可通过仿生再矿化促进骨再生的dSIS海绵状支架、其制备方法及所得产品

可通过仿生再矿化促进骨再生的dsis海绵状支架、其制备方法及所得产品
技术领域
1.本发明属于骨组织工程领域，尤其涉及一种可通过仿生再矿化促进骨再生的dsis仿生再矿化支架、其制备方法及所得产品。


背景技术：

2.由于外伤、炎症、肿瘤等诸多疾病导致的骨组织缺损严重影响了骨功能的行使。当前临床上仍以自体骨移植作为骨缺损修复的“金标准”。但自体骨供区取骨后可能存在感染、神经损伤及功能丧失等风险。而同种异体骨或者异种异体骨移植可能存在免疫排斥、疾病传播、宗教信仰等一系列问题。
3.近年来，为解决上述问题，组织工程技术应运而生，通过支架、干细胞及生长因子三者协同作用促进骨组织再生，为骨缺损修复提供了新思路。随着骨组织工程的发展，天然高分子材料因其具有良好的生物相容性而应用于超过临界骨缺损的修复。其中，猪小肠黏膜下层(small intestine submucosa，sis)是经fda批准使用的天然高分子材料，主要成分为i型胶原，且富含碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子等生物活性成分，具有良好的生物相容性，并可为干细胞的增殖分化提供生物活性因子及细胞外基质环境。
4.既往研究猪小肠黏膜下层经过脱细胞处理去除免疫原性后，通过冷冻干燥法制备而成生物屏障膜置于兔颅骨缺损模型中，证实了sis支架具有促进骨缺损修复的作用。但单纯的小肠黏膜下层制作而成的生物膜类支架，存在机械强度差、容易降解和与新骨形成的周期不同步等局限，难以满足骨组织工程支架的要求。骨细胞外基质主要由i型胶原原纤维和嵌入其间隙区域的磷酸化羟基磷灰石(ha)纳米晶组成，ha在胶原纤维内部形成纤维内矿化。因此，可通过模拟天然骨细胞外基质结构的方式设计组织工程支架。
5.大量研究通过对胶原蛋白支架添加无机矿物以期提高支架的机械性能及生物性能，但通过矿物成分与有机支架直接混合制备而成的支架，由于制备方式和矿物成分尺寸过大，矿物质多仅在支架表面形成沉积，呈现不均匀分布，并难以到达胶原纤维之间或纤维内部宽约67nm周期性间隙中，实现真正意义的纤维内矿化。同时由于矿物质中所含的微量元素的局部堆积浓度过大，可能降低其生物相容性。将来源于小肠黏膜下层的有机成分(细胞外基质)与液状纳米级的无机的矿物成分均匀组装，形成更加满足于骨组织工程的仿生矿化支架，以期产业化产品，降低患者经济负担，提高社会化受益。


技术实现要素：

6.本发明提供了一种可通过仿生再矿化促进骨再生的dsis海绵状支架、其制备方法及所得产品，其基于对天然高分子材料进行仿生再矿化改性的方式，通过实现液体状纳米级仿生再矿化以显著提高支架的机械性能及促成骨性能，探究其在骨组织工程领域更加深入的应用，从而解决上述问题。
7.为了达到上述目的，本发明提供了一种可通过仿生再矿化促进骨再生的dsis海绵
状支架的制备方法，包括以下步骤：
8.将猪小肠机械剥离至黏膜下层，经脱脂脱细胞处理后得到湿态的新鲜脱细胞小肠黏膜下层dsis；
9.将湿态的新鲜dsis冷冻研磨成粉末后，冷冻干燥，得到dsis干粉；
10.将dsis干粉与醋酸、胃蛋白酶水溶液充分混合，配制dsis干粉浓度为0.5-2％的溶液，于模具中冷冻干燥，得到dsis海绵状支架。
11.作为优选，将新鲜dsis冷冻研磨成粉末后，冷冻干燥，得到dsis干粉具体为：
12.将新鲜的dsis置于液氮中预冷2-5分钟，后置于冷冻研磨仪器中，于-198℃液氮环境下完全研磨为粉末，并密封防潮保存，使用冻干机冷冻干燥12小时，得到干燥的dsis粉末(即dsis干粉)；其中，冻干的起始温度为-80℃，气压为16.2atm。
13.作为优选，dsis干粉浓度为0.5-2％的dsis溶液中，所加入的醋酸量为0.1-3％v/v，所加入的胃蛋白酶的量为0.1-0.2％w/v。
14.在上述方案中，在加入醋酸和胃蛋白酶的过程中，优选采用磁力搅拌器于36-37℃下搅拌36-48小时，以促进溶液均质。
15.作为优选，制备dsis干粉浓度为0.5-2％的溶液(dsis溶液),于模具中冷冻干燥具体包括：
16.将浓度为0.5-2％(优选1％)的dsis溶液于硅胶模具或细胞用孔板中，在-20℃预冻24小时后转-40℃或-80℃进一步预备24h，再使用冻干机冻干≥24小时，获得均质的海绵状支架；
17.随后，还包括将冷冻干燥的海绵状支架于edc/nhs溶液中避光交联，充分清洗后，预冷再次冷冻干燥，得到dsis海绵状支架。
18.在上述方案中，将海绵状支架于edc/nhs溶液中避光交联，其一方面是为了保持溶液中交联药物的活性，另一方面也可提高纯胶原基材料的稳定性，从而有效改善支架的稳定性。
19.作为优选，所述edc/nhs浓度比为50mm/25mm,溶液中的溶剂为纯度为80-95％的乙醇。
20.作为优选，避光交联的时间为24小时，充分清洗后，于-20℃～-80℃预冻过夜8-12小时后转冷冻干燥4-8小时。
21.本发明提供了一种根据上述任一项技术方案所述的制备方法制备得到的可通过仿生再矿化促进骨再生的dsis海绵状支架。
22.本发明提供了一种m-dsis仿生再矿化支架，采用上述技术方案所述的可通过仿生再矿化促进骨再生的dsis海绵状支架通过进一步仿生再矿化制备得到。
23.作为优选，其通过以下方法制备得到：
24.将dsis海绵状支架于矿化液中矿化14-21天，通过原位矿化的方式使离子进入支架有机成分内部，实现自下而上的纤维内、外矿化，清洗干净后，冷冻干燥，得到仿生再矿化支架m-dsis。
25.在上述方案中，通过无机矿物原位矿化的方式，可有效提升sis支架的机械性能并维持其良好的生物相容性和生物活性，赋予支架更优越的促成骨性能；在此基础上，通过将冷冻干燥法与原位矿化方式相结合，可使无机矿物在支架内部分布更为均匀，并维持适宜
细胞黏附、增殖与分化的微环境。
26.作为优选，所述矿化液的主要成分为26.1mg/ml聚丙烯酸(poly acrylic acid，paa，m.w.≈450000da)、13.0mg/ml聚天冬氨酸(poly aspartic acid，pasp；m.w.≈7000-8000da)、43.5mm氯化钙和43.5mm十二水合磷酸一氢钠，溶液ph为7.4。
27.作为优选，冷冻干燥具体为先于-20℃预冷过夜，后冷冻干燥4-8小时。
28.与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：
29.本发明通过无机矿物原位矿化的方式，提升了dsis海绵状支架机械性能，同时维持了其良好的生物相容性和生物活性，赋予支架更优越的促成骨性能，为其在骨组织工程领域的应用提供了更多的可能。此外，本发明将冷冻干燥法与原位矿化方式相结合，使得无机矿物在支架内部分布更为均匀，并维持适宜细胞黏附、增殖与分化的微环境。并且，该制备方式较现有解决方案更加简便易行。
附图说明
30.图1为本发明实施例提供的m-dsis支架制备流程图；
31.图2为本发明实施例提供的dsis支架、m-dsis支架宏观形貌图；
32.图3为本发明实施例提供的dsis支架、m-dsis支架的电镜图；
33.图4为本发明实施例提供的dsis支架、m-dsis支架的水接触角示意图；
34.图5本发明实施例提供的m-dsis支架培养骨髓间充质干细胞的细胞增殖时间图；
35.图6为本发明实施例提供的m-dsis支架培养骨髓间充质干细胞的细胞活性图；
36.图7为本发明实施例提供的dsis支架、m-dsis支架的actin+dapi染色图；
37.图8为本发明实施例提供的m-dsis支架培养骨髓间充质干细胞成骨向分化的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，alp)染色和ars(alizarin red s，ars)染色图；
38.图9为本发明实施例提供的m-dsis支架培养骨髓间充质干细胞成骨向分化的alp和ars半定量结果图；
39.图10为本发明实施例提供的m-dsis支架成骨相关因子表达情况；
40.图11为本发明实施例提供的m-dsis支架修复大鼠颅骨骨缺损图；
41.图12为本发明实施例提供的三维重建分析成骨效果；
42.图13为本发明实施例提供的组化染色图。
具体实施方式
43.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
44.实施例1脱细胞猪小肠黏膜下层(dsis)支架的制备
45.取健康成年猪新鲜的近端空肠(猪小肠)，内容物挤出，冲洗干净后，去掉表面肠系膜，再次冲洗干净，将置于-80℃冷冻，解冻后用清水冲洗，纵向切开，按照同向顺序将黏膜层、外肌层和浆膜机械剥离，取剩余的黏膜下层和黏膜基底层部分，呈半透明状。经氯仿甲醇(1：1)(80转/分)12小时后，再行反复冲洗。再经triton x-100 37℃孵育12h，此后进行三
个冻融循环(-80℃预冻40分钟，37℃冻融40分钟)，再在37℃下使用dnase(50u/ml)/rnase(50μg/ml)处理2小时，进一步用0.5％十二烷基硫酸钠(sds)生理盐水孵育4小时，蒸馏水充分漂洗3次，最终得到湿态的脱细胞sis(dsis)。
46.将其机械剪碎至绿豆团块大小，液氮预冷两分钟后置于-80℃冷冻研墨仪中研磨至粉末状(湿态)，获得的dsis粉末置于冷冻干燥仪中冷冻干燥12小时，得到干燥的dsis粉末(dsis干粉)；将dsis干粉与醋酸(3％v/v)和胃蛋白酶(0.1％w/v)混合，磁力搅拌器搅拌24小时，配制成浓度为1％的dsis溶液。
47.将配制好的1％dsis溶液置于48孔板中，每孔300μl溶液，装有dsis溶液的孔板分别于-20℃和-80℃各预冷24小时，后置于冷冻干燥仪中冷冻干燥24小时。将所得支架置于1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺/n-羟基琥珀酰亚胺溶液[1-ethyl-3(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide/n-hydroxy succinimide，edc/nhs，50mm/25mm]中，edc/nhs溶液的乙醇溶剂(纯度为95％)，避光交联24小时，后去离子水清洗3遍，每遍5分钟，再次-20℃预冻24小时后转冷冻干燥过夜(8-12小时)，得到最终的dsis海绵状支架。
[0048]
实施例2仿生再矿化液的配制
[0049]
先将去离子水配制的40ml cacl2溶液(0.1m)与4ml pasp溶液(0.3g/ml)(体积比为10：1)混合以获得溶液i，后将去离子水配制的40ml na2hpo4溶液(0.1m)与8ml paa溶液(0.3g/ml)(体积比为5：1)混合以获得溶液ii，将溶液ii逐滴缓慢全部加入至溶液i中，加入过程中，溶液i的底液需持续搅拌，配制成偏黄橙色的澄清矿化液，随后使用10m naoh调节ph至7.4，高温高压消毒备用。
[0050]
实施例3再矿化支架(m-dsis)的制备
[0051]
将上述步骤制备的dsis海绵状支架置于6孔板中，每个孔中加入2个sis支架，向6孔板中每孔加入6-8ml矿化液至完全没过材料，每2-3天进行更换矿化液，保证矿化过程中矿化液始终完全没过支架材料，直至14天后去除矿化液，去离子水清洗3次，每次5分钟后将孔板于-20℃冷冻24小时，后置于冷冻干燥仪中冷冻干燥过夜(8-12小时)，得到m-dsis支架，其制备流程如图1所示，其宏观形貌图如图2所示，dsis(上)和m-dsis(下)支架均呈现出均质的海绵样外观，前者为米白色，后者为淡黄色。
[0052]
性能测试
[0053]
m-dsis支架的理化性能评估
[0054]
对上述制备成的m-dsis支架进行宏观形貌观察、sem、亲水性、压缩强度检测以评估支架的理化性能。上述实验结果表示m-dsis支架可见明显矿物质沉积，相较于dsis支架，机械性能显著提高。
[0055]
方法：
[0056]
1、采用扫描电镜(scanning electron microscopy，sem)观察支架的微观形貌(图3)。将dsis(左)、m-dsis(右)两组支架在液氮中脆断、喷金处理后置于样品台上，采用扫描电子显微镜sem(quanta 200f)在15kv的工作电压下观察支架表面的微观形貌。从图3结果可以看出dsis支架与m-dsis支架均呈现疏松多孔的三维结构，m-dsis支架胶原纤维增粗，孔隙内部及纤维表面见均匀沉积的矿物质晶体。
[0057]
2、采用水接触角评价亲水性：将dsis、m-dsis两组支架置于表面接触角测量仪平台上，将水滴垂直滴入两组样品表面，1秒后观察并记录水滴在支架表面的形状及接触角，
每组测量三个样品取平均值。定量结果可知，dsis(上)、m-dsis(下)均呈现亲水特征，如图4所示。
[0058]
m-dsis支架的体外生物性能评估
[0059]
对上述制备成的m-dsis支架进行细胞增殖(图5)、细胞活性(图6)、alp染色和ars染色图(图8)及其半定量结果(图9)、实时pcr检测(图10)以评估支架的生物性能。上述实验结果表示m-dsis支架具有良好的生物相容性，相较于sis支架，碱性磷酸酶活性及钙化结节的沉积显著提高。
[0060]
方法：
[0061]
1.细胞活性：以48孔板为模具制备sis、m-dsis两组支架，使用无菌pbs缓冲液将两组支架漂洗三次后置于紫外灯下照射6小时，后用最小必须培养基(minimum essential medium-α,α-mem)浸泡过夜。将人骨髓间充质干细胞(human bone marrow stromal stem cells，hbmscs)以2x104个/孔的密度接种在两组支架上。接种24小时后，使用am和pi试剂原液配制活/死细胞染液，充分混匀。将接种有hbmscs的各组支架使用pbs缓冲液轻轻冲洗2次，并加入活/死细胞工作液，避光孵育30分钟后采用激光共聚焦显微镜观察并拍照。结果显示绿色荧光代表活细胞，红色荧光代表死细胞，图6中可见两组活死细胞的分布及数目。两组支架的死细胞(红色)均较少，细胞活性良好，未见明显毒性。
[0062]
2.细胞增殖：采用同上所述的制备和消毒方法处理后，将hbmscs以2x104/孔的密度接种在两组支架上，分别于接种后1天、3天、5天、7天、9天和11天时，使用cck-8试剂盒检测两组支架上hbmscs的增殖情况，即使用酶标仪测定450nm波长处的吸光度。以培养时间为横坐标，od
450
值为纵坐标绘制细胞生长曲线。如图5所示，随着细胞培养时间的增加，两组支架的od值逐渐增加，即细胞在两组支架上均能良好增殖。m-dsis支架上的细胞增殖较快。
[0063]
3细胞粘附：以2
×
104/孔的密度在各组支架上接种hbmscs，分别在细胞接种后3天，采用4％多聚甲醛固定细胞15min，pbs洗涤3次，每次5民众，加入0.1％titon x-100 20min，pbs洗涤3次，每次5分钟，加入1％bsa封闭30min，加入fitc-鬼笔环肽进行细胞骨架actin染色，4℃孵育过夜，pbs洗涤3次5分钟，加入dapi进行细胞核染色，采用激光共聚焦显微镜观察hbmscs在各组支架上的形态。如图7所示，dsis(左)、m-dsis(右)两组支架上细胞形态呈现伸展，延伸出大量长而丰富的细胞突起和伪足粘附在细胞表面，m-dsis上细胞数量明显较多，细胞丝状伪足伸展充分，细胞之间相互连接更为密切。
[0064]
4.碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，alp)染色、及定量活性测定：采用同上所述的制备和消毒方法处理后，将hbmscs以4x10
^4
/孔的密度接种在两组支架上，采用成骨诱导培养基培养7天及14天后，使用alp染色试剂盒配置显色工作液，每孔加入等量工作液，避光孵育，pbs终止显色后牌照及显微镜下记录。其次使用alp活性定量试剂盒定量检测样品中碱性磷酸酶活性。使用酶标仪测定各孔在520nm波长下的od值并计算每克蛋白所产生的alp活性(单位：u/gprot)。如图8和9结果显示，成果诱导后第7天及14天，m-dsis支架组大体观察染色更深，与镜下结果及定量结果相一致。且14天时更为明显。
[0065]
5.茜素红(alizarin red s，ars)评价细胞在不同支架上的成骨能力，采用同上所述的制备和消毒方法处理后，将hbmscs以4x10
^4
/孔的密度接种在两组支架上，采用成骨诱导培养基培养21天后，使用茜素红染色观察样品中钙结节数目。使用酶标仪测定各孔在562nm波长下的od值，进行ars染色结果的半定量。如图8和9结果显示，m-dsis支架组ars结
果着色较深，在显微镜下可以观察到更多的矿化结节沉积，与半定量结果相一致，结果具有显著性差异。
[0066]
6.实时定量pcr(quantitative real-time pcr，qrt-pcr)检测：以12孔板为模具制备dsis、m-dsis两组支架，使用无菌pbs缓冲液将两组支架漂洗三次后置于紫外灯下照射6小时，后用最小必须培养基(minimum essential mediun-α,α-mem)浸泡过夜。将hbmscs以1x105/孔的密度接种在两组支架上，采用成骨诱导培养基培养7天及14天后，使用trizol试剂从hbmscs中提取总rna，使用实时定量pcr试剂盒和实时定量pcr仪检测成骨相关基因alp、bmp-2、col-1、osx、opn、runx-2的表达。以平均值
±
标准差计算结果，绘制直方图。如图10结果显示，m-dsis支架组经成果诱导第7天，显著提高了alp、bmp2、col-1、osx的基因表达量。第14天，显著提高了alp、bmp-2、osx、opn、runx2的基因水平。
[0067]
表：pcr引物序列
[0068][0069]
m-dsis支架的体内成骨性能评估
[0070]
按照目标缺损大小修剪材料，使材料面积略大于缺损区，采用环氧乙烷消毒。如图11所示，构建sd大鼠颅骨缺损模型：spf级sd大鼠(雄性，年龄6-8周，体重200-300g)检测无支架组及两组支架体内成骨效果。使用戊巴比妥钠(50mg/kg)麻醉sd大鼠后后，常规消毒铺巾，于颅中缝处正中处依次分离皮肤、肌层及骨膜，暴露骨面。使用牙科手机在颅中缝两侧制造直径为5mm的圆形骨缺损，术中随时用生理盐水冷却。在缺损区域分别放置dsis支架及m-dsis支架，分层缝合。将大鼠置于37℃恒温台复苏，术后观察大鼠状况及伤口愈合情况。12周后处死大鼠，颅骨取材后micro-ct扫描，使用acquisition workplace与inveon research workplace软件进行重建与分析。三维重建分析成骨效果(图12)。表明12w后，m-dsis组缺损区域已大部分修复，明显优于dsis组和空白对照组。上述步骤观察结束后，将样本进行edta脱钙3-4周、梯度酒精脱水，浸蜡，石蜡包埋、组织切片机切片(厚度为5μm)，二甲苯-酒精脱蜡至水，苏木精-伊红染色，封片，显微镜下观察评价。结果发现，术后12周时，m-dsis支架组在骨缺损边缘及中心可见大量高密度的新生骨组织影像，其成骨密度与周围颅骨密度相似，其范围远大于dsis支架组及空白对照组(图13)。研究结果初步证实，m-dsis支架相较于sis支架具有更好的成骨效果。