包封的溶瘤病毒遗传物质及其应用的制作方法

1.本技术涉及采用溶瘤病毒抗肿瘤技术领域，尤其涉及包封的溶瘤病 毒遗传物质及其应用。


背景技术：

2.溶瘤病毒是一类具有复制能力的肿瘤杀伤型病毒，采用溶瘤病毒来 抗肿瘤越来越得到认可，其原理是通过对自然界存在的一些致病力较弱 的病毒进行基因改造制成特殊的溶瘤病毒，利用靶细胞中抗病毒基因或 抑癌基因的失活或缺陷从而选择性地感染肿瘤细胞，在其内大量复制并 最终摧毁肿瘤细胞。同时它还能激发免疫反应，吸引更多免疫细胞来继 续杀死残余癌细胞。近几十年来，溶瘤病毒治疗引起了广泛关注，相关 研究取得了巨大进展。
3.单纯疱疹病毒，包括i型单纯疱疹病毒和ii型单纯疱疹病毒，由于 其嗜肿瘤特性而常被用来改造成溶瘤病毒，它识别并选择性地感染肿瘤 细胞，最终导致细胞溶胀而摧毁肿瘤细胞，但无法在正常机体细胞内复 制而不具有杀伤作用，理论上具有更高的抗肿瘤效应和更低的副作用。
4.在溶瘤病毒中，其中重组溶瘤单纯疱疹病毒是一种大有发展潜力的 用于癌症免疫治疗手段的溶瘤病毒，如人gm-csf溶瘤ii型单纯疱疹病 毒(后简称“oh2病毒”)，它能选择性地感染肿瘤细胞，并在肿瘤细胞 中复制，最终裂解、杀死肿瘤细胞，并释放出子代病毒颗粒进一步感染 周围的肿瘤细胞，此过程还有助于肿瘤相关抗原的释放。oh2病毒的抗 肿瘤效应不仅表现在病毒的复制直接杀伤肿瘤细胞或病毒蛋白的直接毒 性作用；最近越来越多的证据表明oh2病毒可以调节免疫抑制性肿瘤微 环境，有利于打破免疫耐受而激发抗肿瘤免疫反应。肿瘤细胞的裂解导 致肿瘤相关抗原(taa)的释放，诱导体内系统性的抗肿瘤免疫反应。
5.目前，溶瘤病毒的制备方法主要是通过培养细胞，再在细胞培养到 一定阶段后接毒，然后收获并纯化溶瘤病毒，然而现行的溶瘤病毒制备 方法存在工艺繁琐、成本较高、批间差较大、微生物污染风险较高等问 题。
6.具有复制能力的溶瘤病毒在临床系统给药极具挑战，溶瘤病毒作为 抗肿瘤药物，在对患者进行静脉注射时，溶瘤病毒会引起先天及获得免 疫强烈的抗病毒作用，从而导致患者产生非特异性炎症反应，且产生的 中和溶瘤病毒抗体会阻止溶瘤病毒对肿瘤细胞的感染及溶解作用，降低 了抗肿瘤的效果。
7.在本领域中，具有复制能力的、有效抗肿瘤的溶瘤病毒或相关疫苗、 药品仍然处于未满足的需求，因此，亟需提供全新的用于抗肿瘤物质和/ 或组合物，及生产该物质和/或组合物的方法。


技术实现要素：

8.本技术发明人提供了一种全新的生产抗肿瘤物质及其方法，所述的 抗肿瘤物质
为包封的溶瘤病毒的遗传物质，并非活的病毒。本技术优选 的溶瘤病毒为重组溶瘤i或ii型单纯疱疹病毒。在某些实施例中，选用 了效果更佳的重组人gm-csf溶瘤ii型单纯疱疹病毒，即oh2病毒。将 oh2病毒的遗传物质(包括dna或rna)经过lnp或者其他材料包封 后，形成的包封体能够进入细胞中，然后在体内形成活的oh2病毒，进 而产生抗肿瘤的作用。
9.第一方面，本技术实施例公开了一种脂质纳米颗粒(lnp)，所述 脂质纳米颗粒包括以下组分：
10.编码溶瘤病毒的遗传物质；所述溶瘤病毒包括重组溶瘤i或ii单纯 疱疹病毒；以及脂质体；所述脂质体包括阳离子脂质化合物与辅助分子 的组合；所述脂质体包封所述遗传物质以形成所述脂质纳米颗粒。
11.优选地，所述溶瘤病毒的遗传物质为dna或rna的一种。
12.进一步地，所述溶瘤病毒为重组溶瘤i型或ii型单纯疱疹病毒，其 遗传物质为dna。
13.优选地，所述溶瘤病毒为重组溶瘤ii型单纯疱疹病毒，其遗传物质 为dna。
14.更优选地，所述遗传物质为编码重组人gm-csf溶瘤ii型单纯疱疹 病毒(oh2病毒)的dna；其中所述oh2病毒毒株命名为h2d3d4-hgf, 建议的分类命名：ii型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus type 2)，保 藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址位于北 京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为 cgmcc no.3600，保藏日期为2010年2月3日。
15.进一步地，所述阳离子脂质化合物包括十七烷-9-基8-((2-羟乙基) (6-氧代-6-(十一烷氧基)己基)氨基)辛酸酯(sm102)、(2,3-二油酰 基-丙基)-三甲基铵-氯盐(dotap)中的一种或组合。
16.进一步地，所述辅助分子包括二硬脂酰磷脂酰胆碱(dspc)、胆固 醇及1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000(dmg-peg2000)。
17.进一步地，所述阳离子脂质化合物和辅助分子的摩尔比例是：阳离 子脂质化合物：dspc：胆固醇：dmg-peg2000为(40～55)：(5～15)： (30～45)：(1～5)；优选的摩尔比例是：阳离子脂质化合物：dspc： 胆固醇：dmg-peg2000为50：10：38：2。
18.第二方面，本技术实施例提供了第一方面所述脂质纳米颗粒(lnp) 的制备方法，包括：
19.溶瘤病毒遗传物质的初提取；所述溶瘤病毒为重组溶瘤i型单纯疱疹 病毒或重组溶瘤ii型单纯疱疹病毒；
20.溶瘤病毒遗传物质的纯化、回收；
21.配制脂质体溶液；以及用制备的脂质体溶液包封溶瘤病毒的遗传物 质，即得到所述的脂质纳米颗粒(lnp)。
22.进一步地，所述溶瘤病毒遗传物质的制备有多种方式，可采用溶瘤 病毒侵染非洲绿猴肾细胞(vero细胞)或者利用基因工程(基因合成、 质粒制备、基因编辑、聚合酶链反应pcr扩增、体外转录ivt等)的方 式制得。
23.进一步地，所述溶瘤病毒为重组溶瘤i或ii型单纯疱疹病毒。
24.优选地，所述溶瘤病毒为重组人gm-csf溶瘤ii型单纯疱疹病毒 (oh2病毒)，其遗传物质为dna。
25.进一步地，所述脂质体溶液包含的阳离子脂质化合物和辅助分子的 摩尔比例是：阳离子脂质化合物：dspc：胆固醇：dmg-peg2000为 (40～55)：(5～15)：(30～45)：(1～5)。
26.优选地，所述脂质体溶液包含的阳离子脂质化合物和辅助分子的摩 尔比例是：阳离子脂质化合物：dspc：胆固醇：dmg-peg2000为50： 10：38：2。
27.进一步地，所述脂质体溶液与包封的溶瘤病毒dna的体积比为1： 4。
28.第三方面，本技术实施例公开了第一方面所述脂质纳米颗粒(lnp) 在抗肿瘤的应用。
29.第四方面，本技术实施例公开了一种药物或疫苗，其中所述药物或 疫苗包含第一方面所述的脂质纳米颗粒(lnp)及药学可接受的辅料。
30.第五方面，本技术实施例公开了第四方面所述药物或疫苗在抗肿瘤 的应用。
31.与现有技术相比，本技术至少具有以下有益效果之一：
32.本技术中涉及包封的溶瘤病毒遗传物质及其应用。本技术中，提取 溶瘤病毒的遗传物质，并通过脂质进行包封，形成包封溶瘤病毒遗传物 质的脂质纳米颗粒(lnp)，如采用本技术发明人自研的重组人gm-csf 溶瘤ii型单纯疱疹病毒(oh2病毒)，通过生产oh2病毒的遗传物质 dna，并用脂质体进行包封，获得包封oh2病毒dna的脂质纳米颗粒 (lnp)。利用所述脂质纳米颗粒(lnp)进行抗肿瘤，可以解决或部分 解决溶瘤病毒系统给药诱导的先天及获得的抗病毒免疫导致的强烈抗病 毒作用，使溶瘤病毒拥有更好的抗肿瘤效果。另外，本技术公开了所述 所述脂质纳米颗粒(lnp)的制备方法，所述方法可用于高效制备抗肿 瘤药物，如包封oh2病毒遗传物质dna的lnp药物。所述方法不仅降 低抗肿瘤药物生产批次的批间差和外源病毒和微生物污染的风险，还增 强了抗肿瘤药物储存和运输稳定性；有利于抗肿瘤药物注射方式的进一 步拓展。
附图说明
33.图1为本技术实施例提供的接受不同治疗方案的小鼠的体内肿瘤体 积变化折线图。
34.图2为本技术实施例提供的接受不同治疗方案28天时的小鼠的体内 肿瘤平均体积散点图。
35.图3为本技术实施例提供的接受不同治疗方案28天时的小鼠的体内 平均肿瘤体积结果。
36.图4为本技术实施例提供的去除初始肿瘤体积≥150cm3的小鼠的体 内肿瘤体积变化折线图。
37.图5为本技术实施例提供的去除初始肿瘤体积≥150cm3的小鼠28天 时的体内肿瘤平均体积散点图。
38.图6为本技术实施例提供的去除初始肿瘤体积≥150cm3的小鼠28天 时的体内平均肿瘤结果。
具体实施方式
39.为了使本技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实 施例对本技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施 例仅仅用以解释本技术，并不用
于限定本技术。本技术中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。
40.需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序，也不对其后的技术特征起到实质的限定作用。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
41.脂质纳米颗粒(lnp)的说明
42.在本技术实施例中，所述的脂质纳米颗粒(lnp)是由脂质体包封编码溶瘤病毒的遗传物质制得的。
43.在本技术实施例中，所述溶瘤病毒为重组单纯疱疹病毒，在以往的研究记载中，单纯疱疹病毒(hsv)作为溶瘤病毒有着天然的优势，具体表现在：
44.(1)宿主广泛，能够感染多种组织细胞，并诱导机体免疫应答；
45.(2)具备在宿主细胞复制、繁殖、裂解宿主细胞的特性；
46.(3)复制时间短，保证溶瘤效果；
47.(4)可携带外源基因，进一步提升溶瘤效果；
48.(5)可剔除多个非必需基因，降低溶瘤病毒的神经毒性，增加裂解肿瘤细胞的选择性；
49.(6)安全性较高，溶瘤病毒的感染易控制；
50.(7)不与宿主细胞基因融合，以游离的形式在宿主细胞中复制。
51.由于单纯疱疹病毒分为i型单纯疱疹病毒和ii型单纯疱疹病毒，因此，本技术实施例中，所述溶瘤病毒进一步可分为重组溶瘤i型单纯疱疹病毒和重组溶瘤ii型单纯疱疹病毒。
52.本技术实施例中，以单纯疱疹病毒构建溶瘤病毒的方法是敲除至少一个原单纯疱疹病毒的非必需基因，如神经毒性基因icp34.5基因，其在肿瘤细胞内的繁殖是非必需的，而且敲除该基因后，溶瘤病毒丧失了神经毒性，而且可以选择性在的肿瘤细胞内复制。
53.在某些实施例中，在构建策略上，除了敲出单纯疱疹病毒的非必需基因，同时还引入了新的表达序列，构建重组溶瘤单纯疱疹病毒，作为新的溶瘤病毒。
54.在某些实施例中，所述脂质体包含编码溶瘤病毒的遗传物质是重组人gm-csf溶瘤ii型单纯疱疹病毒(oh2病毒)的dna。其中所述oh2病毒来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的病毒毒株，名为h2d3d4-hgf，建议的分类命名：ii型单纯疱疹病毒(herpessimplexvirustype2)，保藏编号为cgmccno.3600，保藏日期为2010年2月3日。
55.本某些实施例中，构建上述oh2病毒时，选用的是ii型单纯疱疹病毒，在其标准株的基础上敲除icp34.5基因和icp47基因，并插入人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf因子)表达盒；其中，
56.敲除icp34.5基因使溶瘤病毒丧失了神经毒性，而且可以选择性在的肿瘤细胞内
复制；
57.敲除icp47基因可诱导机体特异性地抗肿瘤免疫反应，还能促使下 游us11基因(对溶瘤病毒在肿瘤细胞内的复制有促进作用)表达上调；
58.gm-csf因子具有促进树突状细胞(dc细胞)募集活化的作用，也 可以增加dc细胞表面主要组织相容性抗原肽的量，进一步增强了dc细 胞的抗原递呈能力；gm-csf因子可以刺激髓源性前体细胞增殖分化， 增强机体特异性免疫反应；另外，gm-csf因子可增强抗体依赖的免疫 细胞介导的细胞毒效应、外周血的淋巴以及单核细胞的细胞毒效应，有 效增强机体的抗肿瘤免疫反应。
59.将oh2病毒的遗传物质经过lnp或者其他材料包封后，形成的包封 体能够进入细胞中，然后在体内形成活的oh2病毒，进而产生抗肿瘤的 作用。相比于溶瘤病毒直接作为抗肿瘤药物，本技术以溶瘤病毒的遗传 物质进行抗肿瘤，可以解决或部分解决溶瘤病毒系统给药诱导的先天及 获得的抗病毒免疫导致的强烈抗病毒作用，使溶瘤病毒拥有更好的抗肿 瘤效果。
60.在本技术实施例中，所述的脂质体由阳离子脂质化合物与辅助分子 组成。
61.dspc与胆固醇主要是辅助脂质，有助于形成双分子层；处方中的 dmg-peg2000脂质，可提高lnp在制备和储存中的稳定性，而这些 dmg-peg2000脂质一般含有短酰基链，有助于dmg-peg2000脂质在注 射后迅速从lnp中分离，避免聚集，促进lnp与细胞的相互作用。
62.在本技术实施例中，所述阳离子脂质化合物为sm102、(2,3-二油酰 基-丙基)-三甲基铵-氯盐(dotap)中的一种或组合。
63.在本技术实施例中，所述辅助分子为二硬脂酰磷脂酰胆碱(dspc)、 胆固醇及1，2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000(dmg-peg 2000)的至少一种或组合。
64.在本技术实施例中，所述脂质纳米颗粒中包含的阳离子脂质化合物 和辅助分子优选的的摩尔比例是：阳离子脂质化合物：dspc：胆固醇： dmg-peg2000为(40～55)：(5～15)：(30～45)：(1～5)。
65.在某些实施例中，所述脂质纳米颗粒中包含的阳离子脂质化合物和 辅助分子更优选的摩尔比例是：阳离子脂质化合物：dspc：胆固醇： dmg-peg2000为50：10：38：2。
66.脂质纳米颗粒(lnp)的制备
67.主要试剂来源：
68.dspc(艾伟拓(上海)医药科技有限公司，后简称avt，产品编号： b81229)；胆固醇(avt，产品编号：b80859)；dmg-peg2000(avt， 产品编号：e00s-dmg-20043-08-25)；sm102(厦门赛诺邦格，产品编 号：m2104000880005)
69.1、溶瘤病毒侵染非洲绿猴肾细胞(vero细胞)
70.采用oh2病毒侵染vero细胞。
71.vero细胞在t300培养瓶中培养，培养条件为5％fbs完全培养基、 37℃、5％co2，待细胞汇合度达到60～80％时，向其中接入1
×
106ccid
50
个oh2病毒，oh2病毒为本技术发明人自行研制，研制批次为
ꢀ“
bvt-oh2-201912a-sxt-ns”，滴度为1
×
107ccid
50
，过夜培养16小时。
72.2、溶瘤病毒dna的初提取。
73.采用dnazol试剂盒提取oh2病毒dna。
74.(1)配置75％的酒精：吸取21ml 100％的酒精与7ml的无核酸酶 水(depc)混匀。
75.(2)裂解、匀浆：倒出扩培细胞培养瓶(t300)中的培养基，加入 10ml的dnazol试剂，多次吹打混匀，直至将瓶壁上裂解后的细胞完全 吹打下来。
76.(3)离心取上清：将上述得到的溶液转移至50ml的离心管中，配 平后用高速冷冻离心机在5000rmp、4℃条件下离心10min，将得到的上 清转移至新离心管中。
77.(4)沉淀：离心管加入12ml的75％的酒精，上下颠倒10次充分 混匀后静置3分钟；然后4000g、4℃条件下离心2min。
78.(5)漂洗：弃上清，加入2ml 75％的酒精，吹打几次，然后在4000g、 4℃条件下离心1min。
79.(6)重复5步骤2次。
80.(7)溶解：尽可能的去掉酒精，静置2min，待酒精完全挥发掉后， 加入2ml的depc水复溶，待dna复溶后放入-20℃冰箱中保存。
81.3、dna电泳
82.由于用dnazol法得到的oh2病毒dna不纯，会含有vero细胞的 基因组。此步为纯化oh2病毒dna(担心uv会对dna造成影响， 所以没有进行核酸胶拍照)。
83.(1)制胶：(1g琼脂糖+100ml 1
×
tae溶液)溶解后+10μl gelred， 制成大加样孔的胶。
84.(2)点样：采用5μl 15000bp dna marker，上2ml的样品(其中 每600μl样品与20μl 6
×
loading buffer混匀上样)。
85.(3)电泳：电压120v，电泳30min。
86.4、采用胶回收试剂盒(fast pure gel dna extraction mini kit)提取 oh2病毒dna。
87.(1)切胶：电泳结束后，用蓝盾可见光透射仪切胶(目标条带大于 15000bp)，将切好的胶用5ml ep管收集。
88.(2)胶回收：按照快速纯化dna试剂盒说明书操作，回收oh2病 毒dna，最后采用depc水复溶oh2病毒dna得到溶液。
89.(4)用qubit检测oh2病毒dna的溶液浓度。
90.5、制备脂质体溶液
91.在本技术实施例中，将前述阳离子脂质化合物sm102和辅助分子按 比例混合于乙醇溶剂中制得，其中的辅助分子为二硬脂酰磷脂酰胆碱 (dspc)、胆固醇及1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000 (dmg-peg2000)，sm102与其它辅助分子的比例如表1所示。
92.表1
[0093][0094]
制备的有机相(lnp相)总浓度为12.5mmol/l。
[0095]
6、用制备的脂质体溶液包封溶瘤病毒的dna，即得到前述的脂质 纳米颗粒(lnp)。
[0096]
在本技术实施例中，可以根据脂质纳米颗粒(lnp)的用量大小， 选择包封方法。用量较小时，采用滴加法来制备oh2病毒dna-lnp复 合物，即；用量较大时，使用微流控设备大批量制备前述的脂质纳米颗 粒(lnp)。
[0097]
在本技术实施例中，滴加法操作步骤如下：将oh2病毒dna溶解 在醋酸钠缓冲液(ph5.0、20mmol/l)中，调整oh2病毒dna浓度为 20μg/ml，然后以体积比为4：1(醋酸钠缓冲液相：lnp相)，将lnp 相缓慢滴加至溶有oh2 dna的醋酸钠缓冲液中，滴加过程中缓慢摇晃， 滴加完成后用枪头吹打混匀，孵育5～10min后，加入pbs缓冲液(0.01m， ph7.4)稀释至所需浓度。
[0098]
脂质纳米颗粒(lnp)在抗肿瘤的应用
[0099]
本技术实施例公开了脂质纳米颗粒(lnp)在抗小鼠结肠癌细胞的 应用，所述的脂质纳米颗粒(lnp)包含重组人gm-csf溶瘤ii型单纯 疱疹病毒的基因组dna。
[0100]
1、肿瘤模型建立。
[0101]
选取6～8周龄的雌性balb/c小鼠，在体内植入ct26-irfp(100μl/ 只，1
×
107个/ml)细胞，以此来构建ct26肿瘤模型。
[0102]
2、ct26肿瘤小鼠治疗方案分组
[0103]
ct26肿瘤小鼠培养第9天(以植入ct26-irfp细胞时计为第1天) 作为抗肿瘤治疗的第1天，抗肿瘤治疗分三次，分别在治疗的第1天、 第4天、第7天，治疗方式为注射抗肿瘤试剂。在本技术实施例中，将 ct26肿瘤小鼠分为9组，分别给予不同的治疗方案，分组及治疗方案见 表2所示。
[0104]
表2
[0105][0106]
[0107]
以上组别中，1～4组中，注射的抗肿瘤试剂为“sm102-oh2 dna”， 即包含重组人gm-csf溶瘤ii型单纯疱疹病毒的基因组dna脂质纳米 颗粒(lnp)，所述脂质纳米颗粒(lnp)用前述方法进行制备，1～3组 的注射dna用量分别为500ng、50ng、5ng，注射方式为“瘤内给药途径 (i.t.)”，4组注射dna用量为500ng，注射方式为“静脉给药(i.v.)”； 5组注射的抗肿瘤试剂为sm102脂质体，dna用量为0，注射方式为“i.t.”； 6组为空白对照组，注射的抗肿瘤试剂为pbs缓冲液，dna用量为0， 注射方式为“i.t.”；7组注射的抗肿瘤试剂为“oh2 dna”，即未被包封的 oh2病毒的dna，dna用量为500ng，注射方式为“i.t.”；8组注射的抗 肿瘤试剂为“virus(ccid
50
)”，即oh2病毒，注射用量为1
×
106ccid
50
， 注射方式为“i.t.”；9组注射的抗肿瘤试剂为“dotap-oh2 dna”，即另一 种包裹重组人gm-csf溶瘤ii型单纯疱疹病毒的基因组dna脂质纳米 颗粒，这里我们lnp-2，lnp-2的制备过程中，除了将sm102脂质换为 dotap，其它制备环节与前述脂质纳米颗粒(lnp)一致，此组注射dna 用量为500ng，注射方式为“i.t.”。
[0108]
3、分别在抗肿瘤治疗的第1、4、7、10、14、21、28天观察小鼠体 内肿瘤体积大小。
[0109]
4、抗肿瘤治疗结果与分析。
[0110]
图1～3所示的为接受不同治疗方案的小鼠的肿瘤体积变化结果，即 1～9组的实验结果。图1所示的是按不同时间显示的小鼠肿瘤体积(平均 值)变化，图2所示的是不同组别内各小鼠在接受治疗28天时的肿瘤体 积，从图2可以看出第8组(oh2 virus(i.t.)组)有4只无瘤小鼠，第 1组(sm102-oh2 dna 500ng(i.t.)组)有3只无瘤小鼠，第2组 (sm102-oh2 dna 50ng(i.t.)组)有一只无瘤小鼠，第4组sm102-oh2 dna 500ng(i.v.)组有一只无瘤小鼠，这说明用sm102包封的oh2 dna 即前述的脂质纳米颗粒(lnp)能够起到一定的治疗效果。
[0111]
如图3所示，除了第8组(oh2 virus(i.t.)组)肿瘤的平均体积较 小外，其余组肿瘤平均体积没有明显差别，即根据28天时肿瘤的总平均 体积水平来看，并不能得出图2的结论，出现这种情况的主要原因在植 瘤的过程中肿瘤大小不均一，一般要求在肿瘤平均体积大于100mm3开始 注射药物(此体积是临床前体内药效的指导原则推荐体积，有些文献上 对于难治疗的肿瘤，体积在50mm3就开始给药治疗)，而在植瘤第九天 的时候，有的小鼠肿瘤体积已经超过200mm3甚至更大，这时可能已经错 过了最佳的治疗时间，不能起到很好的治疗效果。
[0112]
基于上述原因，本技术发明人将原始实验数据进行处理，剔除了在 植瘤后第九天(治疗第一天)肿瘤体积≥150mm3的小鼠，然后得到了另 一组实验数据，如图4～6所示。可以看出，不管是从无瘤小鼠数量还是 从平均肿瘤体积大小两方面来看，第1组(sm102-oh2 dna 500ng(i.t.) 组)与第8组(oh2 virus(i.t.)组)的效果均接近。上述结果也提示在 抗肿瘤治疗时，需要严格控制初始的肿瘤体积大小，尽量保证初始肿瘤 体积不要过大且尽量均一。
[0113]
综上所述，本技术公开了包封的溶瘤病毒遗传物质及其应用。本申 请中，提取溶瘤病毒的遗传物质，并通过脂质进行包封，形成包封溶瘤 病毒遗传物质的脂质纳米颗粒(lnp)，如采用本技术发明人自研的重 组人gm-csf溶瘤ii型单纯疱疹病毒(oh2病毒)，通过生产oh2病 毒的遗传物质dna，并用脂质体进行包封，获得包封oh2病毒dna的 脂质纳米颗粒(lnp)。利用所述脂质纳米颗粒(lnp)进行抗肿瘤，可 以解决直接用溶瘤病毒抗肿瘤的过
程中由于溶瘤病毒激活患者的先天免 疫途径而导致患者产生非特异性炎症反应的问题，拥有更好的抗肿瘤效 果。另外，本技术公开了所述所述脂质纳米颗粒(lnp)的制备方法， 所述方法可用于高效制备抗肿瘤药物或疫苗，如包封oh2病毒遗传物质 dna的lnp药物。所述方法不仅降低抗肿瘤药物生产批次的批间差和外 源因子污染的风险，还增强了抗肿瘤药物储存和运输稳定性；有利于抗 肿瘤药物注射方式的进一步拓展。
[0114]
以上所述，仅为本技术较佳的具体实施方式，但本技术的保护范围 并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本技术揭露的技术范 围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本技术的保护范围之内。