一种活性胶原蛋白冻干制剂及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及胶原蛋白技术领域，尤其是涉及一种活性胶原蛋白冻干制剂及其制备方法和应用。


背景技术：

2.胶原蛋白是细胞外基质的一种结构蛋白质，是动物结缔组织中的主要成分，也是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白，约占胶原纤维固体物的85％。胶原蛋白主要存在于动物的结缔组织(骨、软骨、皮肤、腱、韧等)中，占哺乳动物体内蛋白质的25-30％。研究表明，胶原蛋白与组织的形成及成熟、细胞间信息的传递、关节润滑、伤口愈合和衰老等有着密切的关系。胶原蛋白是生物科技产业的关键性原材料之一，在医学材料、化妆品、食品工业等领域具有广泛的应用。
3.大分子胶原蛋白在高温下易失活，冻干是保存胶原蛋白的常用方法。然而，胶原蛋白在冻干过程由于蛋白表面脱水会导致胶原蛋白分子间发生自交联反应，导致冻干后的胶原蛋白难以复溶。复溶问题对水解胶原蛋白和低分子量的人源重组胶原蛋白影响不大，但对用于注射填充用的大分子提取胶原蛋白影响较为严重。
4.目前，活性大分子胶原蛋白产品主要是以悬浮液的形式存在，该产品形式对于运输和储存要求极高，条件不当会导致产品变性从而无法使用。对于分子量在300kd左右的活性胶原蛋白，如果仅进行简单的冻干，胶原蛋白在冻干过程中会发生不可逆的自交联，从而影响胶原蛋白的复溶效果，复溶后的胶原蛋白常因产生聚集和结块从而无法进行注射；同时，小分子量的重组胶原蛋白的冻干方式并不适用于高分子的天然活性胶原蛋白。
5.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种活性胶原蛋白冻干制剂及其制备方法和应用，其解决了活性胶原蛋白冻干后过度自交联导致的复溶难题，冻干制剂的复溶效果好，同时控制并利用冻干过程中的自交联提高了复溶胶原蛋白的抗酶解性能和热稳定性。
7.本发明提供一种活性胶原蛋白冻干制剂的制备方法，包括如下步骤：
8.s1：将活性胶原蛋白悬浮液与冻干保护剂混合，制得混合液；
9.s2：对混合液进行冻干，制得活性胶原蛋白冻干制剂；
10.其中，冻干保护剂包括第一保护剂，第一保护剂包括甘氨酸和甘露醇中的至少一种。
11.特别是，冻干保护剂还包括第二保护剂，第二保护剂包括乙酸乙酯。
12.进一步地，冻干保护剂还可以包括第三保护剂，第三保护剂包括氧化纤维二糖。
13.本发明活性胶原蛋白冻干制剂的制备方法对活性胶原蛋白悬浮液中的活性胶原蛋白不作严格限制；具体地，活性胶原蛋白的分子量可以为200-300kd。此外，对活性胶原蛋白悬浮液中的活性胶原蛋白的浓度不作严格限制，例如可以为5-35mg/ml。
14.在本发明中，活性胶原蛋白悬浮液中的活性胶原蛋白与第一保护剂的质量比可以为1：(2-6)；活性胶原蛋白悬浮液中的活性胶原蛋白与第二保护剂的质量体积比可以为1mg：(0.05-0.1)ml；活性胶原蛋白悬浮液中的活性胶原蛋白与第三保护剂的质量比可以为1：(0.2-0.6)。
15.特别是，第一保护剂可以包括甘氨酸和甘露醇，甘氨酸与甘露醇的质量比可以为1：(1.5-4)。
16.在本发明中，氧化纤维二糖是通过过氧化氢等氧化剂对纤维二糖进行氧化制得；具体地，氧化纤维二糖的制备方法可以包括：
17.a)将纤维二糖溶于水中，混匀，得到纤维二糖溶液；
18.b)向纤维二糖溶液中加入过氧化氢进行反应，制得氧化纤维二糖。
19.步骤a)中，纤维二糖溶液的质量浓度可以为4-6％，纤维二糖与过氧化氢的质量比可以为1：(0.05-0.1)；步骤b)中，可以控制反应温度为20-40℃，反应时间为6-10h。
20.本发明对冻干工艺不作严格限制，冻干可以包括依次进行的预冻、升华干燥和解析干燥。
21.具体地，预冻可以包括：先在0-2℃下预冷25-35min，再在-50℃至-60℃下预冻110-130min；升华干燥可以包括：先在-45℃至-55℃下干燥5-15min，随后在-30℃至-40℃下干燥1500-1600min，再在-2℃至-8℃下干燥50-70min；解析干燥可以包括：先在2-8℃下干燥50-70min，再在25-35℃下干燥800-1000min；各次升温的时间可以控制在25-35min。
22.本发明还提供一种活性胶原蛋白冻干制剂，按照上述制备方法制得。
23.本发明还提供上述活性胶原蛋白冻干制剂在医美中的应用。
24.本发明还提供一种活性胶原蛋白溶液的制备方法，包括：在使用前对上述活性胶原蛋白冻干制剂进行复溶。
25.具体地，复溶所采用的复溶溶剂为无菌水、无菌生理盐水、0.3％的盐酸利多卡因无菌水溶液或0.3％的盐酸利多卡因无菌生理盐水溶液；活性胶原蛋白溶液的浓度为5-65mg/ml；其中，在用于真皮层填充时，复溶后的活性胶原蛋白溶液的浓度为20-65mg/ml；在用于水光针时，复溶后的活性胶原蛋白溶液的浓度为5-35mg/ml。
26.在进行复溶时，活性胶原蛋白冻干制剂可以在密闭条件下通过注射器一次性注入复溶溶剂中。此外，复溶后的活性胶原蛋白溶液在使用前可以采用三通混合方式增加活性胶原蛋白的悬浮效果。
27.本发明人经大量研究发现：胶原蛋白在常规冻干过程中会发生不可逆的自交联从而影响胶原蛋白的复溶效果；然而，本发明的制备方法能够将活性胶原蛋白的自交联比例控制在适宜的范围，该适宜的自交联程度能够良好地解决注射级胶原蛋白在冻干后的复溶问题，冻干过程对活性胶原蛋白的三维螺旋结构和活性无不良影响，此外该适宜的自交联程度还能够显著提高复溶胶原蛋白的抗酶解性能和热稳定性，制得的活性胶原蛋白冻干制剂能够根据应用场景复溶稀释为不同浓度进行不同应用，适用范围广泛，实际应用效果好。
具体实施方式
28.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属技术领域的普通技术人员通常
理解的相同含义。
29.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本技术的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
30.下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
31.实施例1
32.本实施例的活性胶原蛋白冻干制剂的制备方法，步骤如下：
33.1、制备混合液
34.向活性胶原蛋白悬浮液(分子量300kd)中添加甘氨酸、甘露醇和乙酸乙酯，混合后制得混合液；其中，活性胶原蛋白悬浮液中活性胶原蛋白的浓度10mg/ml，活性胶原蛋白、甘氨酸、甘露醇之间的质量比为1：1：4，活性胶原蛋白与乙酸乙酯的质量体积比为1mg：0.06ml。
35.2、冻干
36.将上述混合液按3ml/瓶的规格分装至灭菌的西林瓶中进行冻干，冻干工艺条件见表1。
37.表1冻干工艺条件
38.预冻温度(℃)升温速率(min)保温时间(min)真空设置(pa)第1步1030/第2步-550120/升华干燥温度(℃)升温速率(min)保温时间(min)真空设置(pa)第1步-50010极限第2步-35301560极限第3步-53060极限解析干燥温度(℃)升温速率(min)保温时间(min)真空设置(pa)第1步53060极限第2步3030900极限
39.冻干后，即制得活性胶原蛋白冻干制剂。
40.通过电泳法对制得的活性胶原蛋白冻干制剂进行检测，结果表明：冻干前后活性胶原蛋白分子量一致，说明本实施例的冻干过程对活性胶原蛋白的三维螺旋结构和活性并无影响。
41.实施例2
42.本实施例的活性胶原蛋白冻干制剂的制备方法，步骤如下：
43.1、制备混合液
44.向活性胶原蛋白悬浮液(分子量300kd)中添加甘氨酸、甘露醇和乙酸乙酯，混合后制得混合液；其中，活性胶原蛋白悬浮液中活性胶原蛋白的浓度10mg/ml，活性胶原蛋白、甘
氨酸、甘露醇之间的质量比为1：2.4：3.6，活性胶原蛋白与乙酸乙酯的质量体积比为1mg：0.1ml。
45.2、冻干
46.将上述混合液按3ml/瓶的规格分装至灭菌的西林瓶中，按照实施例1的冻干工艺条件进行冻干，制得活性胶原蛋白冻干制剂。
47.实施例3
48.本实施例的活性胶原蛋白冻干制剂的制备方法，步骤如下：
49.1、制备氧化纤维二糖
50.将纤维二糖溶于水中，混匀，得到质量浓度为4％的纤维二糖溶液；向纤维二糖溶液中过氧化氢进行反应，纤维二糖与过氧化氢的质量比1：0.05，反应温度为40℃，反应时间为6h，制得氧化纤维二糖。
51.2、制备混合液
52.向活性胶原蛋白悬浮液(分子量300kd)中添加甘氨酸、氧化纤维二糖和乙酸乙酯，混合后制得混合液；其中，活性胶原蛋白悬浮液中活性胶原蛋白的浓度10mg/ml，活性胶原蛋白、甘氨酸、氧化纤维二糖之间的质量比为1：4：0.6，活性胶原蛋白与乙酸乙酯的质量体积比为1mg：0.05ml。
53.3、冻干
54.将上述混合液按3ml/瓶的规格分装至灭菌的西林瓶中进行冻干，冻干工艺条件见表2。
55.表2冻干工艺条件
56.预冻温度(℃)升温速率(min)保温时间(min)真空设置(pa)第1步0025/第2步-500130/升华干燥温度(℃)升温速率(min)保温时间(min)真空设置(pa)第1步-45015极限第2步-30251600极限第3步-22570极限解析干燥温度(℃)升温速率(min)保温时间(min)真空设置(pa)第1步22570极限第2步25251000极限
57.冻干后，即制得活性胶原蛋白冻干制剂，冻干前后活性胶原蛋白分子量一致。
58.实施例4
59.本实施例的活性胶原蛋白冻干制剂的制备方法，步骤如下：
60.1、制备氧化纤维二糖
61.将纤维二糖溶于水中，混匀，得到质量浓度为6％的纤维二糖溶液；向纤维二糖溶液中过氧化氢进行反应，纤维二糖与过氧化氢的质量比1：0.1，反应温度为20℃，反应时间为10h，制得氧化纤维二糖。
62.2、制备混合液
63.向活性胶原蛋白悬浮液(分子量300kd)中添加甘露醇、氧化纤维二糖和乙酸乙酯，
混合后制得混合液；其中，活性胶原蛋白悬浮液中活性胶原蛋白的浓度10mg/ml，活性胶原蛋白、甘露醇、氧化纤维二糖之间的质量比为1：6：0.2，活性胶原蛋白与乙酸乙酯的质量体积比为1mg：0.07ml。
64.3、冻干
65.将上述混合液按3ml/瓶的规格分装至灭菌的西林瓶中进行冻干，冻干工艺条件见表3。
66.表3冻干工艺条件
67.预冻温度(℃)升温速率(min)保温时间(min)真空设置(pa)第1步2035/第2步-600110/升华干燥温度(℃)升温速率(min)保温时间(min)真空设置(pa)第1步-5505极限第2步-40351500极限第3步-83550极限解析干燥温度(℃)升温速率(min)保温时间(min)真空设置(pa)第1步83570极限第2步35351000极限
68.冻干后，即制得活性胶原蛋白冻干制剂。
69.实施例5
70.本实施例的活性胶原蛋白冻干制剂的制备方法，步骤如下：
71.1、制备混合液
72.向活性胶原蛋白悬浮液(分子量300kd)中添加甘氨酸、甘露醇、实施例3制备的氧化纤维二糖和乙酸乙酯，混合后制得混合液；其中，活性胶原蛋白悬浮液中活性胶原蛋白的浓度10mg/ml，活性胶原蛋白、甘氨酸、甘露醇、氧化纤维二糖之间的质量比为1：1：3：0.6，活性胶原蛋白与乙酸乙酯的质量体积比为1mg：0.05ml。
73.2、冻干
74.采用实施例3的冻干工艺条件对上述混合液进行冻干，制得活性胶原蛋白冻干制剂。
75.对照例1
76.除制备混合液步骤中不添加乙酸乙酯之外，其余与实施例1基本相同。
77.具体地，本对照例的混合液的制备方法为：
78.向活性胶原蛋白悬浮液(分子量300kd)中添加甘氨酸和甘露醇，混合后制得混合液；其中，活性胶原蛋白悬浮液中活性胶原蛋白的浓度10mg/ml，活性胶原蛋白、甘氨酸、甘露醇之间的质量比为1：1：4。
79.对照例2
80.除采用叔丁醇替换实施例1的乙酸乙酯之外，其余与实施例1基本相同。
81.对照例3
82.除制备混合液步骤中采用纤维二糖替换氧化纤维二糖之外，其余与实施例3基本相同。
83.具体地，本对照例的混合液的制备方法为：
84.向活性胶原蛋白悬浮液(分子量300kd)中添加甘氨酸、纤维二糖和乙酸乙酯，混合后制得混合液；其中，活性胶原蛋白悬浮液中活性胶原蛋白的浓度10mg/ml，活性胶原蛋白、甘氨酸、纤维二糖之间的质量比为1：4：0.6，活性胶原蛋白与乙酸乙酯的质量体积比为1mg：0.05ml。
85.对照例4
86.除制备混合液步骤不同之外，其余与实施例5基本相同。
87.本对照例的混合液的制备方法为：
88.向活性胶原蛋白悬浮液(分子量300kd)中添加柠檬酸、甘露醇、海藻糖和乙酸乙酯，混合后制得混合液；其中，活性胶原蛋白悬浮液中活性胶原蛋白的浓度10mg/ml，活性胶原蛋白、柠檬酸、甘露醇、海藻糖之间的质量比为1：1：3：0.6，活性胶原蛋白与乙酸乙酯的质量体积比为1mg：0.05ml。
89.试验例1
90.将各实施例和对照例制备的活性胶原蛋白冻干制剂复溶于无菌水中，分别控制复溶后的活性胶原蛋白溶液的浓度为10mg/ml、30mg/ml，采用三种不同的注射器对复溶后的活性胶原蛋白溶液进行注射，注射情况见表4。
91.同时，针对复溶浓度为30mg/ml时注射情况正常的活性胶原蛋白冻干制剂的复溶浓度进行梯度配制，梯度设置为5mg/ml，将未出现结块、聚集等不良现象时的梯度浓度记为最高复溶浓度，即超过该最高复溶浓度出现结块、聚集等不良现象，最高复溶浓度见表4。
92.表4各活性胶原蛋白冻干制剂的复溶试验结果
93.[0094][0095]
试验例2
[0096]
将实施例1-5制备的活性胶原蛋白冻干制剂复溶于无菌水中，控制复溶后的活性胶原蛋白溶液的浓度为30mg/ml，采用27g注射针头和30g注射针头对复溶后的活性胶原蛋白溶液进行注射，注射针筒推挤力测试结果见表5。
[0097]
表5注射针筒推挤力测试结果
[0098][0099]
试验例3
[0100]
对实施例5冻干前后的胶原蛋白进行afm检测，结果见图1。
[0101]
由图1可见，未冻干前的胶原蛋白呈现典型的三维网络纤维编织形貌，这是其具有三股螺旋结构的基本体现；当冻干复溶后，胶原蛋白仍明显呈现典型的胶原型纤维网络结构，在一定程度上证实了改性过程并未明显对胶原的三股螺旋结构产生实质破坏；同时，当冻干复溶后，胶原纤维编织情况更为紧密，缠绕现象更为明显，进一步证实了其胶原分子间发生了可控的交联反应。
[0102]
试验例4
[0103]
采用dsc测量法对各实施例和对照例制备的活性胶原蛋白冻干制剂的热稳定性进行检测；检测条件如下：升温速度维持速率为5℃/min，温度范围为20-200℃。
[0104]
各活性胶原蛋白冻干制剂的变性温度检测结果见表6。
[0105]
试验例5
[0106]
将各实施例和对照例制备的活性胶原蛋白冻干制剂复溶于无菌水中，制成10mg/ml的复溶活性胶原蛋白溶液；向复溶活性胶原蛋白溶液中加入胶原酶，于30℃下酶解12h，检测酶解上清液中的羟脯氨酸含量，将实施例1的活性胶原蛋白原料酶解产生的羟脯氨酸含量计为酶解率100％。
[0107]
各活性胶原蛋白冻干制剂的酶解率检测结果见表6。
[0108]
表6各活性胶原蛋白冻干制剂的抗酶解性能和热稳定性检测结果
[0109][0110][0111]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。