跨膜蛋白41B作为药物靶标在制备治疗病理性心肌肥厚药物中的应用

跨膜蛋白41b作为药物靶标在制备治疗病理性心肌肥厚药物中的应用
技术领域
1.本发明属于心肌肥厚治疗技术领域，具体涉及一种跨膜蛋白41b作为药物靶标在制备治疗病理性心肌肥厚药物中的应用。


背景技术：

2.心力衰竭是世界范围内导致死亡的主要原因之一，而病理性心肌肥厚是心力衰竭的重要前期病变，最初肥厚以抵抗后负荷增加和维持其泵血功能，但在持续的压力负荷下，心肌肥厚将发生失代偿，诱发心力衰竭。在过去的几十年里，虽然对这一过程有了深入的理解，然而，心肌肥厚的发病机制尚未完全阐明，临床也缺乏行之有效的治疗手段。目前正在开发的心脏病基因治疗具有重要意义，如tn-201利用aav9将功能性基因mybpc3递送到心肌细胞中，旨在解决因mybpc3基因突变导致的心壁增厚、心律失常、功能障碍、心力衰竭和心源性猝死。因此，寻找心肌肥厚的关键调节因子并结合基因治疗可能对改善或逆转心肌肥厚具有重要意义。
3.研究表明自噬与心肌肥厚的发生发展密切相关。正常或病理条件下，自噬失调会加剧心肌肥厚与心力衰竭。目前，自噬可作为心肌肥厚的治疗靶点已经被大量证明。例如β5i被发现作为促进病理性肥厚和重塑的关键调节因子，其机制是β5i靶向atg5，促进其降解，从而抑制自噬的活化，最终导致心肌肥厚和功能障碍。此外，心肌细胞atg5特异性缺失损伤心脏自噬活动，导致心肌细胞内肌节结构紊乱、线粒体失调和聚集，最终导致心肌肥厚、左室扩张和收缩功能障碍。
4.跨膜蛋白41b(transmembrane protein41b，tmem41b)是一种进化上保守的跨膜蛋白，最初被认为参与哺乳动物正常神经传递、发育。但近年来大量研究表明，tmem41b对于自噬体、脂滴、脂蛋白和病毒诱导复制细胞器(包括双膜囊泡)的生物发生都很重要，因为所有这些都是由内质网(er)膜或在er膜上产生的。自2018年以来，已经有三次独立的全基因组crispr筛选发现tmem41b是自噬小体形成的关键因素，使得tmem41b被研究得最多的生物学功能就是它们在自噬中的作用。在自噬小体形成过程中，tmem41b作为脂质翻转酶活性可能对内质网膜的动态重塑很重要。综上所述，tmem41b与自噬活动密切相关，而自噬活动在心肌肥厚和重塑的过程中也发挥着重要的作用。然而，tmem41b是否也可以通过调控自噬活动参与心肌肥厚和重塑的发生发展目前尚未被报道。
5.心肌肥厚是引起心血管疾病高发病率和高死亡率的独立危险因素，如果没有及时的医学干预，最终将发展为心力衰竭，从而危及生命。积极寻找引起心肌肥厚发病的关键调节因子作为治疗靶点，对促进心脏功能恢复具有重要意义。


技术实现要素：

6.针对现有技术中的不足，本发明的目的是提供一种tmem41b作为药物靶标在制备治疗病理性心肌肥厚药物中的应用。
7.为达到上述目的，本发明的解决方案是：
8.第一方面，本发明提供了一种tmem41b作为药物靶标在制备治疗病理性心肌肥厚药物中的应用。
9.作为本发明的优选实施例，tmem41b通过调控自噬活动参与心肌肥厚的治疗。
10.作为本发明的优选实施例，tmem41b通过参与细胞自噬小体的形成和成熟，从而改善压力负荷引起的心肌肥厚。
11.作为本发明的优选实施例，tmem41b敲降可增强心肌细胞肥厚相关基因的表达。
12.作为本发明的优选实施例，心肌细胞中tmem41b敲降促进血管紧张素ii诱导的心肌肥大。
13.作为本发明的优选实施例，tmem41b杂合缺失小鼠促进主动脉弓缩窄诱导的心肌肥厚。
14.第二方面，本发明提供了一种tmem41b作为药物靶标在非诊断方法或非治疗方法上的应用。
15.第三方面，本发明提供了一种用于治疗病理性心肌肥厚的药物或药物组合物，该药物或药物组合物的主要成分为tmem41b，还包括药学上可接受的载体。
16.作为本发明的优选实施例，药物或药物组合物的剂型选自胶囊剂、颗粒剂、片剂、丸剂或口服液。
17.由于采用上述方案，本发明的有益效果是：
18.本发明敲降tmem41b能够显著增强心肌细胞肥厚、增加肥厚基因和肥厚通路的表达，过表达tmem41b则能明显改善或逆转心肌肥厚病理变化，tmem41b能够参与细胞自噬小体的形成和成熟，从而改善压力负荷引起的心肌肥厚。则tmem41b能够抑制病理性心肌肥厚和重塑，从而在制备治疗临床上压力负荷引起的病理性心肌肥厚药物中得以应用。
附图说明
19.图1为本发明的实施例1中q-pcr检测ac16心肌细胞、h9c2心肌细胞以及新生乳大鼠原代心肌细胞(nrvms)在ang-ii刺激48h后，对照组和肥厚组tmem41b的mrna表达水平图(*为p《0.05)。
20.图2为本发明的实施例1中western blot检测ac16心肌细胞在ang-ii刺激48h后，对照组和肥厚组tmem41b的蛋白质表达水平图(*为p《0.05)。
21.图3为本发明的实施例1中wt小鼠经tac手术，4周后取心脏组织，提取蛋白和rna，通过q-pcr和western blot检测对照组和肥厚组心脏tmem41b的表达水平图(*为p《0.05)。
22.图4为本发明的实施例2中nrvms经sirna转染后，通过q-pcr和western blot检测敲降效率图。
23.图5为本发明的实施例2中对照组和tmem41b干扰的nrvms经过ang-ii刺激后，免疫荧光染色α-actin检测心肌细胞大小图(*为p《0.05)。
24.图6为本发明的实施例2中对照组和tmem41b干扰的nrvms经过ang-ii刺激后，q-pcr检测心肌肥厚相关基因anp、bnp、myh7的mrna表达图(*为p《0.05)。
25.图7为本发明的实施例2中对照组和tmem41b干扰的nrvms经过ang-ii刺激后，western blot检测心肌肥厚相关通路p-akt和p-erk水平图(*为p《0.05)。
26.图8为本发明的实施例3中tmem41b
+/+
和tmem41b
+/-小鼠进行tac手术以诱导小鼠心肌肥厚模型，观察心脏整体大小图(*为p《0.05)。
27.图9为本发明的实施例3中tmem41b
+/+
和tmem41b
+/-小鼠进行tac手术以诱导小鼠心肌肥厚模型，he染色和wga染色观察心肌细胞横截面积大小图(*为p《0.05)。
具体实施方式
28.本发明提供了一种tmem41b作为药物靶标在制备治疗病理性心肌肥厚药物中的应用。
29.细胞自噬与心肌肥厚密切相关，而tmem41b是内质网跨膜蛋白，参与自噬小体的形成，tmem41b缺陷影响自噬体的形成以及成熟。因此，提出tmem41b是否也可以通过自噬参与调控病理性心肌肥厚发生发展这一科学假设。通过过表达tmem41b的生物载体(aav-腺相关病毒)探索在制备治疗病理性心肌肥厚疾病药物中的应用。本发明拟从心肌肥厚自噬调控机制方面为切入点，通过tmem41b敲除、心肌细胞tmem41b条件性敲除和过表达，深入探究tmem41b在心肌肥厚中的作用及机制。即本发明在动物水平用全身tmem41b敲降和心肌细胞条件性敲除小鼠验证了tmem41b在病理性心肌肥厚中的作用；在细胞水平用ang-ii诱导心肌肥厚模型进一步验证tmem41b在心肌肥厚中的作用。本发明涉及小鼠主动脉弓缩窄、乳大鼠心肌细胞提取、心肌细胞肥厚诱导等实验，方法真实可靠，并且初步的研究结果表明敲降tmem41b能够显著增强心肌细胞肥厚、增加肥厚基因和肥厚通路的表达，过表达tmem41b则能明显改善或逆转心肌肥厚病理变化。跨膜蛋白41b能够参与细胞自噬小体的形成和成熟，从而改善压力负荷引起的心肌肥厚。
30.1动物实验：c57bl/6小鼠(7-8周，雄性，购自北京维通利华实验动物技术有限公司)进行主动脉弓缩窄(tac)手术。将小鼠置于称重器上称重后，采用腹腔内注射戊巴比妥钠的方式进行麻醉，待小鼠完全失去知觉后，固定于手术板上，在颈部剪开皮肤分离肌肉和甲状腺，暴露出气管，小心沿着气管往下剪开皮肤至胸骨第二肋处，轻柔地分开胸腺及其他组织并暴露出主动脉弓，然后用钝性镊子轻柔的分开主动脉弓附近的组织，注意不要损伤主动脉弓，接着将6-0线小心穿过主动脉弓，并将26g垫针平行放于主动脉弓上，随后扎紧垫针和主动脉弓，注意每只小鼠之间力度均匀，然后缓缓抽出垫针，将主动脉弓放好，关胸并排出胸腔内多余的气体，缝合好皮肤，最后将手术后的小鼠放于加热垫中等待恢复意识后，再放回笼中。其中，同一批进行开胸处理却没有结扎主动脉弓的小鼠作为假手术组(sham组)，之后关胸并一同观察各种指标。
31.2.细胞实验：分离乳大鼠心肌细胞并诱导细胞肥厚模型，具体而言，将出生1-3天的乳大鼠浸于75％的酒精中5s，取出放于事先消毒过的超净台中，于乳鼠胸骨左侧剪出一个小口顺势挤出心脏，并用无菌镊子摘取心脏放入预冷的无菌pbs溶液中彻底清洗干净，然后将洗干净的心脏转移至另一10cm皿中，用眼科直剪剪碎心脏至1mm3的小块，然后将事先配好的胶原酶ii(现配现用)加入其中，并用吸管将组织块转移至一支15ml的离心管中，然后用吸管轻轻上下吹打组织块约15下后，拧紧盖子放入37℃培养箱中消化3min，3min后取出离心管，并用吸管轻轻吹打约15下，然后放于离心管架上静置片刻后，将上清吸出并注入到含10％血清的培养基中，接下来，重新加入新鲜的胶原酶ii进行第二轮消化，并重复上述步骤。待心肌组织消化至白色絮状后停止消化，然后将含有心肌细胞的培养基进行离心
(1000rpm、5min)，离心完成后弃掉上清，并用新鲜培养基重悬细胞，然后将重悬液加入到10cm皿中并放入37℃培养箱中差速贴壁180min以分离心肌细胞和成纤维细胞。待差速贴壁180min后，将10cm皿中的上清小心吸出至50ml离心管中，用吸管吹打混匀并计数，然后将细胞悬液均匀接种于事先准备好的6孔板中，并放入细胞培养箱中培养48h。待48h后，进行换液操作，换成新鲜培养基并过夜，第二天向心肌细胞中加入si-scramble和si-tmem41b，48h后进行敲降效率检测，然后再给予ang-ii(1μmol/l)处理48h诱导细胞肥厚，48h后收集细胞进行后续实验操作。
32.下面将结合实施例和附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
33.以下实施例中，tmem41b抗体购自于proteintech公司；siscramble和sitmem41b均由上海和元生物技术有限公司构建；lipofectamine 3000(#l3000015)购自invitrogen公司；ang-ii药物购于美国sigma公司；tmem41b
+/+
和tmem41b
+/-小鼠由赛业(苏州)生物科技有限公司构建。
34.实施例1：体内外实验探究tmem41b表达与心肌肥厚的关系
35.为了探究心肌肥厚条件下心肌细胞或心脏组织tmem41b的表达情况，对常见心肌细胞，包括大鼠h9c2心肌细胞系、人ac16心肌细胞系以及nrvms进行ang-ii刺激48h后观察tmem41b的mrna和蛋白质表达；此外，通过tac诱导的小鼠心肌肥厚模型，观察肥厚组心脏组织相对于对照组心脏组织tmem41b的表达。实时荧光定量pcr(q-pcr)和western blot检测结果如图1至图3所示。由实验结果可知：在肥厚刺激下，tmem41b表达水平较对照组明显下降。
36.实施例2:心肌细胞中tmem41b干扰促进ang-ii诱导的心肌肥厚
37.为进一步探究tmem41b是否参与调控心肌肥厚，细胞水平上，在新生乳大鼠原代心肌细胞(nrvms)中用lipofectamine 3000(invitrogen)，根据说明书分别转染si-scramble和si-tmem41b 24h，直接覆盖心肌细胞表面，37℃孵育24h，随后通过western blot和q-pcr验证tmem41b在心肌细胞中的敲降效率，检测结果如图4所示。随后进行ang-ii药物刺激48h，检测心肌肥厚相关的指标，包括细胞大小、肥厚相关基因与信号通路。检测结果如图5至图7所示。由实验结果可知：tmem41b敲降可明显促进ang-ii诱导的心肌肥厚。
38.实施例3:tmem41b杂合缺失小鼠促进tac诱导的心肌肥厚
39.为了进一步在体内验证tmem41b敲降能否促进心肌肥厚，将同窝对照的tmem41b
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和tmem41b
+/-小鼠进行tac手术以诱导小鼠心肌肥厚模型(这里运用杂合子小鼠是基于先前研究表明tmem41b纯合缺失小鼠会胚胎致死，且杂合子小鼠能达到50％干扰效率)。通过观察tac术后小鼠心脏大体外观，并比较hw/bw以及hw/tl等指标，发现tmem41b杂合缺失小鼠显示出明显的心脏肥厚表型，如图8所示。进一步，通过he染色和wga染色观察心肌细胞横截面积大小，结果也发现tmem41b杂合缺失小鼠中心肌细胞横截面积增大，如图9所示。
40.上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易的对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中，而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例。
本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。