分解血液中苯丙氨酸的血液灌流器填料的制备方法与流程

1.本发明属于血液灌流器技术领域，特别涉及一种分解血液中苯丙氨酸的血液灌流器填料的制备方法。


背景技术：

2.目前，血液灌流是将血液引入装有固态吸附剂的灌流器中，通过吸附作用，清除血液中透析不能清除的外源性或内源性毒素、药物或代谢废物的一种血液净化技术。主要用于抢救药物和毒物中毒，也可与血液透析合用以清除慢性肾功能衰竭维持性透析患者体内的大分子毒素。
3.由于内部填充的固态吸附剂吸附剂材质均为聚苯乙烯树脂或活性炭，目前大多依赖于供应商的直接供应，使用者的自主研发较少，吸附剂所能吸附的物质类型有限，被吸附的物质分子量不能较为准确的控制，使得血液灌流器大多为非特异性吸附。血液灌流器在临床的使用过程中，经常会发生将某些致病物质有效吸附的同时，把分子量大小近似的其余体液成分也一并吸附的情况。这样会导致人体有益体液成分的丢失，引起一些潜在的健康风险。
4.目前有部分使用者对固态吸附剂作出了不同程度的修饰和再加工，但填料基材还是局限于树脂的本身产品属性，在实际临床应用时难以灵活选择。现有的修饰或改性方法对树脂本身的基础结构并没有进行根本的改变，非特异性吸附的问题没有得到很好的解决，临床无法按照特定的需求来选择相应填料的灌流器，限制了灌流器的临床适应症范围。


技术实现要素：

5.本发明提出一种分解血液中苯丙氨酸的血液灌流器填料的制备方法，解决了上述问题。
6.本发明的技术方案是这样实现的：分解血液中苯丙氨酸的血液灌流器填料的制备方法，包括如下步骤：
7.步骤1、将丙烯酰氯、二氯甲烷和二乙胺混合均匀，得到溶液c；
8.步骤2、分别向溶液c中加入硫酸镁和苯二酚并进行处理后，得到物质a；
9.步骤3、将物质a、四氢呋喃、丙烯酸、偶氮二异丁腈、聚苯乙烯树脂颗粒充分混合均匀后，分别经过过滤、洗涤和干燥，得到物质b；
10.步骤4、将物质b加入phosphatebuffer中，同时加入苯丙氨酸氨裂解酶混合均匀后，分别经过过滤、洗涤和干燥，得到成品。
11.作为一种优选的实施方式，步骤1中将丙烯酰氯、二氯甲烷和二乙胺混合均匀的方法包括如下步骤：
12.步骤10、将丙烯酰氯溶于二氯甲烷中，得到溶液a；
13.步骤11、将二乙胺溶于二氯甲烷中，得到溶液b；
14.步骤12、在通氮气的条件下，将溶液a用恒压滴液漏斗缓慢加入溶液b中，直至滴
完，即得到所述溶液c。
15.作为一种优选的实施方式，步骤1中丙烯酰氯、二氯甲烷和二乙胺的加入比例为，丙烯酰氯(ml)：二氯甲烷(ml)：二乙胺(ml)＝1：(8-12)：(4-5)。
16.作为一种优选的实施方式，步骤2中向溶液c中加入硫酸镁后处理的方法为，干燥过夜后过滤，并将滤液水浴39℃加热110min后，滤液水浴55℃加热45min；
17.步骤2中向溶液c中加入苯二酚后处理的方法为，在9.4mmhg，82℃下进行浓缩，即得到物质a。
18.作为一种优选的实施方式，步骤2中分别向溶液c中加入硫酸镁和苯二酚之前，先将溶液c置于冰水浴中进行搅拌反应后，过滤，并用蒸馏水进行冲洗。
19.作为一种优选的实施方式，步骤2中溶液c、硫酸镁、和苯二酚的比例为，溶液c(ml)：硫酸镁(g)：苯二酚(g)＝(400-500)：(15-20)：1。
20.作为一种优选的实施方式，步骤3中物质a、四氢呋喃、丙烯酸、偶氮二异丁腈、聚苯乙烯树脂颗粒的加入比例为，物质a(g)：四氢呋喃(ml)：丙烯酸(g)：偶氮二异丁腈(mg)：聚苯乙烯树脂颗粒(g)＝3:(30-45):0.5:8:9。
21.作为一种优选的实施方式，步骤3中充分混合均匀的方法为，通入氮气，于70℃的恒温水浴下进行共聚反应24h；
22.步骤3中洗涤的方式为采用70％的乙醇溶液反复洗涤；
23.步骤3中干燥的方式为真空干燥。
24.作为一种优选的实施方式，步骤4中物质b、phosphate buffer和苯丙氨酸氨裂解酶的加入比例为，物质b(g)：phosphate buffer(ml)：苯丙氨酸氨裂解酶(mg)＝9:(20-25):5
25.作为一种优选的实施方式，步骤4中混合均匀的方法为，在4℃恒温的状态下以120rpm的速度振荡12h；
26.步骤4中洗涤的方式为，采用phosphate buffer进行洗涤；
27.步骤4中干燥的方式为，真空干燥。
28.采用了上述技术方案后，本发明的有益效果是：
29.1、本发明所制得的表面固定有苯丙氨酸氨裂解酶(pal)的聚n,n-二乙基丙烯酰胺-丙烯酸改性填料树脂颗粒可分解血液中的苯丙氨酸，扩大了以往血液灌流器的适应症范围；
30.2、与传统一次性使用血液灌流器填料相比，本发明填料运用聚n,n-二乙基丙烯酰胺-丙烯酸改性后的聚苯乙烯树脂颗粒表面枝接了苯丙氨酸氨裂解酶(pal)，可高效清除血液中的苯丙氨酸，对血液中的其他物质成分没有影响，特异性更强；
31.3、本发明中的血液灌流器改性填料表面覆盖层为聚n,n-二乙基丙烯酰胺-丙烯酸，生物相容性好，血流动力学更稳定；
32.4、填料与血液中单一物质的反应更为高效，缩短整体血液灌流的时间，提高了效率。
附图说明
33.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现
有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
34.图1为本发明的流程示意图。
具体实施方式
35.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
36.实施例1
37.如图1所示，一种分解血液中苯丙氨酸的血液灌流器填料的制备方法，取46.7ml丙烯酰氯溶于30ml二氯甲烷中，将溶液搅拌均匀得到溶液a。
38.将208ml二乙胺溶于450ml二氯甲烷中，搅拌均匀得到溶液b。
39.在通氮气(n2)的条件下，将上述a溶液用恒压滴液漏斗以大约1.5s/滴的速度缓慢加入溶液b中，直至滴完，得到溶液c。
40.将溶液c置于冰水浴中，磁力搅拌4小时。反应完全后将固体产物二乙胺盐滤除，滤液用蒸馏水冲洗3遍，冲去残余丙烯酰氯。
41.加入25g硫酸镁干燥过夜后，将五水硫酸镁晶体滤除。滤液置于水浴锅加热至39℃，恒温维持110分钟，除去二氯甲烷。再将水浴锅调整加热至55℃，恒温维持45分钟，除去二乙胺。
42.在剩余滤液中加入1.5g对苯二酚，在9.4mmhg，82℃下旋蒸浓缩90秒，得到n,n-二乙基丙烯酰胺。
43.取所得n,n-二乙基丙烯酰胺15g加入200ml四氢呋喃中，加入2.5g丙烯酸，40mg偶氮二异丁腈，充分搅拌均匀后加入45g聚苯乙烯树脂颗粒，通入氮气(n2)，置于70℃恒温水浴锅，共聚反应24小时。
44.反应完成后将树脂颗粒滤出，用70％的乙醇溶液反复洗涤3次后真空干燥，得到表面覆有聚n,n-二乙基丙烯酰胺-丙烯酸层的改性聚苯乙烯树脂颗粒。
45.取改性聚苯乙烯树脂颗粒45g加入120ml phosphate buffer(50mm，ph 7.4)中，同时加入25mg苯丙氨酸氨裂解酶(pal)，充分混匀。在恒温4℃的条件下以120rpm的速度振荡反应12小时。反应完成后滤出产物，用phosphate buffer(50mm，ph 7.4)洗涤数次后真空干燥，得到表面固定有苯丙氨酸氨裂解酶(pal)的聚n,n-二乙基丙烯酰胺-丙烯酸改性填料树脂颗粒。
46.所得产物即为具有分解苯丙氨酸(pa)作用的改性填料树脂颗粒，可作为血液灌流器的填料装柱，以降低血液中苯丙氨酸(pa)的效果。
47.实施例2
48.如图1所示，一种分解血液中苯丙氨酸的血液灌流器填料的制备方法，取70ml丙烯酰氯溶于45ml二氯甲烷中，将溶液搅拌均匀得到溶液a。
49.将280ml二乙胺溶于515ml二氯甲烷中，搅拌均匀得到溶液b。
50.在通氮气(n2)的条件下，将上述a溶液用恒压滴液漏斗以大约1.5s/滴的速度缓慢加入溶液b中，直至滴完，得到溶液c。
51.将溶液c置于冰水浴中，磁力搅拌4小时。反应完全后将固体产物二乙胺盐滤除，滤液用蒸馏水冲洗3遍，冲去残余丙烯酰氯。
52.加入34g硫酸镁干燥过夜后，将五水硫酸镁晶体滤除。滤液置于水浴锅加热至39℃，恒温维持110分钟，除去二氯甲烷。再将水浴锅调整加热至55℃，恒温维持45分钟，除去二乙胺。
53.在剩余滤液中加入2.3g对苯二酚，在9.4mmhg，82℃下旋蒸浓缩90秒，得到n,n-二乙基丙烯酰胺。
54.取所得n,n-二乙基丙烯酰胺20g加入200ml四氢呋喃中，加入3.3g丙烯酸，53mg偶氮二异丁腈，充分搅拌均匀后加入60g聚苯乙烯树脂颗粒，通入氮气(n2)，置于70℃恒温水浴锅，共聚反应24小时。
55.反应完成后将树脂颗粒滤出，用70％的乙醇溶液反复洗涤3次后真空干燥，得到表面覆有聚n,n-二乙基丙烯酰胺-丙烯酸层的改性聚苯乙烯树脂颗粒。
56.取改性聚苯乙烯树脂颗粒55g加入122ml phosphate buffer(50mm，ph 7.4)中，同时加入31mg苯丙氨酸氨裂解酶(pal)，充分混匀。在恒温4℃的条件下以120rpm的速度振荡反应12小时。反应完成后滤出产物，用phosphate buffer(50mm，ph 7.4)洗涤数次后真空干燥，得到表面固定有苯丙氨酸氨裂解酶(pal)的聚n,n-二乙基丙烯酰胺-丙烯酸改性填料树脂颗粒。
57.所得产物即为具有分解苯丙氨酸(pa)作用的改性填料树脂颗粒，可作为血液灌流器的填料装柱，以降低血液中苯丙氨酸(pa)的效果。
58.实施例3
59.如图1所示，一种分解血液中苯丙氨酸的血液灌流器填料的制备方法，取100ml丙烯酰氯溶于64ml二氯甲烷中，将溶液搅拌均匀得到溶液a。
60.将500ml二乙胺溶于1136ml二氯甲烷中，搅拌均匀得到溶液b。
61.在通氮气(n2)的条件下，将上述a溶液用恒压滴液漏斗以大约1.5s/滴的速度缓慢加入溶液b中，直至滴完，得到溶液c。
62.将溶液c置于冰水浴中，磁力搅拌4小时。反应完全后将固体产物二乙胺盐滤除，滤液用蒸馏水冲洗3遍，冲去残余丙烯酰氯。
63.加入72g硫酸镁干燥过夜后，将五水硫酸镁晶体滤除。滤液置于水浴锅加热至39℃，恒温维持110分钟，除去二氯甲烷。再将水浴锅调整加热至55℃，恒温维持45分钟，除去二乙胺。
64.在剩余滤液中加入3.6g对苯二酚，在9.4mmhg，82℃下旋蒸浓缩90秒，得到n,n-二乙基丙烯酰胺。
65.取所得n,n-二乙基丙烯酰胺30g加入450ml四氢呋喃中，加入5g丙烯酸，80mg偶氮二异丁腈，充分搅拌均匀后加入90g聚苯乙烯树脂颗粒，通入氮气(n2)，置于70℃恒温水浴锅，共聚反应24小时。
66.反应完成后将树脂颗粒滤出，用70％的乙醇溶液反复洗涤3次后真空干燥，得到表面覆有聚n,n-二乙基丙烯酰胺-丙烯酸层的改性聚苯乙烯树脂颗粒。
67.取改性聚苯乙烯树脂颗粒60g加入167ml phosphate buffer(50mm，ph 7.4)中，同时加入33mg苯丙氨酸氨裂解酶(pal)，充分混匀。在恒温4℃的条件下以120rpm的速度振荡反应12小时。反应完成后滤出产物，用phosphate buffer(50mm，ph 7.4)洗涤数次后真空干燥，得到表面固定有苯丙氨酸氨裂解酶(pal)的聚n,n-二乙基丙烯酰胺-丙烯酸改性填料树脂颗粒。
68.所得产物即为具有分解苯丙氨酸(pa)作用的改性填料树脂颗粒，可作为血液灌流器的填料装柱，以降低血液中苯丙氨酸(pa)的效果。
69.对比例
70.本发明中所采用的血液灌流器包括柱体，柱体的顶部螺纹盖设有上盖体，上盖体的顶部设置有进液口，柱体的底部螺纹盖设有下盖体，下盖体的底部设置有出液口，柱体内分别填设有本发明所制备的改性聚苯乙烯树脂颗粒和未改性的树脂颗粒，分别将血浆通过蠕动泵注入放有改性聚苯乙烯树脂颗粒和未改性树脂颗粒的血液灌流器，并对输出的血浆利用荧光法进行检测，经过改性树脂颗粒(实施例1所得)的检测结果如下表所示：
[0071][0072]
经过未改性树脂颗粒的检测结果如下表所示：
[0073][0074]
由上表可知，血浆通过本发明所制备的改性聚苯乙烯树脂颗粒有良好的去除苯丙氨酸效果。
[0075]
苯丙酮尿症(pku)是一种常见的氨基酸代谢病，是由于苯丙氨酸(pa)代谢途径中必须的苯丙氨酸羟化酶(pah)缺陷，使得苯丙氨酸不能转变成为酪氨酸，导致苯丙氨酸及其酮酸蓄积，并从尿中大量排出。本病在遗传性氨基酸代谢缺陷疾病中比较常见，主要临床特征为脑电图异常、智力低下、精神神经症状、湿疹、皮肤抓痕征及色素脱失和鼠尿味等，低苯丙氨酸饮食疗法是目前治疗经典型pku的惟一方法。本发明通过制备n,n-二乙基丙烯酰胺，将n,n-二乙基丙烯酰胺在聚苯乙烯树脂颗粒表面发生共聚而固定在树脂颗粒表面，同时枝接上丙烯酸基团，利用羧基与游离的苯丙氨酸氨裂解酶(pal)发生酰胺化反应而进行固定化，形成具有分解苯丙氨酸功能的改性聚苯乙烯树脂颗粒。血液中的苯丙氨酸(pa)流经以该树脂颗粒作为填料制作的血液灌流器时，与树脂颗粒表面所固定的苯丙氨酸氨裂解酶(pal)发生催化反应而被分解，来降低血液中的苯丙氨酸含量的目的。
[0076]
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。