一种人参根细胞间质组合物及其制备方法与流程

1.本发明涉及人参提取物技术领域，具体为一种人参根细胞间质组合物及其制备方法。


背景技术：

2.人参有多种神奇功效：美白，抗衰，抗炎，去皱，保湿，而这些功能大多数归功于神奇的人参皂苷，这是一种人参特有的物质。
3.人参提取物中主要有效成分为人参皂苷类成分(或称为人参总皂苷)、人参多糖类、多糖、黄酮、生物碱、氨基酸等成分，具有保湿性能和抗衰老性能，具有细胞保护作用，(jeong s j，han s h，kim d y，et al.effects ofmrg2，a mixture of ginsenosides containing 60％rg2，on the ultravioletb-induced dna repair synthesis and apoptosis in nih3t3 cells [j].international journal of toxicology，2007，26(2)：151)中报道 mrg2(含60％人参皂苷rg2、的人参皂苷混合物)可通过修复dna和减少凋亡使细胞免受uvb诱导的基因毒性。是干性衰老型皮肤护理重要成分。它具有人参的主要生理活性。其中rg2为稀有人稀有人参皂苷rg2组，标定核心成分为稀有人稀有人参皂苷rg2组，含量为0.01％，天然野山参中含量也极低。 rg2能可以延缓细胞变老，内源性改善皮肤干燥、衰老问题，从而使肌肤恢复年轻活力状态。同时rg2可减少紫外线、有害化学物质等引起细胞损伤问题导致的肌肤衰老问题，以及可提升自我抵御外界刺激的能力。
[0004]
皮肤护理是支持皮肤完整性，改善其外观并缓解皮肤状况的一系列实践，随着人们生活水平的提高，对皮肤的护理和保养也越来越重视，但一部分人群为干性皮肤，干皮分级护理从选择护肤品上来说要比较注意保湿性，但是由于干性皮肤屏障功能不好，对很多东西的耐受性偏差，所以在使用护肤品的时候就要额外的小心，不要用有刺激性的护肤品加重皮肤的刺激。人稀有人参皂苷rg2组对干性皮肤具有很好的改善，且不含有刺激性和有害物质，不会加重皮肤的刺激。
[0005]
本发明的目的是提供用于在制备有效的人参提取物，源自人参属形成层分生细胞或其提取物中增加特定人参皂苷，例如在未经处理的人参提取物或源自人参属形成层分生细胞或其提取物中很少存在的稀有人参皂苷，通过纯化分离系统定向保留稀有人参皂苷或者增加稀有人参皂苷。
[0006]
在现有技术中，人参根细胞水制作方法主要有：有溶剂提取法、超声波提取法、微波提取法和酶提取法，而超临界流体萃取法、微波辅助提取法等则作为新的提取技术被广泛使用，但是提取机理不明确，设备较大，运行成本高。而在提取过程使用纯化分离系统定向保留有效活性成分作为创新技术得到成品的技术是本发明要解决的问题。


技术实现要素：

[0007]
(一)解决的技术问题
[0008]
针对现有技术的不足，本发明提供了一种人参根细胞间质组合物及其制备方法，
具备人参根细胞间质水中人稀有人参皂苷rg2的含量高、且可定向保留活性成分的优点，解决了人参根细胞间质水中人稀有人参皂苷rg2的含量不高的问题。
[0009]
(二)技术方案
[0010]
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种人参根细胞间质组合物，包括以下原料：人参根水或白桦树汁中的一种98.5％-99％、1，2-己二醇 0.2％-0.5％和对羟基苯乙酮0.2％-0.5％、c12-13链烷醇聚醚-90.01％-0.2％、水解人参皂草苷类0.01％-0.1％和丁二醇0.1％-0.2％。
[0011]
优选的，所述人参根水采用蒸馏工艺制得，所述1，2-己二醇选用分子量为62.068的无色粘稠液体，所述丁二醇选用分子量是90.121的液体，所述对羟基苯乙酮选用分子量为136.1479，常温下为白色的针状结晶，所述水解人参皂草苷类选用人稀有人参皂苷rg2。
[0012]
一种人参根细胞间质组合物制备方法，包括以下步骤：
[0013]
s1：清洗：精选5年人参根茎，用自来水清洗两遍，再用去离子水清洗干净。
[0014]
s2：晾晒：将洗干净的人参放置阳光底下，自然通风晾晒48小时。
[0015]
s3：切片粉碎：将人参切片粉碎后，并过筛网筛分，加入到多功能热回流提取罐中。
[0016]
s4：一次提取：向其中加入5倍人参颗粒质量的去离子水，浸泡8h，80℃水浴加热，搅拌3h，提取后放出一次提取液，留下人参残留物。
[0017]
s5：二次提取，向人参残留物中加入4倍人参颗粒质量的去离子水，提取后放出二次提取液。
[0018]
s6：蒸馏去杂：合并两次提取液，通过塔式蒸馏锅蒸馏，冷凝器出口装有温度计，观察流出液的温度，先蒸汽加热30-40min，温度上升到70-80℃时通入蒸汽至沸腾，继续蒸馏2.5-3.5h，控制流出液量为60％左右，流出液温度控制在35-45℃，经过蒸馏，不挥发的组分(盐类)残留在容器中被除去，挥发的有机物进入冷凝水的初始馏分中，收集馏分的中间部分。
[0019]
s7：纯化分离：将馏分通过纯化分离机通过减压蒸发的方式，将人参根提取液进行定向有效成分人稀有人参皂苷rg2保留。
[0020]
s8：混合罐装：向人参提取物成品中加入1，2-己二醇、对羟基苯乙酮、 c12-13链烷醇聚醚-9、丁二醇和水解人参皂草苷类后混合均匀，过滤，灌装。
[0021]
优选的，所述s3中的筛网筛孔径为16目。
[0022]
优选的，所述s3中多功能热回流提取罐的型号为xtq-100，容积为100l，罐内设计压力为0.09mpa，加热功率为12kw，搅拌转速为21ppm/min。
[0023]
优选的，所述s6中收集馏分的中间部分占60％。
[0024]
优选的，所述s7中使用纯化分离机系统，处理料量：0.1-500l/h，型号： ris-c500，功率为6kw，罐内设计压力为1mpa，系统温度20-40℃。
[0025]
(三)有益效果
[0026]
与现有技术相比，本发明提供了一种人参根细胞间质组合物及其制备方法，具备以下有益效果：
[0027]
1.该人参根细胞间质组合物及其制备方法，通过两次提取，合并两次提取液，通过塔式蒸馏锅蒸馏，经过一次蒸馏，不挥发的盐类残留在容器中被除去，挥发的有机物进入冷凝水的初始馏分中，收集馏分的中间部分，再经过纯化分离系统定向保留稀有人参皂苷，再
加入1，2-己二醇、对羟基苯乙酮和水解人参皂草苷类后得人参提取物成品，成品中稀有人稀有人参皂苷rg2 的含量大于万分之五，且无农残及重金属，扩大了人参提取物成品的使用范围。
[0028]
2.该人参根细胞间质组合物及其制备方法，通过逐渐增加人参根细胞间质的浓度，可以逐渐增加对dpph自由基的去除率，通过对人参根提取液采用蒸馏工艺，既去除杂质，又保证整个制备过程中无酸碱条件、无需加热、无相变，又省去了现有工艺中使用氧化镁脱色的环节，节省了大量资源。
[0029]
3.从基因水平修复受损细胞验证人参根细胞间质中的人参皂苷显著修复受损细胞。
附图说明
[0030]
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0031]
图1为本发明的工艺流程图；
[0032]
图2为本发明的细胞暴露于uvb光(b、c、d)和不暴露于uvb光下(a) 的生产情况图；
[0033]
图3为本发明的细胞在不同浓度的rg2下培养24小时后的凋亡指数图。
具体实施方式
[0034]
下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0035]
实施例一：
[0036]
实施例一：本发明提供如下技术方案：一种人参根细胞间质组合物，包括以下原料：人参根水98.5％、1，2-己二醇0.5％和对羟基苯乙酮0.5％、c12-13 链烷醇聚醚-90.1％、水解人参皂草苷类0.1％和丁二醇0.1％。
[0037]
人参根水采用蒸馏工艺制得，1，2-己二醇选用分子量为62.068的无色粘稠液体，丁二醇选用分子量是90.121的液体，对羟基苯乙酮选用分子量为 136.1479，常温下为白色的针状结晶，水解人参皂草苷类选用人参皂苷rg2 组。
[0038]
一种人参根细胞间质组合物制备方法，包括以下步骤：
[0039]
s1：清洗：精选5年人参根茎，用自来水清洗两遍，再用去离子水清洗干净。
[0040]
s2：晾晒：将洗干净的人参放置阳光底下，自然通风晾晒48小时。
[0041]
s3：切片粉碎：将人参切片粉碎后，并过筛网筛分，加入到多功能热回流提取罐中，筛网筛孔径为16目，多功能热回流提取罐的型号为xtq-100，容积为100l，罐内设计压力为0.09mpa，加热功率为12kw，搅拌转速为 21ppm/min。
[0042]
s4：一次提取：向其中加入5倍人参颗粒质量的去离子水，提取后放出一次提取液，留下人参残留物。
[0043]
s5：二次提取，向人参残留物中加入4倍人参颗粒质量的去离子水，提取后放出二次提取液。
[0044]
s6：蒸馏：合并两次提取液，通过塔式蒸馏锅蒸馏，冷凝器出口装有温度计，观察流出液的温度，先蒸汽加热30-40min，温度上升到70-80℃时通入蒸汽至沸腾，继续蒸馏2.5-3.5h，控制流出液量为60％左右，流出液温度控制在35-45℃，经过蒸馏，不挥发的组分(盐类)残留在容器中被除去，挥发的有机物进入冷凝水的初始馏分中，收集馏分的中间部分；
[0045]
s7：纯化分离：将馏分通过纯化分离机通过减压蒸发的方式，将人参根提取液进行定向有效成分人稀有人参皂苷rg2保留。
[0046]
s8：混合罐装：向人参提取物成品中加入1，2-己二醇、对羟基苯乙酮、 c12-13链烷醇聚醚-9、丁二醇和水解人参皂草苷类后混合均匀，过滤，灌装。
[0047]
实施例二：
[0048]
本发明提供如下技术方案：一种人参根细胞间质组合物，包括以下原料：人参根水99％、1，2-己二醇0.3％和对羟基苯乙酮0.3％、c12-13链烷醇聚醚-90.1％、水解人参皂草苷类0.2％和丁二醇0.1％。
[0049]
人参根水采用蒸馏工艺制得，1，2-己二醇选用分子量为62.068的无色粘稠液体，丁二醇选用分子量是90.121的液体，对羟基苯乙酮选用分子量为 136.1479，常温下为白色的针状结晶，水解人参皂草苷类选用人参皂苷rg2 组。
[0050]
一种人参根细胞间质组合物制备方法，包括以下步骤：
[0051]
s1：清洗：精选5年人参根茎，用自来水清洗两遍，再用去离子水清洗干净。
[0052]
s2：晾晒：将洗干净的人参放置阳光底下，自然通风晾晒48小时。
[0053]
s3：切片粉碎：将人参切片粉碎后，并过筛网筛分，加入到多功能热回流提取罐中，筛网筛孔径为16目，多功能热回流提取罐的型号为xtq-100，容积为100l，罐内设计压力为0.09mpa，加热功率为12kw，搅拌转速为 21ppm/min。
[0054]
s4：一次提取：向其中加入5倍人参颗粒质量的去离子水，提取后放出一次提取液，留下人参残留物。
[0055]
s5：二次提取，向人参残留物中加入4倍人参颗粒质量的去离子水，提取后放出二次提取液。
[0056]
s6：蒸馏：合并两次提取液，通过塔式蒸馏锅蒸馏，冷凝器出口装有温度计，观察流出液的温度，先蒸汽加热30-40min，温度上升到70-80℃时通入蒸汽至沸腾，继续蒸馏2.5-3.5h，控制流出液量为60％左右，流出液温度控制在35-45℃，经过蒸馏，不挥发的组分(盐类)残留在容器中被除去，挥发的有机物进入冷凝水的初始馏分中，收集馏分的中间部分；
[0057]
s7：纯化分离：将馏分通过纯化分离机通过减压蒸发的方式，将人参根提取液进行定向有效成分人稀有人参皂苷rg2保留。
[0058]
s8：混合罐装：向人参提取物成品中加入1，2-己二醇、对羟基苯乙酮、 c12-13链烷醇聚醚-9、丁二醇和水解人参皂草苷类后混合均匀，过滤，灌装。
[0059]
对比例一：
[0060]
本发明提供如下技术方案：一种人参根细胞间质组合物，包括以下原料：白桦树汁98.4％、1，2-己二醇0.5％和对羟基苯乙酮0.5％、c12-13链烷醇聚醚-90.1％、水解人参皂草苷类0.1％和丁二醇0.1％，人参根水0.1％。
[0061]
1，2-己二醇选用分子量为62.068的无色粘稠液体，丁二醇选用分子量是90.121的液体，对羟基苯乙酮选用分子量为136.1479，常温下为白色的针状结晶，水解人参皂草苷类选用人参皂苷rg2组。
[0062]
一种人参根细胞间质组合物制备方法，包括以下步骤：
[0063]
s1：清洗：精选5年人参根茎，用自来水清洗两遍，再用去离子水清洗干净。
[0064]
s2：晾晒：将洗干净的人参放置阳光底下，自然通风晾晒48小时。
[0065]
s3：切片粉碎：将人参切片粉碎后，并过筛网筛分，加入到多功能热回流提取罐中，筛网筛孔径为16目，多功能热回流提取罐的型号为xtq-100，容积为100l，罐内设计压力为0.09mpa，加热功率为12kw，搅拌转速为 21ppm/min。
[0066]
s4：一次提取：向其中加入5倍人参颗粒质量的去离子水，提取后放出一次提取液，留下人参残留物。
[0067]
s5：二次提取，向人参残留物中加入4倍人参颗粒质量的去离子水，提取后放出二次提取液。
[0068]
s6：蒸馏：合并两次提取液，通过塔式蒸馏锅蒸馏，冷凝器出口装有温度计，观察流出液的温度，先蒸汽加热30-40min，温度上升到70-80℃时通入蒸汽至沸腾，继续蒸馏2.5-3.5h，控制流出液量为60％左右，流出液温度控制在35-45℃，经过蒸馏，不挥发的组分(盐类)残留在容器中被除去，挥发的有机物进入冷凝水的初始馏分中，收集馏分的中间部分；
[0069]
s7：纯化分离：将馏分通过纯化分离机通过减压蒸发的方式，将人参根提取液进行定向有效成分人稀有人参皂苷rg2保留。
[0070]
s8：混合罐装：向人参提取物成品中加入1，2-己二醇、对羟基苯乙酮、 c12-13链烷醇聚醚-9、丁二醇和水解人参皂草苷类后混合均匀，过滤，灌装。
[0071]
人参提取物成品中人参皂苷rg2的浓度含量检测：
[0072]
分别将实施例一、实施例二和对比例一中制得的人参提取物成品30μl、 50μl、100μl、150μl、200μl，置试管中，氮气吹干，加入5％的香草醛冰醋酸溶液0.2ml、高氯酸0.8ml，混匀，60摄氏度水浴加热15分钟，取出，加入冰醋酸5ml，混匀，置冰浴冷却1分钟，以相应的试剂作空白，在552nm 波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，人参皂苷rg2含量为横坐标，绘制标准曲线。
[0073]
用无水甲醇5ml冲洗、再用5ml蒸馏水冲洗头孢菌素18，500mg固相萃取柱，精密量取本发明药物组合物注射液2.5ml，注入固相萃取柱，依次采用水10ml，1％乙酸溶液15ml，水15ml，10％甲醇溶液10ml，80％甲醇溶液15ml，洗脱，取80％甲醇洗脱部分的溶液水浴蒸干，用甲醇溶解，定容于2ml量瓶中，制成供试品溶液。
[0074]
精密量取供试品溶液200μl，置试管中，照标准曲线制备项下的方法，自“氮气吹干”起，依法测定吸光度，从标准曲线上读出人参提取物成品中人参皂苷的浓度。通过实验得：实施例一中人参提取物成品中人参皂苷rg2 的浓度0.05％，实施例二中人参提取物成品中人参皂苷rg2的浓度为0.042％，对比例一中人参提取物成品中人参皂苷的浓度为0.005％。
[0075]
dpph自由基去除率检测：
[0076]
配制0.1mm的dpph溶液：配两次，每次取0.002gdpph溶于50ml乙醇，避光保存；配制0.5mg/ml的vc溶液，至少2ml(设为阳性对照)；配制一定浓度的样品溶液，至少2ml母液。避
光操作上板后，室温避光30分钟，测吸光度：
[0077]
第一组：100％浓度的实施例一中的人参提取物成品100ul+dpph醇溶液 100ul。
[0078]
第二组：20％浓度的实施例一中的人参提取物成品100ul+dpph醇溶液 100ul。
[0079]
第三组：10％浓度的实施例一中的人参提取物成品100ul+dpph醇溶液 100ul。
[0080]
空白组：100％％浓度、20％浓度和10％浓度的实施例一中的人参提取物成品 100ul+无水乙醇100ul。
[0081]
对照组：100％％浓度、20％浓度和10％浓度的实施例一中的人参提取物成品 100ul+水100ul
[0082]
测517nm处的吸光度，取平均值，计算每个浓度的dpph清除率。
[0083]
清除率计算公式如下：清除率＝[(样品组吸光度-空白组吸光度)/对照组吸光度]*100％。计算结果如下表：
[0084]
组别浓度dpph自由基去除率第一组100％24.27％第二组20％17.12％第三组10％12.04％
[0085]
人参根细胞间质中的人参皂苷rg2修复受损细胞的验证测试：
[0086]
测试方法：通过dapi染色确定rg2对uvb诱导的核破裂的保护作用。a 细胞暴露于uvb光(b-d)或不暴露于uvb光(a)，并在含有不同浓度rg2(a 和b，0um,50um；d,100um)的生长培养基24小时。箭头表示存在典型的凋亡核碎裂细胞。原始放大倍数*200。b暴露于uvb(闭合圆圈)或未暴露于uvb(开放圆圈)的细胞的凋亡指数，以及在含有不同浓度rg2(0-100um)的培养基中培养的细胞凋亡指数，通过dapi染色确定。每个数据点代表三次实验的平均值
±
sd*p＜0.01，分别与正常培养基孵育后比较(0um rg2,闭合圆圈)。
[0087]
如图2、图3所示。
[0088]
从测试数据得出：uvb诱导的细胞在正常生长培养基中培养24h后显示出明显的核碎裂，然而，使用rg2浓度越高，核碎裂减少效果越明显，说明人参根细胞间质中的rg2具有显著修复受损细胞作用。
[0089]
综上所述：在本技术中实施例一为最佳实施例。
[0090]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。