一种可注射型骨水泥及其制备方法和应用

1.本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种可注射型骨水泥及其制备方法和应用。


背景技术：

2.随着全球老龄化趋势的急剧发展，骨质疏松的病发率正在急速增加。骨质疏松症导致全世界每年超过800万例骨折，已经成为了困扰人类又一重大疾病。骨质疏松性椎体压缩性骨折(ovcfs)是一种全身性、多因素疾病，伴有骨质减少和骨量丢失，可破坏骨的微观结构并增加骨的脆性，从而阻碍日常活动并降低生活质量。目前主要是有两种标准的微创治疗，一种是椎体后凸成形术(pkp)，另外一种是经皮椎体成形术(pvp)。在这样的大背景下，骨水泥注射技术开始应用于脊柱疾病，用于帮助恢复椎体的稳定性和缓解病患者的疼痛。目前市场上已有多种骨水泥产品，如pmma(聚甲基丙烯酸)骨水泥、磷酸钙骨水泥、硫酸钙骨水泥等，它们之间各有优劣。基于pmma的各种优异特性，例如，易于注射、机械支撑高、成本低和良好的可塑性等，使它成为临床上最常用的治疗方法。此外，pmma骨水泥也存在一些局限性：(1)pmma作为生物惰性材料，不具备生物活性，尤其是缺乏骨诱导能力。(2)高的机械强度可能会导致应力屏蔽现象，造成附近的椎骨骨折。(3)骨水泥在聚合的过程中会会释放大量的热量，损伤周围的组织和细胞。
3.天然骨骨粉，它的结构类似羟基磷灰石，易于塑形并且来源广泛，在骨粉的制备过程中经过物理和化学的方法脱脂托蛋白处理，并且在高温下煅烧，消除了抗原性，解决了生物相容性的问题。并且对比其他类型的生物陶瓷材料，例如硅酸钙，磷酸钙，生物活性玻璃等，具有更强的骨传导性，在组成和结构上更加匹配人体骨组织。通过将天然骨骨粉和pmma骨水泥复合可以极大提升材料的生物活性。将骨水泥植入病患者的体内常常会伴随着细菌感染，常用的解决办法是向骨水泥加入了抗生素。虽然这样做可以在一定程度上起到抗菌的作用，但是释放效率低，并且抗菌效果不明显。
4.因此，开发一种具备优异成骨活性同时又具备较好的抗菌作用的聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥是有待解决的问题。


技术实现要素：

5.为了解决现有技术存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种可注射型骨水泥及其制备方法和应用。本发明提供一种脱脂脱蛋白后的天然骨骨粉，经过表面修饰后吸附上mg
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，然后封装上一层壳聚糖季铵盐薄膜。通过将改性后的天然骨粉加入到pmma骨水泥中，不仅赋予了骨水泥良好的生物活性和成骨诱导能力，同时还具备抗菌性，避免骨缺损处发生感染。
6.本发明的目的通过以下技术方案实现：
7.一种可注射型骨水泥的制备方法，包括如下步骤：
8.(1)首先将脱脂脱蛋白的天然骨在600～900℃下烧结4h，然后球磨后用无水乙醇
和水交替清洗后经干燥得到天然骨骨粉；
9.(2)将步骤(1)所述的天然骨粉浸入可溶性镁盐溶液中，并搅拌后将骨粉滤出来，烘干后备用；
10.(3)将壳聚糖季铵盐(hacc)溶解于水中，在60～80℃下搅拌4～7h，同时加入交联剂，调节体系ph为8～11进行交联反应，交联反应结束后，得到凝胶溶液，调节凝胶溶液ph为7；经透析纯化后，加入甘油和步骤(2)烘干后的骨粉，搅拌后取出干燥，制得外层包裹有壳聚糖季铵盐薄膜和负载mg
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的骨粉，记作bone-mg
2+-hacc；
11.(4)将固体组分和液体组分按照1.8～2.3g:1ml的比例将固体和液体混合，并在50～80℃下凝固15～23min，即制备得到所述可注射型骨水泥；
12.所述固体组分按质量百分比计，含有10～20wt％的bone-mg
2+-hacc、64～81.5wt％的p(mma-ma)共聚物、8～15wt％的显影剂和0.5～1wt％的引发剂；
13.所述液体组分按体积百分比计，含有98～98.5％的甲基丙烯酸甲酯(mma)单体和1.5～2％促进剂，还包括阻聚剂；所述阻聚剂的含量与甲基丙烯酸甲酯和促进剂的总体积比为5～10ppm：1ml。
14.优选的，步骤(1)中，脱脂脱蛋白的天然骨的制备方法，包括如下步骤：取小牛的松质骨切成小块进行煮沸、干燥，再依次浸泡在0.3～0.8mol/l氢氧化钠溶液和15～30wt％双氧水中浸泡12小时以上。
15.优选的，步骤(2)中，可溶性镁盐为氯化镁。
16.优选的，步骤(2)中，可溶性镁盐溶液的浓度为0.1～0.3mol/l。
17.优选的，步骤(2)中，搅拌的时间为2h，所述烘干的时间为3h。
18.优选的，步骤(3)中，壳聚糖季铵盐为n-(2-羟基)丙基-3-三甲基壳聚糖氯化铵。
19.优选的，步骤(3)中，壳聚糖季铵盐在水中的浓度为2～5wt％。
20.优选的，步骤(3)所述交联剂为环氧氯丙烷，所述交联剂与壳聚糖季铵盐的比例为2ml:1g。
21.优选的，步骤(3)中，加入交联剂，调节体系ph为10。
22.优选的，步骤(3)中，交联反应的时间为3h。
23.优选的，步骤(3)中，透析纯化的方式为：使用截留分子量为3500d的透析袋在离子水中透析2天。
24.优选的，步骤(3)中，甘油的加入量与壳聚糖季铵盐的比例为0.08～0.15ml:0.8～1.5g。
25.优选的，步骤(3)所述烘干后的骨粉的加入量和壳聚糖季铵盐的比例为15～8：1.5～0.8。
26.优选的，步骤(3)中，加入甘油和步骤(2)烘干后的骨粉，搅拌4h后取出并在60℃下干燥5h。
27.优选的，步骤(4)中，p(mma-ma)共聚物按照如下步骤制备得到：将聚乙烯醇和碱式碳酸镁加入到水中得到分散液，其中聚乙烯醇的浓度为1～3wt％；碱式碳酸镁的浓度为2wt％；再加入体积比为4：1的甲基丙烯酸甲酯(mma)和丙烯酸甲酯(ma)，甲基丙烯酸甲酯(mma)和丙烯酸甲酯(ma)的总体积与分散液的体积比为4～6：1～3；混合均匀后通入氮气排空气体，反应温度为60～80℃，加入引发剂偶氮二异丁腈，整个反应过程持续6小时，将反应
产物洗涤干净、烘干、球磨即可。
28.优选的，所述引发剂偶氮二异丁腈的加入量占分散液的0.4～0.8wt％。
29.优选的，步骤(4)中，显影剂为zro2，所述引发剂为过氧化苯甲酰(bpo)。
30.优选的，步骤(4)中，促进剂为n,n-二甲基对苯甲胺(dmpt)，所述阻聚剂为对苯二酚。
31.上述一种可注射型骨水泥的制备方法制备得到的可注射型骨水泥。
32.所述可注射型骨水泥在制备骨缺损材料中的应用。
33.与现有技术相比，本发明的有益效果包括：
34.(1)天然骨骨粉相较于磷酸钙类的材料，例如羟基磷灰石，磷酸三钙等，在组成和结构上与骨组织更加相似，在成骨诱导能力上对比其他材料更加出色。因为p mma本就是惰性生物材料，复合天然骨骨粉增加了骨水泥的生物活性和促进骨组织生长。同时能够分散自由基聚合反应时产生的热量，降低聚合温度，减少对周围组织的损伤。在双组份混合时，能够降低预聚合时的粘度，大大延长操作时间。
35.(2)修饰过后的骨粉吸附有mg
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，作为一种微量金属在影响骨组织愈合过程中的成骨信号通路扮演重要作用，促进细胞外基质钙结节的形成。
36.(3)在复合天然骨骨粉外层包裹的壳聚糖季铵盐薄膜，还能在愈合过程起到抗菌的作用，对比市面上常用的抗生素如庆大霉素，季铵盐独特的杀菌机制能够避免细菌耐药性的产生，而且封装后的mg
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会在骨愈合过程中持续释放，避免了其突释。同时还能延缓天然骨的降解速率，壳聚糖季铵盐上的丰富基团能对ca
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，po
32-产生相互作用，从而加速矿化沉积速率，提高骨水泥和骨组织之间的界面粘合力，解决一直以来pmma植入体内产生的松动问题。
附图说明
37.图1为实施例3制备得到的可注射型骨水泥的实物图。
38.图2为实施例所述p(mma-ma)共聚物的红外光谱数据。
39.图3为实施例1步骤(1)所制得得天然骨骨粉的xrd图谱。
40.图4为实施例2～3制备的目标产物和对比例1制得的产物的抗菌性能对比图，其中，从左到右，依次对应对比例1、实施例2和实施例3。
41.图5为实施例2～3制备的目标产物和对比例1制得的产物的促alp表达的结果对比图，从左到右，依次对应对比例1、实施例2和实施例3。
42.图6为实施例2～3制备的目标产物和对比例1制得的产物的促opg表达的结果对比图，从左到右，依次对应对比例1、实施例2和实施例3。
43.图7实施例3制得的目标产物和对照组对大鼠颅骨缺损修复再生后的标本照片图。
44.图8为实施例3制得的目标产物和对照组对大鼠颅骨缺损修复再生后的ct扫描照片，其中，上图为俯视图，下图为横截图。
45.图9为实施例3制得的目标产物和对照组对大鼠颅骨缺损修复再生后进行micro-ct扫描仪将颅骨标本进行扫描重构，测得的图像中的bv/tv(骨体积与总体积之比)对比柱状图。
46.图10为实施例3和对比例1制得的目标产物对大鼠颅骨缺损修复再生后进行
micro-ct扫描仪将颅骨标本进行扫描重构，测得的图像中的tb.n(骨小梁数)对比柱状图。
具体实施方式
47.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
48.所述大鼠骨髓间充质干细胞由4周龄sd大鼠股骨和胫骨骨髓腔提取。
49.所述成骨诱导液：含10％fbs的α-mem培养液，10mmol/lβ甘油磷酸钠，0.05mmol/l维生素c和100mmol/l地塞米松。
50.所述碱性磷酸酶试剂盒购买于上海碧云天生物技术有限公司。
51.所述多聚甲醛固定液为多聚甲醛粉末(购买于上海沪试实验室器材股份有限公司)按4％g/ml比例溶于pbs(磷酸盐缓冲液)。
52.pbs(磷酸盐缓冲液)：每2l体积加氯化钠固体16g，氯化钾固体0.4g，十二水合磷酸氢二钠7.26g，磷酸二氢钾0.48g，以上固体均购买于上海沪试实验室器材股份有限公司。bsa(牛血清白蛋白)购买于cytiva公司。
53.opg(骨保护素)购买于abcam公司。
54.cy3-偶联亲和山羊抗小鼠igg(h+l)购买于proteintech公司。
55.实施例所述透析纯化的步骤为：使用截留分子量为3500d的透析袋在离子水中透析2天。
56.实施例所述p(mma-ma)共聚物按照如下步骤制备得到：
57.将聚乙烯醇和碱式碳酸镁加入到200ml水中得到分散液，其中聚乙烯醇的浓度为1.2wt％；碱式碳酸镁的浓度为2wt％；分别加入60ml甲基丙烯酸甲酯(mma)和15ml丙烯酸甲酯(ma)，混合均匀后通入氮气排空气体，反应温度为70℃，加入占分散液质量0.6％的引发剂偶氮二异丁腈，整个反应过程持续6小时，将反应产物洗涤干净、烘干、球磨即可。
58.实施例1
59.bone-mg
2+-hacc的制备方法，如下步骤：
60.(1)从乳牛的股骨中分离出松质骨，将松质骨切碎，然后进行煮沸和干燥。处理后的松质骨先后浸泡在0.5mol/l氢氧化钠溶液液与30wt％双氧水中，用大量蒸馏水洗至ph＝7，然后在烘箱中烘干，得到脱脂脱蛋白后的天然骨。将脱脂脱蛋白后的天然骨放入马弗炉在700℃高温烧结4小时，取出天然骨球磨，并用无水乙醇和水交替超声清洗三次，干燥，最后获得天然骨骨粉；
61.(2)将步骤(1)所述的天然骨粉浸入0.1mol/l的mgcl2溶液中，并搅拌2h后将骨粉滤出来，放入80℃的烘箱中干燥3小时，将mgcl2沉淀在骨粉上，备用；
62.(3)将2g n-(2-羟基)丙基-3-三甲基壳聚糖氯化铵溶解于200ml水中，在70℃下搅拌4h，同时加入4ml交联剂环氧氯丙烷，添加naoh调节体系ph为10进行交联反应，交联反应3h结束后，得到凝胶溶液，用盐酸调节凝胶溶液ph为7；经透析纯化2天后，加入0.2g甘油和16g步骤(2)烘干后的骨粉，搅拌4h后取出在60℃下干燥5h，制得外层包裹有壳聚糖季铵盐薄膜和负载mg
2+
的骨粉，记作bone-mg
2+-hacc；
63.实施例2
64.一种可注射型骨水泥的制备方法，步骤如下：
65.将固体组分和液体组分按照2g:1ml的比例将固体和液体混合，并在25℃下凝固5min43s，即制备得到所述可注射型骨水泥。表1所述bone-mg
2+-hacc由实施例1制得。实施例2的终产物记为：复合10％bone-mg
2+-hacc的pmma骨水泥。
66.所述固体组分和液体组分的具体成分见表1。
67.表1实施例2的固体组分和液体组分具体组成
68.成分固体组分(20g)p(mma-ma)15.84gzro2(显影剂)2gbpo(过氧化苯甲酰)0.16gbone-mg
2+-hacc2g成分液体组分(10ml)mma(单体)9.84mldmpt(n,n-二甲基对苯甲胺)0.16ml对苯二酚60ppm
69.实施例3
70.一种可注射型骨水泥的制备方法，步骤如下：
71.将固体组分和液体组分按照2g:1ml的比例将固体和液体混合，并在25℃下凝固6min24s，即制备得到所述可注射型骨水泥。表2所述bone-mg
2+-hacc由实施例1制得。实施例3的终产物记为：复合20％bone-mg
2+-hacc的pmma骨水泥。
72.所述固体组分和液体组分的具体成分见表2。
73.表2实施例3的固体组分和液体组分具体组成
74.成分固体组分(20g)p(mma-ma)13.84gzro2(显影剂)2gbpo(过氧化苯甲酰)0.16gbone-mg
2+-hacc4g成分液体组分(10ml)mma(单体)9.84mldmpt(n,n-二甲基对苯甲胺)0.16ml对苯二酚60ppm
75.对比例1
76.一种聚甲基丙烯酸骨水泥的制备方法，步骤如下：
77.将固体组分和液体组分按照2g:1ml的比例将固体和液体混合，并在25℃下凝固7min19s，即制备得到所述可注射型骨水泥。
78.所述固体组分和液体组分的具体成分见表3。
79.表3对比例1的固体组分和液体组分具体组成
80.成分固体组分(20g)
p(mma-ma)17.84gzro2(显影剂)2gbpo(过氧化苯甲酰)0.16g成分液体组分(10ml)mma(单体)9.84mldmpt(n,n-二甲基对苯甲胺)0.16ml对苯二酚60ppm
81.图1为实施例3制备得到的可注射型骨水泥的实物图，由图1可看出：制备出的骨水泥具有良好的的自固化性能。
82.图2为实施例所述p(mma-ma)共聚物的红外光谱数据，由图2可看出：3628-3439cm-1
处为-oh伸缩振动和c＝o伸缩振动，2997-2949cm-1
处为-ch伸缩振动，1726cm-1
处为c＝o伸缩振动，1452cm-1
处为饱c-h弯曲振动，1373cm-1
处为c-h对称弯曲振动，1249-1161cm-1
处为c-o伸缩振动，976-754cm-1
处为-ch3面内变形振动。
83.图3为实施例1步骤(1)所制得得天然骨骨粉的xrd图谱，可以看出：天然骨骨粉的xrd衍射峰对应的晶面与羟基磷灰石的衍射峰类似，表面成功制备出了天然骨骨粉。
84.图4为实施例2～3制备的目标产物和对比例1制得的产物的抗菌性能对比图，其中，从左到右，依次对应对比例1、实施例2和实施例3。其抗菌性能测试步骤为：选择革兰氏阴性菌大肠杆菌作为细菌模型。使用营养肉汤在37℃下以200rpm的速度在摇床中培养细菌细胞过夜。将对比例1、实施例2和实施例3制得产物分别加入到加入48孔板中(每板0.2g)，在样品盘表面加入10μl菌悬液(pbs,106cfu ml-1
)。然后将48孔板放入37℃相对湿润为70％的培养箱中培养4h。在此时间结束时，每个孔中加入1ml灭菌pbs重新悬浮剩余存活细菌。然后吸取孔板20ul涂布在营养琼脂平板上，37℃孵育24h后，计数培养皿上菌落形成单位(cfu)。每组试验重复3次。从图4可知看出：在加入经过表面修饰后的天然骨粉，骨水泥能明显抑制金黄色葡萄球菌的生长，且随着复合改性后骨粉浓度升高其抗菌作用增强。
85.图5为实施例2～3制备的目标产物和对比例1制得的产物的促alp表达的结果对比图，从左到右，依次对应对比例1、实施例2和实施例3。其测试步骤为：分别取0.2g对比例1、实施例2和实施例3制得的产物，加入2ml bmsc(大鼠骨髓间充质干细胞)培养液(将大皿中的bmsc用2ml胰酶消化3min后，加入4mlα-mem完全培养基后加到六孔板中，每孔总体积补至2ml，)第二天更换2ml成骨诱导液培养7天后用碱性磷酸酶试剂盒进行实验，检验细胞中alp(碱性磷酸酶)的表达量多少。用单反相机拍摄a图片，b图片由荧光显微镜拍摄，二者均显示复合骨水泥处理组的骨髓间充质干细胞alp表达水平最高。从图5可得出：复合骨水泥可显著促进骨髓干细胞内alp蛋白表达，且随着复合改性后骨粉浓度升高其作用增强。
86.图6为实施例2～3制备的目标产物和对比例1制得的产物的促opg表达的结果对比图，从左到右，依次对应对比例1、实施例2和实施例3。其测试步骤为：分别取0.2g对比例1、实施例2和实施例3制得的产物，加入1ml bmsc(大鼠骨髓间充质干细胞)培养液(将大皿中的bmsc用2ml胰酶消化3min后，加入4mlα-mem完全培养基后加到十二孔板中，每孔总体积补至1ml，)第二天更换1ml成骨诱导液培养14天后吸去培养基，用pbs(磷酸盐缓冲液)清洗三遍，每遍5分钟，加入1ml多聚甲醛固定液固定细胞15分钟，再用pbs(磷酸盐缓冲液)清洗三遍，加入破膜液(0.5％triton x-100)浸泡20分钟，再用pbs(磷酸盐缓冲液)清洗三遍，加入
1ml 5％的bsa(牛血清白蛋白)封闭1小时，敷上opg(骨保护素)一抗4℃下过夜。第二天，敷上cy3-偶联亲和山羊抗小鼠igg(h+l)二抗一个小时后，用pbst(含tween-20的磷酸盐缓冲液)清洗三遍后敷上dapi(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)五分钟，在共聚焦显微镜下进行观察拍照。红色代表opg蛋白，蓝色代表细胞核，由图6可见：随着骨粉浓度的升高，opg蛋白的表达也增强；(图中的dapi代表细胞核，opg代表骨保护素蛋白，merged代表两者的合成图)。
87.图7实施例3制得的目标产物和对照组对大鼠颅骨缺损修复再生后的标本照片图。具体的修复步骤为：在8周龄体重280g的大鼠的颅骨上用环钻制造了两个5mm直径的缺损，一个缺损不做处理(作为对照组)，另一个取实例3制得到骨水泥填充在骨缺损的部位。缝合皮肤后在8周之后收取颅骨标本，拍照得到图7，由图7可知：本发明制备得到的复合骨水泥显著促进大鼠颅骨缺损修复。
88.图8为实施例3制得的目标产物和对照组对大鼠颅骨缺损修复再生后的ct扫描照片，其中，上图为俯视图，下图为横截图。由图8可知：所制备的新型复合骨水泥可以显著促进大鼠颅骨缺损修复效果。
89.图9为实施例3制得的目标产物和对照组对大鼠颅骨缺损修复再生后进行micro-ct扫描仪将颅骨标本进行扫描重构，测得的图像中的bv/tv(骨体积与总体积之比)对比柱状图。由图9可知：本发明所制备的复合骨水泥组的颅骨再生有着更高的bv/tv。
90.图10为实施例3和对比例1制得的目标产物对大鼠颅骨缺损修复再生后进行micro-ct扫描仪将颅骨标本进行扫描重构，测得的图像中的tb.n(骨小梁数)对比柱状图。由图10可知：本发明所制备的复合骨水泥组的颅骨再生有着更高的tb.n。
91.以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所做出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。