一种治疗动物增生性肠炎的盐酸沃尼妙林纳米凝胶及其制备方法

1.本发明属于兽药制备技术领域，具体涉及一种治疗动物增生性肠炎的盐酸沃尼妙林纳米凝胶及其制备方法。


背景技术：

2.由胞内劳森菌(lawsonia intracellularis，l.intracellularis)引起的增生性肠炎(proliferative enteritis，pe)是一种以回肠和结肠隐窝内未成熟的肠细胞发生腺瘤样增生并导致肠黏膜增厚为特征的接触性消化道传染病。目前，多种动物都可发生此病，患病动物是目前集约化生猪养殖中的主要疾病，多表现为食欲减退、精神沉郁、皮肤苍白、间隙性下痢、粪便变软变稀，有时还混有血液或坏死组织碎片，同时由于回肠肠壁明显增厚，使其消化吸收能力发生紊乱，导致其生产性能降低，增重缓慢，饲料报酬率下降，造成严重的经济损失。
3.盐酸沃尼妙林属于新一代截短侧耳素类动物的专用抗生素，于2004年1月被欧盟批准预防和治疗猪结肠螺旋体病和猪增生性肠炎。因其安全、低毒、抗菌谱广和抗菌活性强等特点，被广泛应用于金黄色葡萄球菌、链球菌等革兰氏阳性菌和肺炎支原体、猪痢疾短螺旋体、结肠菌毛样短螺旋体、胞内劳森菌等病原体的防治。研究发现，盐酸沃尼妙林可以明显减轻增生性肠炎的临床症状，抑制感染，控制腹泻。对于消化道疾病，常采用的给药方式是口服给药，但盐酸沃尼妙林味苦，且对胃肠道具有强烈的刺激性。所以现在需要一种适用于治疗动物增生性肠炎的盐酸沃尼妙林制剂，以期在避免药物对胃肠道刺激反应的同时，又可提高其治疗效果。


技术实现要素：

4.为改善盐酸沃尼妙林适口性、降低刺激性以及提高稳定性，本发明以具有天然无毒的高酯果胶为材料，通过添加蔗糖包裹泊洛沙姆-盐酸沃尼妙林纳米微球，制备出具备果胶酶响应型的盐酸沃尼妙林纳米凝胶，既克服了盐酸沃尼妙林适口性差的问题，又延长药物在体内的释放时间、提高其稳定性，从而达到增强疗效的目的。
5.为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
6.一种治疗动物增生性肠炎盐酸沃尼妙林纳米凝胶，由包括以下质量份数的原料制成：盐酸沃尼妙林0.2-1份；泊洛沙姆1-4份；果胶0.5-2份；蒸馏水30-80份；蔗糖20-70份。
7.优选的，由包括以下质量份数的原料制成：盐酸沃尼妙林0.2-1份；泊洛沙姆1-4份；果胶0.5-2份；蒸馏水50-70份；蔗糖30-50份。
8.最优选的，由以下质量份数的原料制成：盐酸沃尼妙林0.4份；泊洛沙姆2份；果胶0.8份；蒸馏水62.5份；蔗糖34.3份。
9.纳米凝胶具有优良的载药能力、良好的结构稳定性和生物相容性等特点，可将抗菌药物递送到细菌感染部位，显著改善抗菌药物在微环境中的靶向生物分布，同时因其具
有纳米尺度，易通过细胞膜等生物屏障，有望增强对胞内劳森菌的治疗效果。
10.泊洛沙姆能够包裹盐酸沃尼妙林，形成纳米微球，从而达到缓释效果。
11.果胶是一种天然无毒的食品添加剂和保健品，被广泛应用于食品和医药领域，在酸性环境中十分稳定，因此包裹药物后可免受胃酸破坏，从而提高了药物稳定性。肠道微生物中的多形拟杆菌可以特异性分解果胶，使药物在回肠与结肠的感染部位达到靶向释放效果。
12.蔗糖可促使高酯果胶形成立体网眼凝胶结构，同时可以掩盖盐酸沃尼妙林的苦味，提高动物的适口性。
13.上述治疗动物增生性肠炎盐酸沃尼妙林纳米凝胶的制备方法，包括以下步骤：
14.s110、将所述蒸馏水分为两部分，分别为蒸馏水1和蒸馏水2；将果胶加入蒸馏水1中溶解，得到溶液1；
15.s120、将所述盐酸沃尼妙林和泊洛沙姆依次加入蒸馏水2中，混合均匀，得到溶液2；
16.s130、将溶液2滴加入溶液1中，混合均匀，得到溶液3；
17.s140、将蔗糖加入溶液3中，加热溶解(优选50℃)，并调节ph至2-3，得到溶液4，继续搅拌形成纳米凝胶，即得盐酸沃尼妙林纳米凝胶。
18.本发明的有益效果在于：
19.1、首次通过结合包合技术、纳米技术和凝胶技术的优点，用于治疗动物性增生性肠炎；
20.2、增强了盐酸沃尼妙林在胃酸中的稳定性；
21.3、掩盖了盐酸沃尼妙林的苦味；
22.4、通过果胶酶的水解作用和泊洛沙姆的包合作用，提高了盐酸沃尼妙林在肠道中靶向作用和缓释作用；
23.5、可提高盐酸沃尼妙林对动物增生性肠炎的临床疗效。
附图说明
24.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
25.图1是实施例3中盐酸沃尼妙林纳米凝胶的外观性状示意图；
26.图2是实施例3中盐酸沃尼妙林纳米凝胶的扫描电镜示意图；
27.图3是实施例3中盐酸沃尼妙林纳米凝胶的粒径分布示意图；
28.图4是实施例3中盐酸沃尼妙林纳米凝胶的zeta电位分布示意图；
29.图5是实施例3中盐酸沃尼妙林纳米凝胶在模拟胃液和肠液中的溶胀性能示意图；
30.图6是实施例3中盐酸沃尼妙林纳米凝胶在模拟胃液和肠液中的体外释放示意图；
31.图7是治疗试验中阳性对照组的小鼠模型组织切片示意图；
32.图8是治疗试验中阴性对照组的小鼠模型组织切片示意图；
33.图9是治疗试验中盐酸沃尼妙林预混剂治疗被感染小鼠模型的组织切片示意图；
34.图10是治疗试验中盐酸沃尼妙林纳米凝胶治疗被感染小鼠模型的组织切片示意
图。
具体实施方式
35.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
36.实施例1
37.一种盐酸沃尼妙林纳米凝胶，由以下质量份数的原料组成：盐酸沃尼妙林0.5份；泊洛沙姆2份；果胶1份；蒸馏水60.5份；蔗糖36份。制备方法，具体包括以下步骤：
38.s110、将所述蒸馏水平均分为两部分，分别为蒸馏水1和蒸馏水2；将果胶加入蒸馏水1中溶解，得到溶液1；
39.s120、将所述盐酸沃尼妙林和泊洛沙姆依次加入蒸馏水2中，混合均匀，得到溶液2；
40.s130、将溶液2滴加入溶液1中，混合均匀，得到溶液3；
41.s140、将蔗糖加入溶液3中，加热溶解(50℃)，并调节ph至2.5，得到溶液4，继续搅拌形成纳米凝胶，即得盐酸沃尼妙林纳米凝胶。
42.实施例2
43.一种盐酸沃尼妙林纳米凝胶，由以下质量份数的原料组成：盐酸沃尼妙林0.4份；泊洛沙姆2份；果胶1份；蒸馏水62份；蔗糖34.6份。制备方法参考实施例1。
44.实施例3
45.一种盐酸沃尼妙林纳米凝胶，由以下质量份数的原料组成：盐酸沃尼妙林0.4份；泊洛沙姆2份；果胶0.8份；蒸馏水62.5份；蔗糖34.3份。制备方法参考实施例1。
46.1、取实施例1-3中纳米凝胶适量，眼观观察所制备的凝胶材料是否有大小不均的颗粒或者气泡产生。其中实施例1颜色不均一，未形成凝胶状，有大小不一的颗粒；实施例2颜色均一，但未形成凝胶状；实施例3中所制备出的盐酸沃尼妙林纳米凝胶均一性良好，可形成稳定性凝胶，可作为后续的小鼠模型的治疗试验药剂。
47.2、形态观察：将实施例3所得盐酸沃尼妙林纳米凝胶稀释100倍后，通过扫描电镜观察其微观形态。结果表明：所制备的盐酸沃尼妙林纳米凝胶为澄清透明色，在倾斜的瓶中表现为凝胶状，未发现絮状物和沉淀，如图1所示。纳米凝胶的扫描电镜图，如图2所示。通过包合技术，盐酸沃尼妙林被包裹于泊洛沙姆中，形成了盐酸沃尼妙林包合物；通过纳米技术和凝胶技术，盐酸沃尼妙林被包裹于果胶和蔗糖水凝胶中，形成了盐酸沃尼妙林复合纳米凝胶。由此说明通过包合技术、纳米技术和凝胶技术，成功制备了盐酸沃尼妙林复合纳米凝胶。
48.3、zeta电位和粒径的测定：将所制备的盐酸沃尼妙林纳米凝胶稀释100倍后，通过马尔文纳米激光粒度仪测定其zeta电位和粒径，重复3次取平均值。结果表明：平均粒径和zeta电位分别为454.22
±
5.63nm和-32.3
±
3.64mv，如图3和图4所示。
49.4、溶胀性能：分别制备模拟的胃液(ph＝1.2)和肠液(ph＝7.4，加入果胶酶)。随后，将盐酸沃尼妙林纳米凝胶分别放入模拟的胃液和肠液中，在不同时间点观察其溶胀性
能。结果表明：在胃液中，24h时，盐酸沃尼妙林纳米凝胶依然处于稳定的状态，表明所制备的凝胶在胃酸中具有较高的稳定性；在肠液中，3h时，盐酸沃尼妙林纳米凝胶就已经发生明显溶胀，表明所制备的凝胶在肠液中经过溶胀，释放出药物，如图5所示。由此可见，所制备的盐酸沃尼妙林纳米凝胶可以增强盐酸沃尼妙林在胃酸中的稳定性。
50.5、体外释放：分别将盐酸沃尼妙林纳米凝胶放入模拟的胃液和肠液中，在不同时间点计算其药物释放率。结果表明：在胃液中，3h时，95.5％
±
2.1％的药物被释放出来；在肠液中，3h时，仅有68.2％
±
2.8％的药物被释放出来，且在12h时，83.8％
±
3.0％的药物被释放出来，如图6所示。综合溶胀性能和体外释放，盐酸沃尼妙林纳米凝胶通过果胶酶的水解作用和泊洛沙姆的包合作用，提高了盐酸沃尼妙林在肠道中靶向作用和缓释作用。
51.6、适口性试验：将盐酸沃尼妙林纳米凝胶(加药组1)和盐酸沃尼妙林预混剂(加药组2)混于水中，观察加药组与不加药物组的小鼠饮水情况。结果表明：加药组1和不加药物组，小鼠饮水情况无明显差别，体重也无明显差别。加药组2饮水明显减少，几乎不饮水，体重减轻。由此说明了所制备的盐酸沃尼妙林纳米凝胶掩盖了盐酸沃尼妙林的苦味。
52.7、小鼠模型的治疗试验：
53.1.材料与方法
54.1.1药物盐酸沃尼妙林预混剂(10％，水溶性)，盐酸沃尼妙林纳米凝胶(0.5％)。
55.1.2试验动物24只清洁级(icr)昆明小鼠，购自塔里木大学动物实验站。
56.1.3仪器激光纳米粒度仪、集热式恒温磁力搅拌器、加热磁力搅拌器、冷冻干燥机，可变真空超高分辨场发射扫描电子显微镜，紫外-可见分光光度计，纳米粒度及zeta电位分析仪。
57.1.4试验方法
58.1.4.1小鼠增生性肠炎模型的建立
59.将24只20
±
1.2g小鼠随机分成4组(盐酸沃尼妙林预混剂治疗组、盐酸沃尼妙林纳米凝胶治疗组、阳性对照组、阴性对照组)，每组6只。其中1-3组每只小鼠各接种0.6ml菌液(105tcid
50
/ml)，连续感染3天，构建小鼠增生性肠炎模型。第4组小鼠不做感染(阴性对照组)。被感染胞内劳森菌的小鼠，饮食饮水下降，体重减轻，明显消瘦，组织切片显示回肠隐窝内的肠细胞发生明显增生。阴性对照组小鼠饮食饮水正常，未出现任何症状，则判定成功建立了小鼠增生性肠炎模型。
60.1.4.2治疗实验
61.第1组用盐酸沃尼妙林纳米凝胶治疗被感染小鼠，第2组用盐酸沃尼妙林预混剂治疗被感染小鼠，第3组将感染小鼠后，不做任何处理(阳性对照组)，第4组不感染，不做任何处理(阴性对照组)，并观察治疗情况。将盐酸沃尼妙林纳米凝胶和盐酸沃尼妙林预混剂通过灌胃治疗感染小鼠，连续治疗7天，观察并记录小鼠体重、临床症状，并采集各组小鼠回肠末端，进行he染色。
62.1.4.3结果判定
63.临床症状判定：确认小鼠感染成功后，每24h观察1次，期间观察小鼠临床症状。经过治疗后，被感染的小鼠精神、活动、饮食、饮水较少，恢复正常，体重无明显变化，则从临床角度判定治疗成功。
64.组织切片判定：阳性对照组的小鼠回肠末端增生明显，隐窝内肠细胞发生明显增
生。治疗组的小鼠回肠末端无明显增生，与阴性对照组无明显差异。
65.1.5试验结果
66.感染组小鼠出现了饮食饮水下降，体重减轻，明显消瘦，回肠末端增生明显等现象，则成功建立了小鼠增生性肠炎模型。
67.小鼠增生性肠炎模型经过盐酸沃尼妙林预混剂和盐酸沃尼妙林纳米凝胶治疗后，饮食饮水恢复正常，体重与阴性对照无明显差别，则从临床症状角度判定为治疗成功。经过组织切片，无明显病理变化，则从病理学角度判定治疗成功，如图7、图8、图9和图10所示。第1组治愈率为83.3％，第2组治愈率为50.0％，由此说明盐酸沃尼妙林纳米凝胶可提高盐酸沃尼妙林对动物性增生性肠炎的临床疗效。
68.以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。