火把花根及其提取物在制备治疗抗疲劳药物中的应用的制作方法

1.本发明涉及火把花根提取物的制备方法和火把花根提取物的新用途，具体涉及火把花根及其提取物在制备治疗抗疲劳药物中的应用。


背景技术：

2.现代医学解释疲劳产生的机制主要包括能量耗竭、代谢产物堆积、离子代谢紊乱、保护性抑制、氧自由基损伤-脂质过氧化学说。能量耗竭、代谢产物堆积是研究的主要关注点。随着社会的发展，人们的生活节奏加快，从而出现“不明原因的”疲劳，久之发展为慢性疲劳综合征。此外，慢性疾病也是引起疲劳的重要因素，如糖尿病、类风湿性关节炎等。补充营养物质，药物调理是目前抗疲劳的主要手段。
3.火把花为卫矛科雷公藤属植物昆明山海棠tripterygium hypoflaucum（levl.） hutch的干燥根。分布于浙江、江西、湖南、四川、贵州、云南。具有祛风除湿，活血止血，舒筋接骨，解毒杀虫之功效。虽然，对火把花的化学成分、药理活性都有研究，但关于疲劳方面的研究未见相关资料报道。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题在于提供火把花根及其提取物在制备治疗抗疲劳药物中的应用。
5.为解决以上技术问题，本发明采用以下技术方案实现：火把花根提取物在制备治疗抗疲劳药物中的应用。
6.前述的火把花根提取物在制备治疗抗疲劳药物中的应用，所述火把花根提取物分子量为7750d。
7.前述的火把花根提取物在制备治疗抗疲劳药物中的应用，所述火把花根提取物的制备方法是采用水提醇沉法提取收集沉淀，于deae-52纤维素柱水洗脱，收集水相，再用3500d透析袋透析回收水相提取物，浓缩，冷冻干燥，得火把花根提取物。
8.具体的说，前述的火把花根提取物在制备治疗抗疲劳药物中的应用，所述火把花根提取物的制备方法按以下步骤进行：（a）称取火把花根药材粉碎，加入纯化水，加热提取，收集提取液，得a品；（b）再于火把花根药渣中加入纯化水，加热提取，收集提取液与a品合并，浓缩后，离心，弃沉淀，用乙醇醇沉过夜，收集沉淀，得b品；（c）取b品，加入纯化水溶解，溶解后离心，弃沉淀，收集溶液，置于分液漏斗中，加入sevag试剂，振摇，离心，取上层，再加入sevag试剂，振摇，离心，取上层，将上层浓缩后，冷冻干燥，得火把花根提取物粗品，即c品；（d）称取c品，溶于纯水中，离心，弃沉淀，收集上清液，上样于deae-52纤维素柱，使用水洗脱，收集洗脱液，浓缩，得d品；（e）将d品装入3500d透析袋，两端夹闭，放于2000 ml烧杯，加纯水，置实验层析柜，
收集透析袋内液体，浓缩，冷冻干燥，得火把花根提取物。
9.更具体的说，前述火把花根提取物的制备方法按以下步骤进行：（a）称取火把花根药材50-150g粉碎，加入1000ml纯化水，70-90℃提取3小时，收集提取液，得a品；（b）再于火把花根药渣中加入1000 ml纯化水，70-90 ℃提取2-4小时，收集提取液与a品合并，浓缩后，在3500r/min条件下离心15 min，弃沉淀，用70 %乙醇醇沉过夜，收集沉淀，得b品；（c）称取b品5-15g，加入100ml的纯化水溶解，溶解后于3500r/min条件下离心15 min，弃沉淀，收集溶液，置于分液漏斗中，加入sevag试剂20-40ml，振摇60 min，在3500r/min条件下离心15 min，取上层，再加入sevag试剂20-40ml，振摇30 min，在3500r/min条件下离心15 min，将上层浓缩后，冷冻干燥，得火把花根提取物粗品，即c品；（d）称取c品1-3g，溶于10 ml纯水中，3500 r/min离心10min，弃沉淀，收集上清液，上样于deae-52纤维素柱，使用水洗脱，流速为10 ml/min，收集洗脱液，浓缩，得d品；（e）将d品装入3500d透析袋，两端夹闭，放于2000 ml烧杯，加纯水，置实验层析柜，分别在3小时、8小时、24小时后各换纯化水一次，收集3次透析后透析袋内液体，浓缩，冷冻干燥，得火把花根提取物。
10.更具体的说，前述火把花根提取物的制备方法按以下步骤进行：（a）称取火把花根药材100g粉碎，加入1000ml纯化水，80 ℃提取3小时，收集提取液，得a品；（b）再于火把花根药渣中加入1000 ml纯化水，80 ℃提取3小时，收集提取液与a品合并，浓缩后，在3500r/min条件下离心15 min，弃沉淀，用70 %乙醇醇沉过夜，收集沉淀，得b品；（c）称取b品10g，加入100ml纯化水溶解，溶解后于3500r/min条件下离心15 min，弃沉淀，收集溶液，置于分液漏斗中，加入sevag试剂30ml，振摇60 min，在3500r/min条件下离心15 min，取上层，加入sevag试剂30ml，振摇30 min，在3500r/min条件下离心15 min，将上层浓缩后，冷冻干燥，得火把花根提取物粗品，即c品；（d）称取c品2 g，溶于10 ml纯水中，3500 r/min离心10min，弃沉淀，收集上清液，上样于deae-52纤维素柱，使用水洗脱，流速为10 ml/min，收集洗脱液，浓缩，得d品；（e）将d品装入3500d透析袋，两端夹闭，放于2000 ml烧杯，加纯水，置实验层析柜，分别在3小时、8小时、24小时后各换纯化水一次，收集3次透析后透析袋内液体，浓缩，冷冻干燥，得火把花根提取物。
11.更具体的说，前述sevag试剂为氯仿：正丁醇=4ml:1ml。
12.火把花根在制备治疗抗疲劳药物中的应用。
13.一种治疗抗疲劳的药物，所述药物中包括火把花根提取物或火把花根。
14.一种治疗抗疲劳的药物，所述药物中主要由火把花根提取物或火把花根制备而成。
15.有益效果：本发明从火把花根的提取工艺做研究，从而分离提取出火把花根提取物，并通过实验确定火把花根提取物的抗疲劳功效，为火把花根在治疗疲劳相关疾病中的深入研究开
发提供实验依据和启示。
附图说明
16.图1 火把花根提取物扫描电镜观察结果；图2 火把花根提取物uv-vis扫描结果；图3 火把花根提取物对小鼠疲劳转棒时间的影响；图4 火把花根提取物对小鼠力竭游泳时间的影响；图5 火把花根提取物对力竭游泳后小鼠血糖的影响；图6 火把花根提取物对力竭游泳后小鼠病理变化的影响(a为he染色
×
200的正常对照组，b为pas染色
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200的正常对照组，c为he染色
×
200的疲劳对照组，d为pas染色
×
200的疲劳对照组，e为he染色
×
200的火把花根提取物组，f为pas染色
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200的火把花根提取物组)；图7 火把花根提取物对力竭游泳后小鼠骨骼肌pi3k的影响；图8 火把花根提取物对力竭游泳后小鼠骨骼肌gsk-3β的影响。
17.为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但所举实施例不作为对本发明的限定。
具体实施方式
18.实施例1：工艺：1、提取物制备：（a）称取火把花根药材100g粉碎，加入1000ml纯化水，80 ℃提取3小时，收集提取液，得a品；（b）再于火把花根药渣中加入1000 ml纯化水，80 ℃提取3小时，收集提取液与a品合并，浓缩后，在3500r/min条件下离心15 min，弃沉淀，用70 %乙醇醇沉过夜，收集沉淀，得b品；（c）称取b品10g，加入100ml纯化水溶解，溶解后于3500r/min条件下离心15 min，弃沉淀，收集溶液，置于分液漏斗中，加入sevag试剂30ml，振摇60 min，在3500r/min条件下离心15 min，取上层，加入sevag试剂30ml，振摇30 min，在3500r/min条件下离心15 min，将上层浓缩后，冷冻干燥，得火把花根提取物粗品，即c品；（d）称取c品2 g，溶于10 ml纯水中，3500 r/min离心10min，弃沉淀，收集上清液，上样于deae-52纤维素柱，使用水洗脱，流速为10 ml/min，收集洗脱液，浓缩，得d品；（e）将d品装入3500d透析袋，两端夹闭，放于2000 ml烧杯，加纯水，置实验层析柜，分别在3小时、8小时、24小时后各换纯化水一次，收集3次透析后透析袋内液体，浓缩，冷冻干燥，得火把花根提取物。
19.sevag试剂为氯仿：正丁醇=4ml:1ml。
20.2、制剂制备：取火把花根提取物100g，加入制成量10%的淀粉混合均匀，用75%的乙醇制粒，干燥，整粒，填装胶囊，即得胶囊剂。
21.用法用量：口服，一日3次，每次以火把花根提取物计0.2-0.5g。
22.实施例2：工艺：1、提取物制备：（a）称取火把花根药材50g粉碎，加入1000ml纯化水，70℃提取3小时，收集提取液，得a品；（b）再于火把花根药渣中加入1000ml纯化水，70℃提取2-4小时，收集提取液与a品合并，浓缩后，在3500r/min条件下离心15 min，弃沉淀，用70 %乙醇醇沉过夜，收集沉淀，得b品；（c）称取b品5g，加入100ml的纯化水溶解，溶解后于3500r/min条件下离心15 min，弃沉淀，收集溶液，置于分液漏斗中，加入sevag试剂20ml，振摇60 min，在3500r/min条件下离心15 min，取上层，再加入sevag试剂20ml，振摇30 min，在3500r/min条件下离心15 min，将上层浓缩后，冷冻干燥，得火把花根提取物粗品，即c品；（d）称取c品1g，溶于10 ml纯水中，3500 r/min离心10min，弃沉淀，收集上清液，上样于deae-52纤维素柱，使用水洗脱，流速为10 ml/min，收集洗脱液，浓缩，得d品；（e）将d品装入3500d透析袋，两端夹闭，放于2000 ml烧杯，加纯水，置实验层析柜，分别在3小时、8小时、24小时后各换纯化水一次，收集3次透析后透析袋内液体，浓缩，冷冻干燥，得火把花根提取物。
23.sevag试剂为氯仿：正丁醇=4ml:1ml。
24.2、制剂制备：取火把花根提取物100g，加10%混合辅料，混合辅料由糊精和羧甲基纤维素钠1：1的比例混合制成，用70%的乙醇为湿润剂制粒，干燥，压片，薄膜包衣，即得片剂。
25.用法用量：口服，一日3次，每次以火把花根提取物计0.2-0.5g。
26.实施例3：工艺：1、提取物制备：（a）称取火把花根药材150g粉碎，加入1000ml纯化水， 90℃提取3小时，收集提取液，得a品；（b）再于火把花根药渣中加入1000 ml纯化水， 90℃提取4小时，收集提取液与a品合并，浓缩后，在3500r/min条件下离心15 min，弃沉淀，用70 %乙醇醇沉过夜，收集沉淀，得b品；（c）称取b品15g，加入100ml的纯化水溶解，溶解后于3500r/min条件下离心15 min，弃沉淀，收集溶液，置于分液漏斗中，加入sevag试剂40ml，振摇60 min，在3500r/min条件下离心15 min，取上层，再加入sevag试剂40ml，振摇30 min，在3500r/min条件下离心15 min，将上层浓缩后，冷冻干燥，得火把花根提取物粗品，即c品；（d）称取c品3g，溶于10 ml纯水中，3500 r/min离心10min，弃沉淀，收集上清液，上样于deae-52纤维素柱，使用水洗脱，流速为10 ml/min，收集洗脱液，浓缩，得d品；（e）将d品装入3500d透析袋，两端夹闭，放于2000 ml烧杯，加纯水，置实验层析柜，分别在3小时、8小时、24小时后各换纯化水一次，收集3次透析后透析袋内液体，浓缩，冷冻
干燥，得火把花根提取物。
27.sevag试剂为氯仿：正丁醇=4ml:1ml。
28.2、制剂制备：取火把花根提取物100g，加蔗糖1.5份，用90%乙醇为润湿剂制颗粒，制成颗粒后于80℃干燥，再过12目筛1次，并用60目筛分出细粉，即得颗粒剂。
29.用法用量：口服，一日3次，每次以火把花根提取物计0.2-0.5g。
30.实施例4：工艺：1、提取物制备：（a）称取火把花根药材80g粉碎，加入1000ml纯化水，80℃提取3小时，收集提取液，得a品；（b）再于火把花根药渣中加入1000 ml纯化水，85 ℃提取4小时，收集提取液与a品合并，浓缩后，在3500r/min条件下离心15 min，弃沉淀，用70 %乙醇醇沉过夜，收集沉淀，得b品；（c）称取b品5g，加入100ml的纯化水溶解，溶解后于3500r/min条件下离心15 min，弃沉淀，收集溶液，置于分液漏斗中，加入sevag试剂30ml，振摇60 min，在3500r/min条件下离心15 min，取上层，再加入sevag试剂40ml，振摇30 min，在3500r/min条件下离心15 min，将上层浓缩后，冷冻干燥，得火把花根提取物粗品，即c品；（d）称取c品1g，溶于10 ml纯水中，3500 r/min离心10min，弃沉淀，收集上清液，上样于deae-52纤维素柱，使用水洗脱，流速为10 ml/min，收集洗脱液，浓缩，得d品；（e）将d品装入3500d透析袋，两端夹闭，放于2000 ml烧杯，加纯水，置实验层析柜，分别在3小时、8小时、24小时后各换纯化水一次，收集3次透析后透析袋内液体，浓缩，冷冻干燥，得火把花根提取物。
31.sevag试剂为氯仿：正丁醇=4ml:1ml。
32.2、制剂制备：取火把花根提取物200g，加入制成量10%的淀粉混合均匀，用75%的乙醇制粒，干燥，整粒，填装胶囊，即得胶囊剂。
33.用法用量：口服，一日3次，每次以火把花根提取物计0.2-0.5g。
34.申请人对火把花根提取物抗疲劳作用机制进行了实验研究。并通过以下实验对火把花根提取物的制备分析及抗疲劳机制进行研究：1、材料1.1仪器fa1004电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；df-101s集热式恒温加热磁力搅拌器（上海秋佐科学仪有限公司）；wk-150 小型超微粉碎机（青州精诚医药装备制造有限公司）；eyela n-1300旋转蒸发仪（日本东京理化器械株式会社）；avanti jxn-26落地离心机（美国beckman coulter有限公司）；btp-9el00x冷冻干燥机（美国sp scientific公司）；puriflash 450中压制备色谱（法国interchim公司）；
疲劳转棒仪（成都泰盟科技有限公司）；mias-2000病理图像处理系统（四川大学图像处理国家研究所）；rt-pcr仪（bio-rad）。1.2试药试剂无水乙醇(ar)（国药集团化学试剂有限公司）；正丁醇(ar)（国药集团化学试剂有限公司）；氯仿(ar)（国药集团化学试剂有限公司）；二乙胺乙基纤维素-52(deae-52)（上海源叶生物科技有限公司）；透析袋md44(截留分子量3500)（索莱宝生物科技有限公司）；引物（南京金瑞斯生物科技公司）；血糖试条（北京怡成生物电子科技有限公司）；病理糖原染色（pas）试剂盒（珠海贝索生物技术有限公司）。2、火把花根提取物的制备及分析2.1、火把花根提取物的制备按照实施例1的方法提取火把花根提取物火把花根提取物扫描电镜观察表面形态（
×
1500倍），见图1。
[0035] 2.2、结构表征2.2.1分子量配制2mg/ml的火把花根提取物溶液，采用hpgpc分析方法，测定火把花根提取物的分子量。
[0036]
结果：火把花根提取物分子量为7750d。
[0037] 2.2.2扫描取2ml浓度为2mg/ml的火把花根提取物溶液，置于石英比色皿中，于分光光度计全波长扫描，波长200至1000nm。
[0038]
结果：火把花根提取物在260nm和280nm无吸收，火把花根提取物uv-vis扫描结果见图2。
[0039] 3、抗疲劳活性与机制3.1动物分组与给药18只雄性icr小鼠，随机表法分为3组，分别是正常对照组、疲劳对照组、火把花根提取物组，每组6只。按组别灌胃给予相应受试物，给药体积均为20ml/kg体重，每日1次，连续给药14天。详细分组给药方案见表1。
[0040]
表1分组给药方案组别受试物给药浓度给药体积给药剂量正常对照组纯化水/20ml/kg/疲劳对照组纯化水/20ml/kg/火把花根提取物组火把花根提取物10mg/ml20ml/kg200mg/kg3.2检测小鼠疲劳转棒实验将小鼠置于转棒疲劳仪上（15r/min），先进行小鼠疲劳转棒训练3次（每次2min，
间隔10 min）后，然后休息30 min，进行正式实验，记录小鼠运动性疲劳后从转棒上跌落的时间，即小鼠疲劳转棒时间。
[0041]
正常对照组小鼠不作疲劳转棒处理。
[0042]
小鼠力竭游泳实验小鼠分6次在给药第14天完成力竭游泳，每次每组各取1只小鼠，将其尾根部负荷5%体质量铅皮后置于同一游泳箱中（水深不少于30 cm，水温25℃
±
1.0℃），当小鼠力竭时会沉至水面下，小鼠沉至水面下7 s时，记录每只小鼠游泳结束时间，即小鼠力竭游泳时间。
[0043]
正常对照组小鼠不作力竭游泳处理。
[0044]
血糖检测小鼠力竭游泳后，麻醉各组小鼠，眼眶取血，使用血糖仪检测血糖水平。
[0045]
大体解剖与组织病理学检查小鼠力竭游泳后，安乐处死各组小鼠，迅速剖取左侧腓肠肌，采用he染色和pas染色观察病理变化。
[0046]
检测取右侧腓肠肌20mg，使用trizol试剂盒提取总rna，并通过相应的合成试剂盒转化为cdna。采用sybr green rt-pcr试剂盒检测糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β, gsk-3β）、磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinases, pi3k）表达。在95 ℃下进行30 s的初始变性步骤后，在95摄氏度的熔化温度下进行25 s，在60摄氏度的退火温度下进行30 s，进行40个循环的扩增。内参采用β-actin，并通过2
−
δδct
法进行处理。
[0047]
表2 引物序列一览表引物名称引物序列pi3k_ftaagccggacctcatccpi3k_rttcattccccagccactgsk-3β_ftgccgaaatgagttgatggsk-3β_rcgcctttgtttgctttgβ-actin_ftctttgcagctccttcgtβ-actin_rgacccattcccaccatc 数据统计本研究数据均以均值
±
标准差（
±
sd）表示。统计软件为graphpad 8.0，检测数据分析两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。
[0048] 4、结果4.1 与疲劳对照组比较，火把花根提取物组小鼠疲劳转棒时间显著增加，提示火把花根提取物可增加疲劳转棒时间，见图3，各组动物数n=6。与疲劳对照组比较，# p＜0.05。
[0049]
4.2与疲劳对照组比较，火把花根提取物组小鼠力竭游泳时间显著增加，提示火把花根提取物可增加力竭游泳时间，见图4，各组动物数n=6。与疲劳对照组比较，# p＜0.05。
[0050]
4.3小鼠力竭游泳后血糖呈下降趋势，表明力竭游泳对血液中葡萄糖消耗增加。与疲劳对照组比较，火把花根提取物组小鼠血糖显著降低，提示火把花根提取物可提升机体
对血液中葡萄糖的利用，见图5，各组动物数n=6，与正常对照组比较，* p＜0.05 **p＜0.01；与疲劳对照组比较，# p＜0.05。
[0051]
4.4 he染色各组小鼠腓肠肌未见明显异常。pas染色显示，疲劳对照组腓肠肌着色略深，而火把花根提取物组着色最深，表明火把花根提取物可促进糖原在小鼠腓肠肌中富集，提示火把花根提取物可改善疲劳肌肉糖原的摄取，见图6。
[0052]
4.5与正常对照组比较，疲劳对照组pi3k表达水平显著增加；与疲劳对照组比较，火把花根提取物组pi3k表达水平显著降低。与正常对照组比较，疲劳对照组gsk-3β表达水平略增加，但不显著，而火把花根提取物组gsk-3β表达水平显著增加。表明调控pi3k、gsk-3β表达可能是火把花根提取物缓解疲劳的机制，火把花根多糖对力竭游泳后小鼠骨骼肌pi3k、gsk-3β的影响见图7，图8，各组动物数n=4~6。与正常对照组比较，* p＜0.05 **p＜0.01；与疲劳对照组比较，# p＜0.05。
[0053]
结论火把花根提取物具有抗疲劳活性，其机制是通过调节机体葡萄糖摄取和调控骨骼肌pi3k、gsk-3β表达，来抵抗疲劳。