，沿壁加入
0.5ml pbs洗涤2-3次；每孔加入200μl固定液，室温固定20min，沿壁加入0.5ml pbs轻轻洗涤3次；每孔加入200μl透化液孵育5min，透化后，沿壁加入0.5ml pbs轻轻洗涤3次；取1瓶显色底物，加入5ml染色缓冲液溶解，涡旋振荡混匀；将配制好的染色液置于37℃水浴锅中预热；将预热的染色液按150-300μl/孔加入24孔板中，将24孔板置于37℃水浴锅中避光孵育20-60min；孵育结束后，用沿壁加入0.5ml去离子水轻轻洗涤，弃上清，重复3次；每孔加入100μl甲基绿溶液，轻轻摇晃覆盖孔底，染色细胞核5-10min；染色结束后，沿壁加入0.5ml去离子水洗涤数次，弃上清，直至在显微镜下观察到蓝色的核；自然晾干，显微镜观察。
[0184]
2.4rt-pcr检测破骨细胞分化的关键基因
[0185]
2.4.1细胞总rna的提取
[0186]
根据天根生化科技(北京)有限公司总rna提取试剂盒使用说明书提供的操作方法对细胞进行提取，具体操作步骤如下：
[0187]
①
根据每10cm2面积加1mlrz的量直接在培养板中加入裂解液rz裂解细胞。其余步骤同实施例2“2.5.4(1)”。
[0188]
2.4.2逆转录和实时荧光定量pcr
[0189]
同实施例2中“2.5.4(2)和(3)”，引物见下表10。
[0190]
表10引物名称、序列、退火温度及扩增长度
[0191][0192]
[0193]
2.5实验数据处理
[0194]
同实施例1“1.2.6”。
[0195]
3结果
[0196]
3.1trap染色结果
[0197]
如图11所示：trap染色后倒置显微镜下观察破骨细胞含多个细胞核，形态不规则，胞浆呈酒红色。control组中，未发现破骨细胞。rankl组中破骨细胞显著增多。与rankl组比较，xlgb组破骨细胞显著减少；drs-e 各剂量组破骨细胞也减少，且破骨细胞数量随drs-e浓度的升高而减少。
[0198]
3.2drs-e对rank、traf6、nfatc1、trap、mmp-9和ctk mrna 表达的影响
[0199]
表11drs-e对rank、traf6和nfatc1 mrna表达的影响
[0200][0201]
注：与control组比较，
*
p《0.05，
**
p《0.01；与rankl组比较，
#
p《0.05，
##
p《0.01。
[0202]
从表11可知，与control组比较，rankl组rank mrna的表达显著升高，差异具有统计学意义(p《0.01)。与rankl组比较，xlgb和高剂量组 rankmrna表达显著降低，低和中剂量组无显著变化；xlgb、低、中、高组traf6、nfatc1、trap、mmp-9和ctk mrna表达达均显著降低(p《0.01)。
[0203]
综上，本发明选用3月龄雌性sd大鼠行双侧卵巢切除术可成功复制 pmop模型，这为后续drs防治pmop的研究提供了基础。通过研究分析，发现drs-e在缓解pmop上的疗效优于drs-w，提示醇提drs更有利于缓解pmop。实验还使用了不同浓度的drs-e对去卵巢骨质疏松模型进行了干预，发现drs-e能抑制大鼠体重的增加，一定程度提高雌激素水平，升高血清中ca、p、opg、1,25(oh)2d3和降低bgp、akp的水平，促进骨小梁的形成，增加骨微结构参数bmd、tb.th和tb.n并降低tb.sp、smi和da；提示drs-e可通过促进骨形成和抑制骨吸收来达到增加骨小梁和骨密度，发挥改善pmop的作用。为了进一步研究其作用机制，检测了骨组织和破骨细胞中opg/rank/rankl信号通路及骨组织bmp-2/smads信号通路的相关基因，发现drs-e能显著影响这两条信号通路相关基因的表达，以达到抑制破骨细胞及促进成骨细胞增殖分化的作用。以上均表明drs-e能有效缓解pmop，其可通过促进骨形成和抑制骨吸收来达到骨稳态，有效预防和治疗绝经后骨质疏松症。