一种靶向肝癌细胞的pH/GSH双响应型纳米药物载体及其制备方法

一种靶向肝癌细胞的ph/gsh双响应型纳米药物载体及其制备方法
技术领域
1.本发明属于生物医用高分子材料领域，具体涉及一种靶向肝癌细胞的ph/gsh双响应型纳米药物载体及其制备方法，利用该法可以制备得到一种具有核壳结构的高分子纳米球，进一步通过静电作用载药后可以实现在肝癌肿瘤细胞中的快速释放，是一种优良的药物定向释放载体。


背景技术：

2.癌症是仅次于心脏病的全球排名第二的最常见致死因素，随着经济的发展和人民生活水平的提高，癌症将超心脏病成全球首要死因。在我国，肝癌是发病率和致死率居于前位的恶性肿瘤，2020年原发性肝癌发病率占全球的45.3％，死亡率占全球47.1％。目前化疗依然是治疗恶性肿瘤的主要手段，传统的药物制剂选择性差，在治疗剂量水平下对患者的正常组织器官危害大，会带来头发和牙齿脱落、恶心呕吐、白细胞下降等毒副作用，给患者带来极大的痛苦并且治疗成功率极低。
3.与之相反，纳米药物载体不仅可以通过增强的渗透和滞留效应(epr)实现抗癌药物在肿瘤组织处的富集，提高药物的利用率和局部血药浓度，还可以进一步在载体表面修饰靶向配体，实现主动靶向癌细胞的能力。对于肝癌细胞来说，半乳糖基团对细胞表面高度表达的去唾液酸糖蛋白(asgp)受体具有良好的亲和性，是一种理想的靶向配体。常见的靶向纳米药物载体包括胶束、纳米凝胶、纳米囊、脂质体、树状大分子、聚合物-药物偶联物等，其中刺激响应型靶向载体还能够通过感应外部环境的变化(温度、ph、光、磁场、离子强度等)或在酶的作用下实现药物在肿瘤细胞内的定点、快速释放，可以有效提高肿瘤的化学治疗水平和肿瘤患者的生存率。
4.肿瘤部位(ph5.8-7.2)、细胞内涵体和溶酶体(ph4.5-5.5)的ph都低于正常体液的ph值(7.4)，这种ph的差别使得ph响应型纳米药物载体的研究开发成为热点。除了较低的ph值外，肿瘤组织与人体正常组织相比，谷胱甘肽(gsh)的浓度较高，可达到正常组织的4倍，gsh可以使含有二硫键的药物载体分解成巯基而降解，达到迅速释放药物的目的。目前文献报道的ph响应型药物载体的释药大多是以浓度差作为驱动力的扩散方式，尽管响应速度快，但是很难做到快速释放。另外文献报道的大多数ph响应型药物载体还存在合成步骤复杂等问题(多步反应偶联药物或载药后多步纯化)。具有挤压功能的ph响应型给药系统可以突破浓度扩散限制，实现药物快速释放。我们前期报道了一种具有挤压和开关功能的ph响应型纳米药物载体(一种具有挤压和开关效应的纳米药物载体的制备方法，zl 201611218315.9)，载体的核层在ph值呈酸性的肿瘤或发炎部位会由溶胀状态迅速收缩，能够将包埋的药物迅速“挤压”出来，在肿瘤化疗领域具有很大应用潜力。但是该药物载体主要通过epr效应在肿瘤部位富集，缺乏主动靶向功能，另外该药物载体在肿瘤细胞内也无法快速降解。
5.通常，尺寸小于200nm的纳米粒子可以避开网状内皮系统(res)的识别，延长血液
循环时间。lockman等人证明直径小于100nm的聚氰基丙烯酸酯纳米颗粒可以克服血脑屏障(journal of controlled release,2003,93,271)，feng等发现细胞对粒径为100nm的颗粒的内吞效率要高于200nm的颗粒(pharmaceutical research,2013,30,2512)。然而，目前文献报道的大多数纳米药物载体的直径都在200nm左右，我们前期报道了一种12-冠醚-4辅助的无皂乳液聚合制备粒径小于100nm的聚苯乙烯纳米球的方法(acs applied nano materials,2020,3,10787)，为制备小粒径的纳米颗粒提供了有效思路。


技术实现要素：

6.针对上述问题，本发明采用自制的亲水性含半乳糖聚合物作为可逆加成-断裂链转移(raft)反应大分子链转移剂或原子转移自由基聚合(atrp)反应大分子引发剂，(甲基)丙烯酸叔丁酯为单体，含有二硫键的双键单体作为交联剂，在12-冠醚-4的辅助下，通过无皂乳液活性聚合制备得到具有核壳结构且粒径小于100nm的纳米载体，壳层聚合物链上的半乳糖基团可以主动靶向肝癌细胞，核层进一步水解后得到ph/gsh双响应型纳米药物载体(附图1)。该药物载体在ph7.4时带负电，对带正电的抗癌药物具有很高的负载率；在低ph的肿瘤细胞内，核层质子化迅速收缩，载体与药物之间静电作用消失，同时肿瘤内的gsh还原二硫键使载体快速降解，抗癌药物通过机械挤压和载体自身的降解实现快速释放，是一种对肝癌细胞化疗非常有效的ph/gsh双响应型纳米药物载体。
7.本发明所采用的技术方案是：
8.一种靶向肝癌细胞的ph/gsh双响应型纳米药物载体及其制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
9.(1)以含半乳糖单体作为聚合单体，采用raft或atrp反应聚合制备线性聚合物，反应温度10-100℃；反应时间为0.5-24h；单体浓度为0.1-10m。对于atrp反应，单体与引发剂的摩尔比范围10:1～200:1，催化剂的加入量与引发剂相同，配体的加入量为催化剂的0.5-3倍；对于raft反应，引发剂与raft试剂的摩尔比范围为0.05-2.0之间。反应溶剂可为甲苯、二甲苯、藜芦醚、苯、溴苯、氯苯、二氧六环、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺等有机溶剂中的一种；反应结束后，用四氢呋喃或者三氯甲烷稀释反应产物，对于atrp反应，需要将产物通过氧化铝柱除去催化剂，得到的溶液在正己烷、环己烷或石油醚中沉淀两次，离心后，所得高分子真空干燥后进入步骤(2)；
10.(2)将步骤(1)得到的聚合物进行酸解，利用强酸的水溶液，室温下与聚合物混合搅拌0.5-24h，透析冻干后得到含半乳糖的亲水聚合物；
11.(3)对于raft反应，需将引发剂、12-冠醚-4、步骤(2)得到的聚合物和去离子水在反应瓶中搅拌均匀得到水相；对于atrp反应，应将配体、催化剂、12-冠醚-4、步骤(2)得到的聚合物和去离子水在反应瓶中搅拌均匀得到水相；将(甲基)丙烯酸叔丁酯和含二硫键交联剂混合均匀得到油相；将油相和水相混合后通氮气除氧30min开始升温聚合，反应温度为40-85℃，反应时间1-48h，反应结束后将所得的纳米球溶液用透析袋透析24h，透析介质依次为无水乙醇和去离子水，目的是除去未参加反应的物质，然后将透析袋里的纳米球溶液用真空冻干机干燥，得到具有核壳结构的聚(甲基)丙烯酸叔丁酯纳米球冻干粉。
12.(4)将步骤(3)所得的产品加入到90％(体积比)的三氟乙酸水溶液中，室温下反应过夜脱除叔丁基保护，然后将反应混合物在去离子水中透析24h，将透析袋里的纳米球溶液
用真空冻干机干燥，得到能够靶向肝癌细胞的ph/gsh双响应型纳米球干粉。
13.(5)将步骤(4)所得的纳米球干粉分散在药物的ph缓冲溶液中，药物的浓度范围10-2000μg/ml,ph缓冲液ph值范围6-8。药物分子通过静电作用吸附到载体上，室温下混合24h后通过离心分离得到载药纳米球。
14.含半乳糖单体是指分子中同时含有半乳糖环和双键的功能性小分子，参考文献方法制备(j polym sci,part a,1998,36:2473-2481；macromolecules,1998,31:9121-9126)，优选的，步骤(1)中所述的含半乳糖单体为6-o-甲基丙烯酰基-双丙酮-d-半乳糖、6-o-丙烯酰基-双丙酮-d-半乳糖、6-o-甲代烯丙基-双丙酮-d-半乳糖、对(双丙酮-d-半乳糖-6-甲氧基)苯乙烯的至少一种，但是并不局限以上几种。
[0015][0016]
a：6-o-甲基丙烯酰基-双丙酮-d-半乳糖(mdagal)；
[0017]
b：6-o-丙烯酰基-双丙酮-d-半乳糖(dagal)；
[0018]
c：6-o-甲代烯丙基-双丙酮-d-葡萄糖(maldaglu)；
[0019]
d：对(双丙酮-d-半乳糖-6-甲氧基)苯乙烯(dagalms)。
[0020]
优选的，步骤(1)中所述的反应体系中，对于raft反应，raft试剂选自4-氰基-4-(硫代苯甲酰)戊酸(cpadb)、2-氰基-2-丙基苯丙二硫(cpdb)、二硫代苯甲酸枯酯(cdb)、4-氰基-4-[(十二烷基硫烷基硫羰基)硫烷基]戊酸(cdpt)、4-氰基-4-[(丙基硫烷基硫羰基)硫烷基]戊酸(cppt)、3-苄硫基硫代羰基硫代丙酸(bspa)或2-(十二烷基三硫代碳酸酯基)-2-甲基丙酸(dmpa)等常见raft试剂的一种；引发剂选自偶氮二异丁腈(aibn)、偶氮二异庚腈(abvn)、过氧化苯甲酰(bpo)、过氧化苯甲酰叔丁酯(tbpb)、过氧化-2-乙基己酸叔丁酯、过氧化-2-乙基己酸叔戊酯、烷基过氧化氢、过氧化十二烷酰等常见油溶性引发剂的一种；也可以是它们的混合物。反应温度50-80℃；反应时间为1-20h；单体浓度1-5m。
[0021]
优选的，步骤(1)中所述的反应体系中，对于atrp反应，引发剂选自2-溴异丁酸乙酯、2-溴丙酸甲酯、2-碘异丁酸乙酯、苄基氯或2-溴丙腈等常见的atrp反应引发剂的一种；配体是atrp反应常用配体，如n,n,n,n’,n
’‑
五甲基二亚乙基三胺(pmdeta)，二联吡啶(bipy)、三[(2-二甲基氨基)乙基]胺(me6tren)、三苯基膦或三丁基膦等；催化剂为cucl、cubr、febr2、fecl2等还原态过渡金属盐；反应温度30-75℃；反应时间为0.5-12h；单体浓度为1-5m。
[0022]
步骤(1)和(3)中单体的转化率通过核磁分析反应前后的反应液可以确定。
[0023]
通过步骤(1)得到的聚合物分子量范围在500-20000da，优选为1000-10000da。
[0024]
步骤(2)中所述的酸解可选用文献报道的三氟乙酸法(j polym sci,part a,2005,43:752-762)和甲酸法(j polym sci,part a,1998,36:2473-2481)。
[0025]
步骤(3)中所述的raft反应体系中，引发剂为水溶性引发剂，用量同步骤(1)；所述的atrp反应体系中，催化剂和配体的选取及用量同步骤(1)。
[0026]
优选的，通过步骤(2)酸解后得到的含半乳糖亲水性聚合物分子量范围在2000-8000da；含半乳糖亲水性聚合物在水相中的摩尔浓度为0.2-10mm。
[0027]
优选的，步骤(3)中水溶性引发剂为过硫酸钾、过硫酸钠、过硫酸铵、偶氮二异丁脒盐酸盐、过硫酸盐-硫醇体系、过硫酸盐-亚硫酸氢盐体系中的一种或几种的混合。
[0028]
优选的，步骤(3)中油相质量占水相质量的1-20％，交联度为5-50％；二硫键交联剂为n,n
’‑
双(丙烯酰)胱胺、n,n
’‑
双(甲基丙烯酰)胱胺、2,2-二硫二乙醇二丙烯酸酯或2,2-二硫二乙醇二甲基丙烯酸酯。
[0029]
优选的，步骤(3)中12-冠醚-4在水相中的摩尔浓度为1-50mm。
[0030]
步骤(5)中所述的药物为在ph6-8的范围内带正电的药物，如阿霉素、吉西他滨、表柔比星等。载药时纳米球与药物的质量比范围1:1-20:1，优选1.5:1-10:1。
[0031]
本发明所制备的靶向肝癌细胞的ph/gsh双响应型纳米药物载体的粒径为20-100nm，具有核壳结构。
[0032]
本发明产生的技术效果是：
[0033]
本发明利用12-冠醚-4辅助raft或atrp无皂乳液聚合，制备了一种具有核壳结构且粒径小于100nm的纳米载体，进一步水解后得到能够靶向肝癌细胞的ph/gsh双响应型纳米药物载体。该纳米载体的尺寸不仅有助于细胞的内吞，而且核层和壳层都具有独特的功能：壳层聚合物链上的半乳糖基团会主动识别肝癌细胞表面过度表达的去唾液酸蛋白(asgp)受体，实现纳米药物载体主动靶向肝癌细胞功能；核层的聚(甲基)丙烯酸在ph值呈酸性的肿瘤部位会由溶胀状态迅速收缩，同时肿瘤细胞内的gsh会将核层的二硫键交联剂迅速降解，两者协同作用使包埋的药物迅速释放出来。该纳米药物载体在药物控释特别是恶性肝癌化疗方面具有很大应用潜力。
附图说明：
[0034]
图1ph/gsh双响应型纳米药物载体合成与靶向肝癌细胞示意图；
[0035]
图2为本发明实例1中ph/gsh双响应型纳米球水解前后的透射电镜图；
[0036]
图中a图为水解前的聚甲基丙烯酸叔丁酯纳米球；
[0037]
b图为水解后的聚甲基丙烯酸纳米球。
[0038]
图3为本发明实例1中ph/gsh双响应型纳米药球水解前后的红外光谱图；
[0039]
图中a线为水解前的红外光谱图；
[0040]
b线为水解后的红外光谱。
[0041]
图4为本发明实例1中ph/gsh双响应型纳米球粒径及zeta电势随ph的变化图；
[0042]
图中a线为粒径随ph值的变化图；
[0043]
b线为zeta电势随ph值的变化图。
[0044]
图5为本发明实验例中ph响应型纳米球在ph7.4和ph5.0下的药物释放曲线图。
[0045]
图中a线为实施例1中载药纳米球在ph7.4下的药物释放曲线；
[0046]
b线为实施例1中载药纳米球在ph5.0下的药物释放曲线；
[0047]
c线为实施例1中载药纳米球在ph7.4和10mm gsh条件下的药物释放曲线；
[0048]
d线为实施例1中载药纳米球在ph5.0和10mm gsh条件下的药物释放曲线。
[0049]
图6为实施例1中载药纳米球与三种细胞分别孵育1h、2h和3h后的流式细胞曲线和平均阿霉素荧光强度图。
[0050]
图中a图为载药纳米粒子与hepg2细胞共同孵育1h、2h和3h后的流式细胞曲线；
[0051]
图中b图为载药纳米粒子与hela细胞共同孵育1h、2h和3h后的流式细胞曲线；
[0052]
图中c图为载药纳米粒子与nih3t3细胞共同孵育1h、2h和3h后的流式细胞曲线；
[0053]
图中d图为阿霉素在三种细胞中的平均荧光强度图。
具体实施方式
[0054]
本发明具体实施方式如下：
[0055]
实施例1
[0056]
1)利用raft反应合成聚6-o-甲基丙烯酰基-双丙酮-d-半乳糖(pmdagal)
[0057]
室温下在50ml单口反应瓶中加入搅拌子，然后依次加入mdagal(9.84g，30mmol)、4-氰基-4-(苯基硫代甲酰硫基)戊酸(cpadb)(419.1mg，1.5mmol)、偶氮二异丁腈(aibn)(24.63mg，0.15mmol)、均三甲苯(100μl)及20ml二氧六环，翻口橡皮塞密封。待反应体系混合均匀后在冰水浴中用针头通入氮气除氧20min，将反应瓶在70℃油浴锅中反应16h。反应结束后将反应液在正己烷中沉淀两次，离心后真空干燥得到粉红色固体pmdagal。通过核磁氢谱分析单体转化率79.63％，理论分子量5500。
[0058]
2)酸解脱除pmdagal中的羟基保护基团
[0059]
为了得到含半乳糖的亲水性聚合物，必须脱去pmdagal侧链糖环上的异丙基保护基团。在50ml锥形瓶中加入1.6g pmdagal，再向锥形瓶中加入90％(体积比)的三氟乙酸水溶液16ml，室温下搅拌1h，得到的溶液在去离子水中透析2天，真空冻干得到含半乳糖的亲水聚合物。
[0060]
3)利用raft无皂乳液聚合反应合成具有核壳结构的聚甲基丙烯酸叔丁酯纳米球
[0061]
在50ml圆底烧瓶中，加入亲水性pmadgal(42mg，0.01mmol)、k2s2o8(0.54mg，0.002mmol)、12-冠醚-4(17.62mg，0.1mmol)和去离子水(20ml)混合均匀后作为水相。再加入甲基丙烯酸叔丁酯(270mg，1.898mmol)和n,n
’‑
双(丙烯酰)胱胺(30mg，0.115mmol)作为油相，将油相和水相搅拌混合后通氮气除氧30min开始升温聚合，反应温度65℃，反应时间18h，将所得的纳米球溶液用透析袋透析24h，透析介质依次为无水乙醇和去离子水，目的是除去未参加反应的物质，然后将透析袋里的纳米球溶液用真空冻干机干燥，得到聚甲基丙烯酸叔丁酯纳米球冻干粉，平均粒径43nm。
[0062]
4)酸解脱除聚甲基丙烯酸叔丁酯的叔丁基
[0063]
将聚甲基丙烯酸叔丁酯纳米球冻干粉(100mg)加入90％(体积比)的三氟乙酸水溶液中，室温下反应搅拌8h以脱除叔丁基，然后将反应混合物去离子水中透析24h，将透析袋里的纳米球溶液用真空冻干机干燥，得到具有靶向肝癌细胞的ph/gsh双响应型纳米球冻干粉。聚甲基丙烯酸叔丁酯纳米球水解前后的透射电镜图见图2，可以看出水解后纳米球具有
明显的核壳结构，水解后纳米粒子核层由疏水变为亲水，粒径略微增大，平均粒径54nm；水解前后的红外光谱图见图3，可以看出聚甲基丙烯酸叔丁酯纳米球在1388cm-1
和527cm-1
分别出现了叔丁基和二硫键的特征吸收峰，水解后叔丁基在1388cm-1
处的特征峰消失，同时在2854cm-1
处的-ch3伸缩振动峰也消失，说明叔丁基被成功脱除；水解后纳米粒子粒径及zeta电势随ph变化图见图4，可以看出纳米粒子具有明显的ph响应性，当环境ph由7.4降到5.0时，纳米粒子的直径缩小将近1倍。
[0064]
5)载药
[0065]
将阿霉素(1mg)溶于5ml ph7.4的磷酸盐缓冲液中，然后加入纳米球冻干粉(5mg)在25℃水浴摇床中震荡混合24h，离心分离除去上清液即得负载阿霉素的ph/gsh双响应型纳米球。载药量为192.2μg/mg纳米球，载药率96.1％。
[0066]
实施例2
[0067]
1)利用atrp反应合成聚6-o-甲基丙烯酰基-双丙酮-d-半乳糖(pmdagal)
[0068]
室温下在schlenk瓶中加入搅拌子，然后顺次加入溴化亚铜(43.1mg，0.3mmol)、n,n,n,n’,n
’‑
五甲基二亚乙基三胺(pmdeta)(52.0mg，0.3mmol)、mdagal(9.84g，30mmol)及30ml氯苯，经过三个液氮冷冻-抽气-充气-解冻循环过程，除去氧气。最后加入引发剂2-溴异丁酸乙酯(292.7mg，1.5mmol)，50℃反应4h，用四氢呋喃溶解反应产物，稀释反应产物后过氧化铝柱除催化剂。得到的无色溶液用正己烷沉淀两次，室温下抽滤，真空干燥，得到pmdagal。通过核磁氢谱分析单体转化率65.57％，理论分子量4500。
[0069]
2)酸解脱除pmdagal中的羟基保护基团
[0070]
为了得到含半乳糖的亲水性聚合物，必须脱去pmdagal侧链糖环上的异丙基保护基团。在50ml锥形瓶中加入1.6g pmdagal，再向锥形瓶中加入90％(体积比)的三氟乙酸水溶液16ml，室温下搅拌1h，得到的溶液在去离子水中透析2天，真空冻干得到含半乳糖的亲水聚合物。
[0071]
3)利用atrp无皂乳液聚合反应合成具有核壳结构的聚甲基丙烯酸叔丁酯纳米球
[0072]
在50ml schlenk瓶中加入搅拌子，顺次加入cubr(0.29mg，0.002mmol)、pmdeta(0.347mg，0.002mmol)、12-冠醚-4(35.24mg，0.2mmol)、去离子水(20ml)、甲基丙烯酸叔丁酯(270mg，1.898mmol)、2,2-二硫二乙醇二丙烯酸酯(30mg，0.114mmol)，经过三个液氮冷冻-抽气-充气-解冻循环过程，除去氧气。最后加入大分子引发剂pmadgal(35mg，0.01mmol)，60℃反应16h，将所得的纳米球溶液用透析袋透析24h，透析介质依次为无水乙醇、乙二胺四乙酸和去离子水，目的是除去未参加反应的物质和铜离子，然后将透析袋里的纳米球溶液用真空冻干机干燥，得到聚甲基丙烯酸叔丁酯纳米球冻干粉，平均粒径52nm。
[0073]
4)酸解脱除聚甲基丙烯酸叔丁酯的叔丁基
[0074]
将聚甲基丙烯酸叔丁酯纳米球冻干粉(100mg)加入90％(体积比)的三氟乙酸水溶液中，室温下反应搅拌8h以脱除叔丁基，然后将反应混合物去离子水中透析24h，将透析袋里的纳米球溶液用真空冻干机干燥，得到具有靶向肝癌细胞的ph/gsh双响应型纳米球冻干粉，平均粒径63nm。
[0075]
5)载药
[0076]
将阿霉素(3mg)溶于5ml ph7.4的磷酸盐缓冲液中，然后加入纳米球冻干粉(5mg)在25℃水浴摇床中震荡混合24h，离心分离除去上清液即得负载阿霉素的ph/gsh双响应型
纳米球。载药量为493.8μg/mg纳米球，载药率82.3％。
[0077]
实施例3
[0078]
1)利用raft反应合成聚6-o-丙烯酰基-双丙酮-d-半乳糖(pdagal)
[0079]
室温下在50ml单口反应瓶中加入搅拌子，然后依次加入dagal(9.42g，30mmol)、4-氰基-4-(苯基硫代甲酰硫基)戊酸(cpadb)(279.4mg，1.0mmol)、偶氮二异丁腈(aibn)(16.42mg，0.1mmol)、均三甲苯(100μl)及20ml二氧六环，翻口橡皮塞密封。待反应体系混合均匀后在冰水浴中用针头通入氮气除氧20min，将反应瓶在65℃油浴锅中反应12h。反应结束后将反应液在正己烷中沉淀两次，离心后真空干燥得到粉红色固体pdagal。通过核磁氢谱分析单体转化率65.12％，理论分子量6400。
[0080]
2)酸解脱除pmdagal中的羟基保护基团
[0081]
为了得到含半乳糖的亲水性聚合物，必须脱去pdagal侧链糖环上的异丙基保护基团。在50ml锥形瓶中加入1.6g pdagal，再向锥形瓶中加入90％(体积比)的三氟乙酸水溶液16ml，室温下搅拌1h，得到的溶液在去离子水中透析2天，真空冻干得到含半乳糖的亲水聚合物。
[0082]
3)利用raft无皂乳液聚合反应合成具有核壳结构的聚丙烯酸叔丁酯纳米球
[0083]
在50ml圆底烧瓶中，加入亲水性padgal(47mg，0.01mmol)、(nh4)2s2o8(1.14mg，0.005mmol)、12-冠醚-4(17.62mg，0.1mmol)和去离子水(20ml)混合均匀后作为水相。再加入丙烯酸叔丁酯(285mg，2.223mmol)和n,n
’‑
双(丙烯酰)胱胺(15mg，0.058mmol)作为油相，将油相和水相搅拌混合后通氮气除氧30min开始升温聚合，反应温度65℃，反应时间18h，将所得的纳米球溶液用透析袋透析24h，透析介质依次为无水乙醇和去离子水，目的是除去未参加反应的物质，然后将透析袋里的纳米球溶液用真空冻干机干燥，得到聚丙烯酸叔丁酯纳米球冻干粉，平均粒径47nm。
[0084]
4)酸解脱除聚丙烯酸叔丁酯的叔丁基
[0085]
将聚丙烯酸叔丁酯纳米球冻干粉(100mg)加入90％(体积比)的三氟乙酸水溶液中，室温下反应搅拌8h以脱除叔丁基，然后将反应混合物去离子水中透析24h，将透析袋里的纳米球溶液用真空冻干机干燥，得到具有靶向肝癌细胞的ph/gsh双响应型纳米球冻干粉，平均粒径58nm。
[0086]
5)载药
[0087]
将阿霉素(1mg)溶于5ml ph7.4的磷酸盐缓冲液中，然后加入纳米球冻干粉(5mg)在25℃水浴摇床中震荡混合24h，离心分离除去上清液即得负载阿霉素的ph/gsh双响应型纳米球。载药量为196.4μg/mg纳米球，载药率98.2％。
[0088]
实施例4
[0089]
1)利用atrp反应合成聚6-o-甲代烯丙基-双丙酮-d-葡萄糖(pmaldaglu)
[0090]
室温下在schlenk瓶中加入搅拌子，然后顺次加入溴化亚铜(43.1mg，0.3mmol)、n,n,n,n’,n
’‑
五甲基二亚乙基三胺(pmdeta)(52.0mg，0.3mmol)、maldagal(12.56g，40mmol)及40ml氯苯，经过三个液氮冷冻-抽气-充气-解冻循环过程，除去氧气。最后加入引发剂2-溴丙酸甲酯(167.0mg，1.0mmol)，65℃反应7h，用四氢呋喃溶解反应产物，稀释反应产物后过氧化铝柱除催化剂。得到的无色溶液用正己烷沉淀两次，室温下抽滤，真空干燥，得到pmaldagal。通过核磁氢谱分析单体转化率71.93％，理论分子量9200。
[0091]
2)酸解脱除pmaldagal中的羟基保护基团
[0092]
为了得到含半乳糖的亲水性聚合物，必须脱去pmaldagal侧链糖环上的异丙基保护基团。在50ml锥形瓶中加入1.6g pmaldagal，再向锥形瓶中加入90％(体积比)的三氟乙酸水溶液16ml，室温下搅拌1h，得到的溶液在去离子水中透析2天，真空冻干得到含半乳糖的亲水聚合物。
[0093]
3)利用atrp无皂乳液聚合反应合成具有核壳结构的聚甲基丙烯酸叔丁酯纳米球
[0094]
在50ml schlenk瓶中加入搅拌子，顺次加入cucl(0.20mg，0.002mmol)、pmdeta(0.520mg，0.003mmol)、12-冠醚-4(52.86mg，0.3mmol)、去离子水(20ml)、甲基丙烯酸叔丁酯(270mg，1.898mmol)、n,n
’‑
双(丙烯酰)胱胺(30mg，0.115mmol)，经过三个液氮冷冻-抽气-充气-解冻循环过程，除去氧气。最后加入大分子引发剂pmaldagal(66mg，0.01mmol)，60℃反应16h，将所得的纳米球溶液用透析袋透析24h，透析介质依次为无水乙醇、乙二胺四乙酸和去离子水，目的是除去未参加反应的物质和铜离子，然后将透析袋里的纳米球溶液用真空冻干机干燥，得到聚甲基丙烯酸叔丁酯纳米球冻干粉，平均粒径78nm。
[0095]
4)酸解脱除聚甲基丙烯酸叔丁酯的叔丁基
[0096]
将聚甲基丙烯酸叔丁酯纳米球冻干粉(100mg)加入90％(体积比)的三氟乙酸水溶液中，室温下反应搅拌8h以脱除叔丁基，然后将反应混合物去离子水中透析24h，将透析袋里的纳米球溶液用真空冻干机干燥，得到具有靶向肝癌细胞的ph/gsh双响应型纳米球冻干粉，平均粒径92nm。
[0097]
5)载药
[0098]
将多柔比星(1.5mg)溶于5ml ph7.4的磷酸盐缓冲液中，然后加入纳米球冻干粉(5mg)在25℃水浴摇床中震荡混合24h，离心分离除去上清液即得负载多柔比星的ph/gsh双响应型纳米球。载药量为284.4μg/mg纳米球，载药率94.8％。
[0099]
实验例
[0100]
为了验证本发明中载药纳米球的ph/gsh双重响应性，我们考查了实施例1中所制备的载药纳米球的药物释放曲线，结果如图5所示。图中a线为阿霉素在ph7.4时的药物释放曲线，b线为阿霉素在ph5.0时的药物释放曲线，c线为阿霉素在ph7.4和10mm gsh中的药物释放曲线，d线阿霉素在ph5.0和10mm gsh中的药物释放曲线。在ph 7.4的条件下，阿霉素在72h后的累计释放率仅为18.5％，说明载药纳米粒子在正常的组织环境内可以很好的负载药物；在ph5.0时，由于纳米粒子聚甲基丙烯酸核的质子化，药物与载体之间的静电作用下降，同时纳米球体积收缩对药物也起到了“挤压”作用，72h后阿霉素的累计释放率达到81.2％；在ph7.4+10mm gsh条件下，尽管纳米球与药物之间存在很强的静电作用，但是gsh的存在能够破坏交联剂的二硫键，导致纳米球解体，72h后阿霉素的累计释放率达到85.7％，略高于在ph5.0时的释放率；在ph5.0+10mm gsh条件下，由于纳米球体积收缩和自身降解，阿霉素在72h后的累计释放率达到96.5％，表明了所制备的载药纳米粒子具有ph和gsh双重响应性。
[0101]
为了验证所制备纳米粒子对肝癌细胞的主动靶向性，我们采用流式细胞仪(facs calibur，美国bd公司)考查了实例1中载药纳米粒子被肝癌细胞(hepg2)、宫颈癌细胞(hela)和小鼠胚胎成纤维细胞(nih3t3)摄取情况。分别将三种细胞接种到24孔板中(2
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104个细胞/孔)，再将相同质量的载药纳米粒子分别加入上述三种细胞中，并在37℃下孵育
1、2和3h。用冷pbs洗涤细胞，800rpm离心3min，弃上清后加入1ml pbs混匀。使用流式细胞仪中的fl2-h通道上对每组104个细胞的dox荧光进行统计。最后使用flowjo软件分析得到的流式细胞数据，结果如图6所示。在不同的培养时间下，hepg2细胞内的阿霉素荧光强度始终比hela细胞和nih3t3细胞内的荧光强度高。3h后hepg2细胞内的荧光强度分别是hela细胞和nih3t3细胞内的5.81和6.98倍，表现出显著的靶向效果。这主要是因为载药纳米粒子能够通过与hepg2细胞表面的asgp受体结合，主动靶向进入该细胞，且肝癌细胞内低ph环境与高gsh浓度使得纳米粒子核心收缩且交联结构被破坏，导致阿霉素被大量释放出来。