1.本发明涉及属于生物材料领域。具体涉及仿生型脱落乳牙干细胞细胞外基质复合神经支架的制备和应用。
背景技术：
2.外周神经损伤（peripheral nerve injury, pni）是指周围神经丛、神经干或其分支受外力作用而发生损伤，神经支配的区域出现感觉、运动和营养障碍，导致身体相关部位自主功能丧失，对患者运动能力造成永久性的损伤，严重影响其心理健康。
3.自体神经移植尽管被认为是 pni 断续治疗的“黄金标准”技术，但是供体神经来源不足、供体区域的失神经支配等问题大大限制其临床应用。随着再生医学的发展，以种子细胞、生长因子和支架材料为要素的神经组织工程技术为 pni 治疗提供了新的希望。在 pni 修复过程中，损伤处神经断端的桥联对于髓鞘形成、神经轴突再生、以及神经功能恢复至关重要。因此，神经支架，又称为神经导管（nerve guide conduit, ngc）的研发成为 pni 再生治疗的重要策略。
4.生长因子和支架材料共同构成了神经再生的微环境。目前神经支架多采用高分子材料等制备导管状神经支架，学者们尝试加载外源性细胞因子对神经支架进行改良。然而，神经支架存在着人工材料生物相容性差，外源性细胞因子加载困难、释放可供性差等问题。因此，新型的富含神经相关细胞因子的天然生物神经支架，亟待研发探索。
技术实现要素：
5.脱落乳牙干细胞（stem cells from exfoliated deciduous teeth, shed）是从人体唯一生理性脱落器官
‑‑
乳牙牙髓组织中分离提取的间充质干细胞，shed来源于胚胎神经嵴，与神经组织高度同源，具有更强的体外扩增能力，独特的成神经向分化能力，更重要的是shed表达神经发育相关的分子信号；细胞外基质（extracellular matrix, ecm）是由细胞分泌到细胞外间充质中的蛋白质和多糖类大分子物质构建的复杂网架结构，形成高度组织有序的细胞外微环境，对细胞生存、组织发育等具有重要调节作用。脱落乳牙干细胞细胞外基质复合神经支架（neural scaffold of extracellular matrix derived from stem cells from exfoliated deciduous teeth, shed-ecmns）是纯天然细胞外基质制备的神经支架，富含神经相关细胞因子，解决了高分子材料神经支架生物相容性差，无法有效加载控释活性生长因子等问题。为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案。
6.一种仿生型shed-ecmns支架制备，其特征在于，包括以下过程：（1）、shed-ecmns内部结构制备，（2）、shed-ecmns外部结构制备，（3）、shed-ecmns制备；所述步骤1包括以下步骤：（a）、体外培养shed接种于10 cm培养皿中，待细胞生长至80%时，更换细胞外基质诱导培养基，诱导培养14d，见皿底形成白色膜样物质，边缘卷曲时，表明shed细胞膜片成
熟；（b）、shed细胞膜片表面上接种shed悬液，待细胞隔夜贴壁后，形成shed复层细胞膜片，将膜片修剪折叠为薄片，包裹于聚四氟乙烯管状模具上培养7d ，拆除管状模具后继续培养7d，获得外周神经样管条状shed细胞聚合体，作为shed-ecmns内部结构；所述步骤2操作为选取充盈状态下大鼠股静脉制备shed-ecmns外部结构；所述步骤3操作过程为：组装shed-ecmns内外部结构，即将股静脉套装于管条状shed细胞聚合体上，获得shed细胞聚合体复合神经支架（neural scaffold of cell aggregation of stem cells from exfoliated deciduous teeth, shed-cans），脱细胞处理后，制备shed-ecmns。
7.一种促进外周神经再生功能产品，包含上述所述的shed-ecmns。
8.进一步的，shed-ecmns是纯天然细胞外基质制备的神经支架，具有外周神经的仿生形态，其长度和直径可以根据损伤神经的尺寸进行个性化制备，以满足不同临床治疗需要。
9.进一步的，shed-ecmns内部结构松散、均质状；外部结构具有天然管腔形态，质地坚韧，具有适宜的机械强度；内外部结构结合紧密相互融合，所述的shed-ecmns 无细胞毒性，具有良好的生物相容性。
10.进一步的，所述的shed-ecmns内部结构来源于与神经组织同源、胚胎神经嵴来源的干细胞
‑‑
shed细胞外基质，同时shed来源于人体唯一生理性脱落器官—乳牙牙髓组，获得容易无创伤。shed-ecmns不仅富含细胞外基质成分；同时富含胚胎神经发育信号和神经相关生物活性物质。
11.进一步的，所述shed-ecmns外部结构具有近似外周神经的管腔状形态，结构致密较韧，具有适宜的机械强度，为外科移植治疗提供缝合基础。
12.进一步的，所述shed-ecmns内部结构具有疏松、多孔、均质的细胞外基质结构，为参与神经再生种子细胞定植生长提供空间支架，促进种子细胞迁移、归巢至神经支架内，所述的神经再生种子细胞包括施万细胞（schwanncell，scs）。
13.进一步的，所述的shed-ecmns支架促进scs细胞迁移能力，scs与shed-ecmns粘附紧密，伸出细胞突起，生长良好。
14.进一步的，所述的shed-ecmns促进scs向修复表型转变，增强scs合成分泌神经营养因子，以促进外周神经修复再生。
15.shed-ecmns在制备促外周神经再生产品或材料中的应用。
16.本发明相对于现有技术来说，所带来的技术效果。
17.1、shed-ecmns来源于胚胎神经嵴，与神经组织高度同源，富含神经生长发育相关生物活性物质，强阳性表达神经细胞标记物巢蛋白和β微管蛋白iii，能够为外周神经再生提供胚胎早期发育信号和丰富神经相关细胞因子，以促进外周神经再生。
18.2、shed-ecmns具有天然神经仿生形态和结构，可以根据损伤神经尺寸进行个性化制备；管壁薄、质地韧，为神经支架移植提供缝合基础；官腔中细胞外基质，具有适宜支架空间并富含神经相关细胞因子，有利于外周神经再生，减少神经瘤发生。
19.3、shed-ecmns完全来源于天然组织和细胞，脱细胞处理后避免免疫源性，具有优秀的生物相容性，适宜的降解性能，临床应用安全性高。
20.4、shed-ecmns具有与天然神经相似的机械强度，有效防止神经桥联坍塌变形，适
用于离断型pni治疗应用。
附图说明
21.图1是shed-ecmns 设计制备图。
22.图2是shed 细胞膜片观察图。
23.图3是shed 复层细胞膜片观察图。
24.图4是shed 细胞聚合体制备图。
25.图5是 shed-ecmns 组装制备图。
26.图6是shed-ecmns dapi染色观察图。
27.图7是shed-ecmns dna琼脂糖凝胶电泳实验图。
28.图8 是shed-ecmns h&e染色观察图。
29.图9是 shed-ecmns 扫描电镜观察图。
30.图10是shed-ecmns 细胞外基质及神经蛋白免疫染色图。
31.图11是shed-ecmns 抗拉强度检测图。
32.图12是shed-ecmns 体外降解率分析图。
33.图13是shed-ecmns 细胞毒性检测图。
34.图14是scs在shed-ecmns生长，扫描电镜观察图。
35.图15是scs在shed-ecmns迁移，dapi染色观察图。
36.图16是使用shed-ecmns条件培养基培养scs，mtt实验图。
37.图17是使用shed-ecmns条件培养基培养scs，ki67染色观察图。
38.图18是使用shed-ecmns条件培养基培养scs，划痕实验观察图。
39.图19是使用shed-ecmns条件培养基培养scs，transwell实验观察图。
40.图20是使用shed-ecmns条件培养基培养scs，c-jun、sox2的western blot表达图。
41.图21是使用shed-ecmns条件培养基培养scs，c-jun、sox2的免疫荧光染色观察图。
42.图22是使用shed-ecmns条件培养基培养scs，bdnf、ngf的 western blot表达图。
43.图23是shed-ecmns移植治疗，对坐骨神经功能指数的影响。
44.图24是shed-ecmns移植治疗，对新生神经轴突、施万细胞恢复的影响。
45.图25是shed-ecmns移植治疗，对新生神经髓鞘恢复的影响。
46.图26是shed-ecmns移植治疗，对新生神经有髓轴突恢复的影响。
47.图27是shed-ecmns移植治疗，对大鼠坐骨神经支配腓肠肌湿重恢复的影响。
48.图28是shed-ecmns移植治疗，对大鼠坐骨神经支配腓肠肌组织学形态的影响。
具体实施方式
49.实施例1。
50.一、shed-ecmns设计制备与表征鉴定。
51.1、shed 原代分离培养。
52.离体牙齿迅速置于含双抗的α-mem中，4℃运输。在超净工作台内，含双抗 pbs 反复冲洗牙齿3-4次，将牙齿转移至无菌培养皿中。无菌的拔髓针取出乳牙牙髓组织，充分切碎，加入3 mg/ml i型胶原酶和4 mg/ml 中性蛋白酶。在37℃、5% co2培养箱中消化30 min，
至肉眼见无明显的组织块，加入等体积培养基中和。经70
ꢀµ
m细胞筛过滤后，接种于10 cm培养皿，置于37℃、5% co2培养箱中培养。每3-4 d换液。培养2 w后见单克隆形成，消化传代培养。
53.2、shed-ecmns构建shed-ecmns构建设计参照图1所示。
54.2.1、shed-ecmns内部结构制备。
55.shed以1
×
106个/ml 密度接种于10 cm培养皿中，待细胞生长至70-80%时，更换细胞外基质诱导培养基。如图2所示，诱导培养14d，见皿底形成白色膜样物质、边缘卷曲时，表明shed细胞膜片成熟。如图3所示，在shed细胞膜片上接种1
×
106个/10 cm培养皿密度shed，待细胞隔夜贴壁后，形成shed复层细胞膜片。如图4将复层膜片修剪折叠为宽15mm的薄片，包裹于直径为0.8mm的聚四氟乙烯管状模具上，培养7d后更换直径为0.15mm的管状模具，继续培养7d后拆除管状模具，继续培养7d，获得外周神经样管条状shed细胞聚合体，作为shed-ecmns内部结构。
56.2.2、shed-ecmns外部结构制备。
57.通过常规技术获取大鼠股静脉，选择充盈状态下直径约为2 mm的股静脉制备神经支架外部结构。显微镊子轻柔分离静脉细小分支，使用22 g 0.9
×
25 mm 的一次性静脉留置针穿入股静脉内，结扎远心端及近心端，置于留置针上游离取下，储存于20%双抗 pbs中，4℃保存备用。
58.2.3、shed-ecmns制备。
59.如图5所示，图中（a）获得管条状shed细胞聚合体，即shed-ecmns内部结构；（b）分离获取股静脉，即shed-ecmns外部结构；（c）组装内、外部结构，即将股静脉套装在管条状shed细胞聚合体表面，获得shed-cans；（d）脱细胞处理后，制备shed-ecmns。将shed细胞聚合体内部结构和股静脉外部结构组装，用pbs洗3 min
×
3次；浸泡于含有3% triton x-100的pbs中，37℃条件下进行脱细胞处理72 h，pbs 洗3 min
×
3次，获得脱细胞处理的shed-ecmns。
60.3、shed-ecmns脱细胞效果评价。
61.3.1、dapi染色鉴定shed-ecmns脱细胞效果。
62.shed-ecmns 4%多聚甲醛固定24 h后，蔗糖梯度脱水，oct包埋，16 μm连续切片。冰冻切片复温，pbs洗10 min
×
3次；含dapi抗荧光淬灭封片剂封片，荧光显微镜拍照观察，检测细胞核残留情况，如图6所示，shed-ecmns内未见明显dapi阳性染色细胞核（脱细胞前shed-cans内见大量dapi阳性染色的细胞核结构），表明shed-ecmns脱细胞成功。
63.3.2、dna琼脂糖凝胶电泳实验鉴定shed-ecmns脱细胞效果。
64.采用dna提取试剂盒，分别提取shed-ecmns中的dna。根据欲分离dna的片段大小，配制浓度为1.5%的琼脂糖凝胶，倒入电泳槽中，待其凝固30-45 min后安放在电泳槽内。向电泳槽内倒入电泳缓冲液，其量以没过胶面1mm为宜。在dna样品中加入10x体积的上样缓冲液，混匀后，将样品混合液缓缓加入被浸没的凝胶加样孔中。接通电源，60-100 v电泳20-40 min。如图7所示，shed-ecmns组未见明显dna条带（脱细胞前shed-cans组可见大量dna条带），提示shed-ecmns无dna残留，表明shed-ecmns脱细胞成功。
65.4、shed-ecmns组织学及显微结构观察。
66.shed-ecmns在4%多聚甲醛固定24h后，石蜡包埋，7μm连续切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水洗，苏木精染色5 min，自来水洗去浮色，1%盐酸酒精分色，0.5%伊红溶液复染。梯度乙醇脱水、二甲苯透明、树胶封片，显微镜拍照观察。如图8所示，经过h&e染色显示，shed-ecmns内部shed-ecm结构松散、均质状，无细胞核结构，内外部结构结合紧密、相互融合。
67.shed-ecmns在2.5%戊二醛中4℃固定24 h，pbs洗20 min
×
3次。之后依次在30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%酒精中梯度脱水处理，每个浓度浸泡20 min。最后对样品进行自然干燥、喷金镀膜处理后，在扫描电镜中观察材料的表面及横截面结构，如图9所示，通过扫描电镜观察，shed-ecmns横截面为结合紧密的内外部结构（图9 a）；外部脱细胞静脉表面呈波浪皱折状，未见明显细胞结构（图9 b）；内部shed-ecm与外部脱细胞静脉融合紧密、无明显界限（图9 c）；内部shed-ecm断面为均质状，见大量纵向细小孔隙贯穿其中（图9 d）。
68.5、shed-ecmns吸水率及孔隙率分析。
69.shed-ecmns放置于-80℃冰箱中冷冻2 h，然后置于冷冻干燥机中冻干10 h，待其质量恒定后，记其干重为 w1（mg）。将冻干后的shed-ecmns浸泡于pbs中，置于4℃、24h待其质量恒定，记其湿重为w2（mg），吸水率（%）=（w2-w1）/w1。上述实验过程重复3次，计算平均值作为结果。
70.将冻干后的shed-ecmns置于体积为v1（μl）的去离子水中，24 h后待液面不再产生变化，记shed-ecmns与去离子水的总体积为v2（μl）。将含去离子水的支架材料移出后，记所剩去离子水体积为v3（μl），孔隙率（%）=（v1-v3） /（v2-v3）。
71.表1 shed-ecmns体积及重量。
72.。
73.表2shed-ecmns孔隙率及吸水率。
74.。
75.从表1可中看出：孔隙率检测显示，shed-ecmns在干燥及湿润状态下总体积分别为2.57
ꢀ±ꢀ
0.23mm3和7.32
ꢀ±ꢀ
0.46 mm3；吸水率检测显示，shed-ecmns在干燥及湿润状态下总重量分别为3.09
ꢀ±ꢀ
0.12 mg和45.40
ꢀ±ꢀ
1.02 mg。
76.从表2可中看出：shed-ecmns的孔隙率为64.62
±
4.73%，shed-ecmns的吸水率为1370.46
ꢀ±ꢀ
72.71%，shed-ecmns吸水性能主要由shed-ecm提供。
77.6、shed-ecmns蛋白表达检测。
78.shed-ecmns在4%多聚甲醛固定24 h，蔗糖梯度脱水，oct包埋，制备12 μm冰冻切片。pbs洗10 min
×
3次；0.3% triton x-100透化2-5 min；pbs洗10 min
ꢀ×
3次；10%山羊血
清室温封闭45 min；加入anti-collagen i（1：250）、anti-fibronectin （1：250）、anti-nestin（1：200）、anti-β iii-tubulin（1：1000），4℃孵育过夜；pbs洗10 min
×
3 次，加入将山羊抗兔荧光二抗（1：200），室温避光孵育 2 h；pbs洗10 min
×
3 次，含dapi的抗荧光淬灭封片剂封片，荧光显微镜观察并拍照。如图10所示，免疫荧光染色显示，shed-ecmns富含细胞外基质蛋白collagen i、fibronectin；shed-ecmns阳性表达神经相关蛋白βiii-tubulin、nestin。
79.7、shed-ecmns抗拉强度检测。
80.使用care m-3000电子万能实验机，以天然神经（native nerve, nn）和脱细胞神经（acellular nerve, an）为对照，对shed-ecmns加载速度为 0.11 mm/s的拉力，获得时间-位移曲线。测量支架材料在无应力情况时的横截面积及初始长度，获得应力-应变曲线，计算其极限应力（kpa）及杨氏模量（kpa）。如图11所示，shed-ecmns及an的极限应力及杨氏模量均显著低于nn（p＜0.001），但shed-ecmns的极限应力（p＜0.01）及杨氏模量（p＜0.05）显著高于an。表明shed-ecmns在弹性变形阶段可承受的最大应力值大于an，且在相同应力作用下，发生的弹性形变小于an。
81.8、shed-ecmns体外降解率分析。
82.取20（
±ꢀ
0.1）mg shed-ecmns置于4 ml pbs，37℃、5% co2培养箱中降解8 w，每周取样1次。用ph计在各时间点检测降解液ph值；称量各样品的湿重，称重后将样品重新放回原降解液继续降解。如图12所示，检测显示降解液ph为7.23-6.58 之间，呈现出缓慢轻微下降的趋势，提示shed-ecmns在降解过程中保持环境ph为中性（图12a）；shed-ecmns在最初2周内降解较快，之后6周降解速度减慢，在8周失重率为42.43%（图12b）。
83.9、shed-ecmns细胞毒性检测。
84.按照国际标准iso10993.12，按每 0.1 g shed-ecmns加入1ml d-mem培养基；按照国际标准iso 10993.5，在37℃、5% co2培养箱中孵育24 h，制备shed-ecmns 浸提液，并配置25%、50%、75%、100%四个浓度的条件培养基（含10%胎牛血清，100 u/ml青霉素和100 μg/ml链霉素）。按照 iso 10993.5采用ccl1细胞系（l929细胞是检测生物支架材料细胞毒性的经典细胞系）进行细胞毒性实验。将l929细胞以1
×
105个/ml的密度接种到96孔板中，培养24 h。实验组为shed-ecmns条件培养基，对照组为正常培养基。分别在培养1、2、3 d，向每孔加入10μl cck8溶液，将培养板在37℃、5%co2培养箱内避光孵育2 h。选择450 nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，相对增殖率（条件培养基处理组od值/阴性对照组组od值）为纵坐标，绘制细胞生长曲线。如图13所示：25%、50%、75%、100%条件培养基处理组细胞相对增殖率，在不同时间点无显著性差异（p＞0.05）；第1、2、3 d时，各不同浓度条件培养基处理组细胞相对增殖率均＞70%，表明shed-ecmns 无细胞毒性，具有良好的生物相容性。
85.二、shed-ecmns对施万细胞（schwanncell，scs）生物学功能的影响。
86.1、scs在shed-ecmns上的附着情况。
[0087]5×
105个细胞/ml scs细胞悬液滴注于shed-ecmns表面，加入足量培养基浸没支架，置于37℃、5% co2的培养箱中培养4h。4%多聚甲醛中固定支架24 h，pbs洗3次，依次在30%、50%、70%、90%和100%的乙醇中脱水15 min，样本冷冻干燥、金属镀膜，固定于扫描电子显微镜标本台上，观察、拍照。如图14所示，shed-ecmns与scs共培养，scs与ecm支架粘附紧
密，生长良好，伸出更长的细胞突起。
[0088]
2、scs在shed-ecmns上的迁移情况。
[0089]1×
104个细胞/ml scs细胞悬液滴注于shed-ecmns一端，30min后，再次滴注5 μl细胞悬液，1h后，加入足量培养基浸没支架，置于37℃、5% co2的培养箱中培养3d和7d。4%多聚甲醛固定样本24 h，蔗糖溶液梯度脱水，oct包埋，制作15
ꢀµ
m冰冻切片（切片温度-20℃），dapi染色，倒置荧光显微镜下观察、拍照。如图15所示，随培养时间明显增多，scs沿支架向另一端迁移明显，同时向支架内部迁移浸润。
[0090]
3、shed-ecmns对scs增殖能力影响。
[0091]
3.1、mtt实验检测shed-ecmns对scs增殖能力影响。
[0092]
以1
×
103个细胞/孔scs接种于培养板（96孔板），分别采用条件培养基（shed-ecmns组）、常规培养基（对照组）培养，置于37
ꢀº
c、5% co2的培养箱中培养。分别在1d、2d、3d时加入10 μl/孔mtt溶液，孵育4h，吸弃溶液后，加入200 μl二甲基亚砜，摇床低速振荡10min，使结晶物充分溶解。酶联免疫检测仪在波长490nm处测量各孔的吸光值。如图16所示，mtt实验表明，shed-ecmns对scs细胞活性和细胞增殖无明显影响。
[0093]
3.2、ki67染色检测shed-ecmns对scs增殖能力影响。
[0094]
以2
×
104个细胞/孔 scs接种于预置细胞爬片的培养板（12孔板），分别采用条件培养基（shed-ecmns组）、常规培养基（对照组）培养36h。标本4%多聚甲醛固定30 min，0.3% triton x-100的封闭缓冲液封闭1 h，anti-ki67抗体（1：400），4℃孵育过夜，pbs冲洗，室温孵育山羊抗兔荧光二抗（1:200）2h，pbs冲洗，含dapi抗荧光淬灭封片液封片，荧光显微镜观察，选取4个视野，计数ki67阳性细胞数和总细胞数，计算ki67阳性细胞数百分比。如图17所示，ki67染色均表明，shed-ecmns对scs细胞活性和细胞增殖无明显影响。
[0095]
4、shed-ecmns对scs迁移能力影响。
[0096]
4.1、划痕实验检测shed-ecmns对scs迁移能力影响。
[0097]
以5
×
105个细胞/孔scs接种于培养板（6孔板）中，分别采用条件培养基（shed-ecm组）、常规培养基（对照组）培养，置于37℃，5%co2的培养箱中培养24h。200 μl无菌枪头沿培养孔的中心作细胞划痕，pbs轻轻冲洗去除游离细胞碎片，分别于0h、12h、24h、36h倒置光学显微镜下观察拍照，使用image j软件分析计算细胞划痕愈合率。如图18所示，划痕实验表明，shed-ecmns明显促进scs细胞迁移能力。
[0098]
4.2、transwell实验检测shed-ecmns对scs迁移能力影响。
[0099]
采用8 μm孔径transwell小室系统，小室内接种5
×
104个/ml scs悬液200 μl，小室外分别采用条件培养基（shed-ecmns组）、常规培养基（对照组）培养，置于37℃，5%co2的培养箱中培养24h。样本4%聚甲醛固定30min，用棉签拭净transwell小室膜上表面细胞，0.5%结晶紫染色，倒置光学显微镜下观察拍照。随机选取5个视野，使用image j软件分析计数结晶紫阳性细胞数目。如图19所示，transwell实验均表明，shed-ecmns明显促进scs细胞迁移能力。
[0100]
5、shed-ecmns对scs向修复表型转变的影响。
[0101]
5.1 western blot检测shed-ecmns对scs修复表型相关因子的影响。
[0102]
以2
×
105个细胞/孔scs接种于六孔板中，分别采用条件培养基（shed-ecmns组）、常规培养基（对照组）培养，置于37℃，5% co2的培养箱中培养7 d，每2天换液1次。预冷pbs
冲洗，加入60 μl细胞裂解液，细胞刮收集细胞，冰上裂解1 h，每15 min涡旋一次，而后4
º
c、12,000 rpm离心5 min，提取上清液，-80
ꢀº
c贮存备用。取20 μg蛋白样本在12% sds-page中进行电泳（电泳条件：120 v，90 min），然后将蛋白转至pvdf膜上（转膜条件：200 ma，90 min）。5% bsa封闭1h；anti-c-jun（1：1000），anti-sox2（1：1000）4
°
c孵育过夜；tbst洗膜，室温孵育兔抗鼠荧光二抗（1：1000）1h；应用odyssey clx红外双色荧光成像系统检测蛋白条带，使用image pro plus 6.0 软件对条带进行图像分析。如图20所示，western blot实验显示shed-ecmns组scs中修复表型相关因子c-jun和sox2表达明显升高。
[0103]
5.2、免疫荧光染色检测shed-ecmns对scs修复表型相关因子的影响。
[0104]
以2
×
104个细胞/孔 scs接种于预置细胞爬片的培养板（12孔板），分别采用条件培养基（shed-ecmns组）、常规培养基（对照组）培养48h。标本4%多聚甲醛固定30 min，0.3% triton x-100的封闭缓冲液封闭1 h，anti-c-jun抗体或anti-sox2抗体（1：100），4℃孵育过夜，pbs冲洗，室温孵育山羊抗兔荧光二抗（1：200）2h，pbs冲洗，含dapi抗荧光淬灭封片液封片，荧光显微镜观察，选取4个视野，计数c-jun或sox2阳性细胞数和总细胞数，计算阳性细胞数百分比。如图21所示，免疫荧光染色检测到shed-ecmns组修复表型相关因子c-jun和sox2阳性表达的scs明显增多。
[0105]
6、shed-ecmns对scs分泌神经营养因子的影响。
[0106]
以2
×
105个细胞/孔scs接种于六孔板中，分别采用条件培养基（shed-ecmns组）、常规培养基（对照组）培养，置于37℃，5% co2的培养箱中培养7 d，每2天换液1次。预冷pbs冲洗，加入60 μl细胞裂解液，细胞刮收集细胞，冰上裂解1 h，每15 min涡旋一次，而后4
º
c、12,000 rpm离心5 min，提取上清液，-80
ꢀº
c贮存备用。取20 μg蛋白样本在12% sds-page中进行电泳（电泳条件：120 v，90 min），然后将蛋白转至pvdf膜上（转膜条件：200 ma，90 min）。5% bsa 封闭1h；一抗anti-bdnf（1：500），anti-ngf（1：500），4
°
c 孵育过夜；tbst洗膜，室温孵育兔抗鼠荧光二抗（1：1000）1h；应用odyssey clx红外双色荧光成像系统检测蛋白条带。如图22所示，western blot实验检测到shed-ecmns组scs中神经营养因子bdnf和ngf表达水平明显升高。
[0107]
三、shed-ecmns促进大鼠外周神经离断型损伤修复。
[0108]
1、动物实验分组。
[0109]
⑴
pni组：大鼠右侧10mmm坐骨神经离断模型。
[0110]
⑵
shed-ecmns组：移植shed-ecmns治疗坐骨神经离断损伤。
[0111]
⑶
ang组（临床金标准治疗组）：自体神经原位翻转移植治疗坐骨神经离断损伤。
[0112]
2、动物实验过程。
[0113]
sd大鼠在安静、清洁、昼夜12 h交替的环境中喂养。采用小动物麻醉机进行异氟烷吸入麻醉。在显微镜下分离、显露大鼠右侧坐骨神经。在神经三支分叉以上、坐骨结节下制备10mm离断型神经损伤模型。模型构建成功后，shed-ecmns组进行shed-ecmns移植缝合；使用8-0显微镜缝合线进行神经外膜与shed-ecnms外部结构的吻合，保持吻合处无张力，留置显微缝线于该损伤区外膜上作为标记。ang组进行自体神经原位水平180
°
翻转移植缝合。逐层缝合肌肉以及皮肤，消毒手术区域，术后进行抗感染治疗，正常分笼饲养，连续观察3个月。
[0114]
3、shed-ecmns对大鼠坐骨神经功能恢复的影响。
[0115]
分别于术后2、4、6、8、10、12周采用catwalk xt 步态分析系统检测大鼠术后患侧后肢坐骨神经功能指数（sciatic function index, sfi），评估功能恢复情况。根据大鼠的体型调整跑道的宽度，调截摄像机位置和设置软件参数。测试前对大鼠进行训练，使大鼠能在无引导情况下在跑道上匀速行走，然后使用catwalk xt 步态分析系统自动记录运动轨迹并分析运动参数。选实验侧（右侧）足底印记（e）、正常侧（左侧）足底印记（n），足印测定3个变量：足印长度（pl）为后足跟至前足趾之间的距离、足趾宽度（ts）为第1足趾至第5足趾之间的距离、中间足趾距离（it）为第2足趾至第4足趾之间的距离。计算公式如下：sfi=-38.3（epl-npl）/npl+109.5（ets-nts）/nts+13.3（eit-nit）/nit-8.8。如图23所示，术后第2、4、6、8、10、12周，坐骨神经功能指数（sfi）检测显示，shed-ecmns组与ang移植组的坐骨神经功能恢复程度无显著性差异。表明术后第12周，shed-ecmns组大鼠的患侧后肢行为恢复与ang组无显著差别。
[0116]
4、shed-ecmns对新生神经轴突、施万细胞恢复的影响。
[0117]
术后第6、12周处死部分大鼠，分别获取手术区全长、手术区中央3mm和手术区远端3mm神经标本。在4%多聚甲醛固定72h后，石蜡包埋，3μm连续切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水洗。pbs洗10 min
×
3次，0.3% triton x-100透化2-5 min；pbs洗10 min
×
3次，10%山羊血清室温封闭45 min；加入anti-s100（1：100）、anti-nf200（1：100），4℃孵育过夜；pbs洗10 min
×
3次，加入将山羊抗兔荧光二抗（1：200），室温避光孵育2 h；pbs洗10 min
×
3次，含dapi的抗荧光淬灭封片剂封片，荧光显微镜观察并记录样本。如图24所示，术后第6、12周，免疫荧光染色显示，scs标记蛋白s100及轴突标记蛋白nf200在shed-ecmns组损伤神经中央及远端均阳性表达，表明新生神经达到损伤远端，与ang组相比无明显差异。表明术后第12周，shed-ecmns组的新生轴突成功延伸至损伤神经远端。
[0118]
5、shed-ecmns对新生神经髓鞘恢复的影响。
[0119]
术后第6、12周处死部分大鼠，获取手术区远端3mm神经标本。使用4%戊二醛预冷固定神经标本，用1%四氧化三铯后固定，洗涤，脱水，包埋在epon 812环氧树脂中。超薄切片后进行柠檬酸铅和醋酸铀酰双重染色。透射电子显微镜观察，并从每个切片的5个随机区域获取图像记录样本，image j软件测定分析。如图25所示，术后第12周，透射电镜显示，shed-ecmns组的再生神经远端髓鞘厚度与ang组无显著差异，shed-ecmns组的有髓神经纤维直径低于ang组，但有髓神经纤维总横截面积与ang组无显著性差异。
[0120]
6、shed-ecmns对新生神经有髓轴突恢复的影响。
[0121]
术后第6、12周处死部分大鼠，获取手术区远端3mm神经标本。在4%多聚甲醛固定72h后，石蜡包埋，3μm连续切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水洗。甲苯胺蓝染色20-30min，去离子水洗5min
×
3次，0.5%冰乙酸分化。脱水、透明、树脂胶封片，显微镜观察并记录样本。如图26所示，术后第12周，甲苯胺蓝染色显示，shed-ecmns组的有髓轴突数量显著高于ang组，shed-ecmns组的总轴突数目低于ang组。
[0122]
7、shed-ecmns对大鼠坐骨神经支配腓肠肌湿重恢复的影响。
[0123]
术后第6、12周处死部分大鼠，分离手术侧和健侧腓肠肌。测量各腓肠肌湿重，观察萎缩情况并拍照记录。如图27所示，术后第12周，shed-ecmns与ang两组的腓肠肌湿重恢复率之间无显著性差异。表明shed-ecmns组坐骨神经所支配的患侧腓肠肌湿重恢复情况与ang组无显著差异。
[0124]
8、shed-ecmns对大鼠坐骨神经支配腓肠肌组织学形态的影响。
[0125]
术后第6、12周处死部分大鼠，分离手术侧和健侧腓肠肌，取腓肠肌中央最大直径从处标本。在4%多聚甲醛固定72h后，石蜡包埋，3μm连续切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水洗。weigert铁苏木素染色5-10min，酸性乙醇分化5-15s，水洗；masson蓝化液返蓝3-5min，水洗；丽春红品红染色5-10min，弱酸洗1min；磷钼酸溶液洗1-2min，弱酸洗1min。苯胺蓝染色1-2min，弱酸洗1min。脱水、透明、树脂胶封片，显微镜观察并记录样本，image j软件测定分析。如图28所示，术后第12周，masson染色显示，shed-ecmns组的肌纤维横截面积与ang组无显著差异，shed-ecmns组的胶原纤维容积低于ang组。