多巴胺纳米材料在调控巨噬细胞极化上的应用的制作方法

1.本发明属于纳米医学领域，涉及一种多巴胺纳米材料在调控巨噬细胞极化上的应用。


背景技术：

2.肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages，tams)是肿瘤微环境中最多的免疫细胞，约占肿瘤间质免疫细胞总数的50％以上，是浸润在肿瘤组织中的巨噬细胞，是影响肿瘤进展、转移和复发的关键因素之一，诱导t细胞功能失调，在恶性肿瘤的发生发展、侵袭转移、免疫逃逸及其血管和淋巴管生成等过程中发挥重要作用。
3.根据其分子表型与功能特征，活化的巨噬细胞可分成m1型巨噬细胞和m2型巨噬细胞两大类型。m1型巨噬细胞能分泌产生il-1、tnf-α、il-6、ifn-γ及inos等多种促炎因子，抵御病原体入侵，保持抗原呈递能力，是一种监视肿瘤病变功能、参与th1型免疫应答的巨噬细胞。但当肿瘤微环境中存在il-13、il-4或tgf-β等因子时，会诱导m1型巨噬细胞向m2型分化。m2型巨噬细胞通过分泌表皮细胞生长因子、趋化因子等促进肿瘤细胞生长，限制免疫反应、诱导血管生成和组织修复方面起着关键作用，参与肿瘤免疫逃逸，加剧了免疫抑制微环境的形成。这两类巨噬细胞可因组织微环境的改变而相互转化。因此，逆转m1向m2型巨噬细胞转化，提高m1/m2型巨噬细胞比例，有利于改善肿瘤免疫抑制微环境，促进免疫细胞对肿瘤的识别，提高免疫治疗及联合治疗疗效，具有重要的意义。
4.目前，针对tams极化转变的研究已取得了重大进展。单核细胞在集落刺激因子诱导下可发育成m2型巨噬细胞；应用干扰素ifn-γ和脂多糖lps可诱导m1型巨噬细胞高表达；m1型巨噬细胞通过抑制nf-κb细胞通路逆转m2型巨噬细胞进而诱导肿瘤上皮间质转化；胸腺肽α-1可通过参与调控巨噬细胞迅速识别和清除凋亡细胞，促使m2型转变为m1型，从而增强抗癌疗效。然而这些调控因子或药物作用局限，没有肿瘤靶向性，无法实现可视化；为了提高疗效，反复多次给药会增加机体系统毒性，影响其进一步应用。
5.到目前为止尚无多巴胺纳米材料在调控tams极化的研究及应用的相关文献报道。


技术实现要素：

6.发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供多巴胺纳米材料在调控巨噬细胞极化上的应用。
7.为了解决上述技术问题，本发明公开了多巴胺纳米材料在调控巨噬细胞极化上的应用，其中，所述多巴胺纳米材料调控巨噬细胞极化、提高m1/m2巨噬细胞比例；所述多巴胺纳米材料通过如下方法制备得到：
8.(1)将1.0-2.0g的表面活性剂f127和0.5-1g的盐酸多巴胺溶解于100-200ml的水和无水乙醇的混合液中，水和无水乙醇的体积比为1:1；室温搅拌，待混合液澄清，将2-4ml的三甲苯加入到搅拌的混合液中，低速搅拌30-40min，形成乳白色纳米溶液，随后5-10ml的氨水加入到混合液中，诱导多巴胺聚合并继续搅拌30-60min，形成树突状多巴胺纳米材料；
9.(2)用10-20ml无水乙醇洗涤聚合物，洗涤3-4次，离心，去除上清液，留黑色沉淀，用5-10ml无水乙醇溶解沉淀，将沉淀溶液在60-80℃下水浴萃取，搅拌条件为500-600转/min，每次萃取时间为3-5个小时，萃取结束后离心，萃取结束即留沉淀，无水乙醇溶解沉淀，重复萃取步骤，共萃取、离心若干次，得到多巴胺纳米材料(polydopamine nanoparticles，pda)储备液。
10.优选地，步骤(1)中，室温搅拌的搅拌条件为：1100-1200转/min，低速搅拌的条件为500-600转/min。
11.步骤(1)中，氨水加入到混合液中的滴速为65-75滴/min。
12.步骤(2)中，洗涤后离心条件为14000-15000rpm，时间为20-30min。
13.步骤(2)中，萃取结束后离心条件为14000-15000rpm，离心20-30min。
14.有益效果：与现有技术相比，本技术具有如下优点：
15.(1)现有技术仅可调节巨噬细胞极化，若联合其他治疗方式，需反复、多次给予其他药物配合治疗，增加了多药带来的潜在风险或耐药性，本发明的技术是依靠材料本身即可逆转巨噬细胞极化，可同时实现光热治疗。因纳米材料的表面特性可装载其他药物，实现一次性给药及多模态联合治疗；
16.(2)现有技术使用的免疫调控药物没有肿瘤靶向性，而纳米材料具有在肿瘤部位的高选择通透性和滞留效应，使得纳米材料及其负载的药物具有被动靶向肿瘤的作用。
17.(3)现有技术不具有可视化功能，本发明的多巴胺纳米材料具有磁共振成像和光声成像的特性，可以同时实现治疗过程中的可视化监测。
附图说明
18.图1为实施例1制备的多巴胺纳米材料(polydopamine nanoparticles，pda)，图1为pda的透射电镜照片(左)及在(模拟)肿瘤酸性条件下(ph 6.0 pbs中)pda降解的透射电镜照片(右)；
19.图2为pda体外磁共振成像和光声成像结果图；
20.图3为pda体内靶向肿瘤、磁共振成像和光声成像结果图；
21.图4为高效液相色谱仪检测pda降解成分结果；
22.图5为pda对巨噬细胞raw264.7极性影响的pcr结果；
23.图6为本发明在实施工艺条件下制得的pda孵育巨噬细胞raw264.7，提取细胞总蛋白，进行western blot检测的结果图；
24.图7 western blot各条带的灰度值的结果图。
具体实施方式
25.下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
26.实施例1多巴胺纳米材料(polydopamine nanoparticles，pda)的制备。
27.将1.0g的表面活性剂f127和0.5g的盐酸多巴胺溶解于100ml的水和无水乙醇的混合液中，水和无水乙醇的体积比为1:1。室温用力搅拌至澄清溶液，搅拌条件为1200转/min。将2ml的三甲苯加入到搅拌后的混合液中，低速搅拌30分钟，搅拌条件为500转/min，形成肉
眼可见的乳白色纳米溶液；随后5ml的氨水(28wt％-30wt％)在10s内逐滴加入到乳白色纳米溶液中，诱导多巴胺聚合，继续搅拌30分钟，形成树突状聚多巴胺纳米球聚合物。用10ml无水乙醇洗涤聚合物，洗涤三次，洗涤条件离心14000rpm，时间是20分钟。去除上清液，留黑色沉淀，用5ml无水乙醇溶解沉淀。将沉淀溶液在60℃下水浴萃取，搅拌条件为500转/min，每次萃取时间为3个小时，萃取结束即14000rpm离心20分钟，留沉淀，无水乙醇溶解沉淀，重复萃取步骤。共萃取、离心3次，得到用无水乙醇溶解的多巴胺纳米材料pda储备液，经过测算浓度为4mg/ml。图1为制备的pda的透射电镜照片，从电镜图片上可以提示pda粒径在80nm左右(图标100nm)，具有良好的分散性和均一的尺寸。将合成的pda置于ph 6.0pbs(模拟肿瘤酸性微环境)溶液下搅拌24-48小时，搅拌结束后对其进行透射电镜拍摄，发现pda发生了降解，因此多巴胺纳米材料具有可降解性。
28.实施例2 pda具有靶向肿瘤、进行磁共振成像和光声成像的作用。
29.我们将pda材料配成1mg/ml的溶液，将其装满置于2ml的小离心管中，水为正常对照组。将样品分别进行磁共振和光声成像，材料组与正常组对比显示出高信号，证实材料具有双模态成像特性(图2)。
30.进一步培养乳腺癌4t1细胞，建立乳腺癌皮下瘤动物模型。将100μl pda(4mg/ml)溶液尾静脉注射入荷瘤小鼠体内，并在不同时间点对肿瘤进行磁共振和光声成像。随着时间的延长，材料逐渐在肿瘤处富集，信号强度逐渐增强，并在尾静脉注射6小时后达到高峰。进一步证实pda能够通过被动靶向运输作用到达肿瘤，且能同时进行磁共振和光声成像(图3)。
31.(1)pda用于体外磁共振成像(magnetic resonance imaging，mri)及光声成像(photoacoustic imaging，pai)
32.将1ml(1mg/ml)的pda溶液放入2ml的试管中，水为正常对照，分别用7.0t微型mri仪和多光谱光声层析成像系统在808nm波长下进行扫描并拍摄图像。
33.(2)乳腺癌细胞培养
34.三阴性乳腺癌细胞4t1细胞(american type culture collection，atcc)在含有1％青霉素/链霉素和10％胎牛血清的培养基中培养，胰酶消化4-5min，传代比率是1:3，细胞放置在37℃的5％co2细胞培养箱中培养。
35.(3)乳腺癌皮下瘤动物模型构建
36.取6周龄的雌性小白鼠，在白鼠右侧皮下注射约5
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106个三阴性乳腺癌细胞4t1，建立三阴性乳腺癌皮下瘤动物模型。待肿瘤大小约为100mm3后，将白鼠随机分组。
37.(4)体内磁共振及光声成像
38.在建立上述乳腺癌肿瘤动物模型后，选择6只荷瘤小鼠，每只小鼠尾静脉注射100μl 4mg/ml的pda。在尾静脉注射0、2、4、6、8及12小时后，分别用7.0t mri和多光谱光声断层成像系统对小鼠肿瘤进行mri和pai。利用相应成像软件对每只小鼠的成像信号进行捕获和分析，拍摄磁共振成像或光声成像图片。
39.实施例3 pda在调控巨噬细胞极化上的应用。
40.我们进一步将纳米材料降解后的溶液进行高效液相色谱分析，经过成分比对和多巴胺标准曲线定量检测，发现pda纳米材料降解后有多巴胺成分释放，进一步证实材料具有良好的降解性，且降解成分含有多巴胺(图4)。
41.已有文献报到研究，多巴胺可通过抑制pka/p38信号通路的激活，进而阻断m2型巨噬细胞极化，降低tams的促瘤炎症特性。因此我们将pda及单纯多巴胺孵育巨噬细胞，检测其在基因及蛋白水平对巨噬细胞极化的影响。
42.(1)细胞培养
43.巨噬细胞raw264.7(中国科学院细胞库，目录号scsp-5036)在含有1％青霉素/链霉素和10％胎牛血清的dmem培养基中分裂生长，待细胞汇合度达到90％以上，用刮刀或外力吹打处理消化，避免胰酶消化造成的不良影响，传代比率是1:2，并放置在37℃、5％的co2的细胞培养箱中培养。
44.(2)pcr检测
45.为观察巨噬细胞raw264.7经过pda处理后目标基因的表达，将raw264.7细胞培养在6孔板中，待细胞汇合度达到70％-80％后，添加30-50μg/ml浓度的pda及单纯多巴胺，正常对照组不添加材料。
46.吸出每个孔中的培养基，加入1-2ml预冷的pbs，洗涤后移除pbs。每孔加入1-2ml的rna提取液，枪头吹打破碎细胞，并将液体转移到1.5ml离心管中，加入250-300μl三氯甲烷，混匀静置3-5min。4℃条件下，离心10-15min，转速为12000-13000rpm。将上清转移到新的1.5ml离心管中，加入0.8-1倍体积的异丙醇，充分混匀。吸除液体，用1.5-2ml 75％乙醇洗涤沉淀，4℃条件下，离心10-15min，转速为12000-13000rpm。离心留沉淀，并在超净台上吹干3-5min，加入15-20μl的water nuclease-free溶解rna，55℃孵育5-10min。使用nanodrop 2000检测rna浓度及纯度，使rna终浓度为100-500ng/μl。
47.随后进行逆转录，配置20μl反应体系：5
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reaction buffer(4μl)，oligo(dt)18primer(100μm，0.5μl)，random hexamer primer(100μm，0.5μl)，rt enzyme mix(1μl)，total rna(10μl)，rnase free water补足体积到20μl。逆转录程序25℃5min，42℃30min，85℃5s。
48.进一步进行定量pcr，将2
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qpcr mix(7.5μl)，2.5μm基因引物(上游+下游，1.5μl)(对应如表1所示)，反转录产物(cdna，2.0μl)，water nuclease-free(4.0μl)加入到pcr管中。pcr扩增95℃，30s预变性，95℃，15s变性，60℃，30s退火/延伸，重复40个循环，溶解曲线从65℃到95℃，每升温0.5℃，采集一次荧光信号。
49.实时定量pcr检测时根据实验需求设计的引物信息如表1所示：
50.表1
51.引物名称引物序列(5'-3')片段长度(bp)m-gapdh-scctcgtcccgtagacaaaatg133m-gapdh-atgaggtcaatgaaggggtcgt
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m-cd80-sgaccctcctgatagcaagaacac163m-cd80-acgaaggtaaggctgttgtttgtt
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m-inos(1)-sagctcgggttgaagtggtatg245m-inos(1)-acacagccacattgatctccg
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m-arg1(4)-sctggggattggcaaggtgat93m-arg1(4)-acagcccgtcgacatcaaag
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m-cd163(3)-saggaaaccaatcccagacacta135m-cd163(3)-acgaccacctccacctaccaa 52.结果处理使用δδct法：a＝ct(目的基因，待测样本)-ct(内标基因，待测样本)，b＝ct(目的基因，对照样本)-ct(内标基因，对照样本)，k＝a-b，表达倍数＝2-k
。
53.图5为pda孵育巨噬细胞raw264.7，提取细胞总rna，进行pcr分析的结果。结果显示相对于pbs对照组，pda处理组inos和cd80均高表达(m1巨噬细胞引物)，cd163和arg1均低表达(m2巨噬细胞引物)，进一步证明pda可以在基因水平影响巨噬细胞的极性表达变化。
54.(3)western blot检测
55.为观察巨噬细胞raw264.7经过pda处理后目标蛋白的表达，将raw264.7细胞培养在6孔板中，待细胞汇合度达到70％-80％后，添加30-50μg/ml浓度的pda及单纯多巴胺，正常对照组不添加材料。pda与细胞共孵育12-24h后，用刮刀或外力吹打细胞消化2-3min，用pbs洗涤三次，转速为1000-1200rpm，离心3-5min。离心后的细胞沉淀加入100-150μl的细胞裂解液，混匀，在细胞超声仪上将细胞超碎，12000-13000rpm低温离心20-30min取上清。
56.下一步进行蛋白定量，采用bca蛋白定量分析法，按照说明书以标准品牛血清白蛋白为参考做标准曲线，然后将10-20μl待测的细胞样品转移进96孔板，加入150-200μl bca工作液，充分混匀后在37℃培养箱中孵育20-30min。酶标仪测量每个样品在562nm处的吸光值，根据标准品牛血清白蛋白的标准曲线计算待测样品的蛋白浓度。用细胞裂解液调至蛋白浓度一致，并加入总体积1/5的上样缓冲液。将待测样品放置于100℃水浴锅中煮5-10min使蛋白变性。
57.接着进行sds-page电泳，取出一块胶，放置入电泳槽中，加入电泳缓冲液，将煮过的蛋白样品分别上样，并在空白孔里加入2-3μl的蛋白marker，100v恒压电泳30-40min左右。接着进行转膜，将胶取出转印至疏水性聚偏二氟乙烯膜上，低温恒流转膜1.5-2h。转膜结束后，将膜取出并用清洗液洗涤3-4次，每次3-5min，然后浸没于10-15ml含5％脱脂奶粉的缓冲液中室温缓慢震荡，封闭1-2小时。接着用清洗液洗涤3-4次，每次3-5min。洗涤后孵育一抗，抗体用一抗稀释液稀释，抗体为抗inos、cd80、cd163及arg1，稀释1000倍，β-actin设为内参蛋白，稀释1000倍，4℃孵育过夜。
58.次日，将膜取出，清洗液洗涤3-4次，每次3-5min，孵育与辣根过氧化物偶联的二抗，二抗稀释1000倍，室温缓慢震荡1-2小时。二抗孵育结束后，用清洗液洗涤膜3-4次，滴加发光液，用全自动化学发光/荧光图像分析系统进行曝光成像，用imagej软件对免疫反应条带进行定量分析。图6为pda孵育巨噬细胞raw264.7，提取细胞总蛋白的western blot检测结果。结果显示相对于pbs对照组，pda和多巴胺处理组inos和cd80均高表达(m1巨噬细胞标志物)，cd163和arg1均低表达(m2巨噬细胞标志物)，进一步证明pda可以在蛋白水平影响巨噬细胞的极性表达变化。进一步分析western blot各条带的灰度值，如图7所示，结果与图6一致，pda和多巴胺处理组较之pbs对照组inos和cd80呈高表达，cd163和arg1呈低表达，证实经pda处理刺激后，m1巨噬细胞表达提高，m2巨噬细胞表达降低，pda可逆转m1/m2极性比例。
59.本发明设计的多巴胺纳米材料可提高m1型巨噬细胞表达，抑制m2型巨噬细胞转化，提示在材料合成过程中仍然保留了部分多巴胺的生理功能；另外，多巴胺纳米材料可在肿瘤微环境中解聚，也可以在一定程度上释放多巴胺，发挥其在抑制巨噬细胞极化方面的作用。
60.本发明的研究意义在于利用纳米载体自身特性即可重塑tams极化，逆转肿瘤微环境中m1/m2巨噬细胞比例，改善巨噬细胞功能，提高免疫应答，避免免疫逃逸。此外，纳米载体具有良好的生物相容性和可降解性，可被动靶向肿瘤、同时实现磁共振和光声成像等功能，一药多用，兼具多种功能，有望推广到其他免疫抑制型恶性肿瘤的调控中，实现联合靶向治疗或可视化监控。
61.本发明提供了一种多巴胺纳米材料调控巨噬细胞极化的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。