苏木的活性成分在抗冠状病毒中的应用1.本专利申请为申请号为：cn202110219570.x，申请日为2021年02月26日，发明名称为《多酚类物质在抗冠状病毒中的应用》的分案申请。
技术领域：
：2.本发明属于生物医药
技术领域：
：，涉及苏木的活性成分在抗冠状病毒中的应用，具体涉及苏木的活性成分在制备治疗和/或预防冠状病毒引发的疾病的药物中的应用。
背景技术：
：：3.冠状病毒是一类与人畜密切相关的病毒。冠状病毒hcov-229e和hcov-oc43会引起普通感冒(vanderhoek,l.,pyrc,k.,jebbink,m.etal.identificationofanewhumancoronavirus.natmed2004,10,368–373)。sars冠状病毒引起的严重急性呼吸系统综合征(sars)致死率达到了10％(stadler,k.,masignani,v.,eickmann,m.etal.sars—beginningtounderstandanewvirus.natrevmicrobiol2003,1,209–218)。2004年鉴定出的hcov-nl63同样能引起类似感冒的呼吸道疾病(vanderhoek,l.,pyrc,k.,jebbink,m.etal.identificationofanewhumancoronavirus.natmed2004,10,368–373)。中东呼吸综合征冠状病毒(mers‑ꢀcov)(dewit,e.,vandoremalen,n.,falzarano,d.etal.sarsandmers:recentinsightsintoemergingcoronaviruses.natrevmicrobiol2016,14,523–534.)。sars-cov-2病毒会引发covid-19，临床表现为发烧，干咳和呼吸困难，重症会造成死亡(jeannetteguarner,md,threeemergingcoronavirusesintwodecades:thestoryofsars,mers,andnowcovid-19,americanjournalofclinicalpathology,,aqaa029)。冠状病毒对于畜牧业影响巨大：猪流行性腹泻病毒(pedv)、肠胃炎病毒(tgev)和猪丁型冠状病毒(porcinedeltacoronavirus，pdcov，也叫德尔塔病毒)，可引起猪的严重肠炎、腹泻、呕吐和脱水，给养猪业带来巨大的损失(akimkinv,beerm,blomes,etal.newchimericporcinecoronavirusinswinefeces,germany,2012.emerginfectdis.2016,22(7):1314–1315)。猫传染性腹膜炎病毒(fipv)可引起的猫科动物的致死性疾病。禽传染性支气管炎病毒(ibv)感染禽类，是一种分布广泛的家禽疾病，对家禽业造成了巨大的经济影响。4.冠状病毒在系统分类上属套式病毒目(nidovirales)冠状病毒科(coronaviridae)冠状病毒亚科(orthocoronavirinae)，日前sars-cov-2冠状病毒基因组序列已经公布，该序列与sars-cov的核苷酸相似度约为90％，蛋白质序列与sars-cov有约80％的序列相似性。冠状病毒的基因组为单股正链rna，长度约28kb，主要编码病毒包装所需的结构蛋白以及与复制转录相关的非结构蛋白。开发治疗冠状病毒相关疾病的药物和疫苗主要针对上述两类蛋白。病毒基因组的三分之二的基因主要编码非结构蛋白。病毒编码了两种多聚酶蛋白pp1a和pp1ab，用于参与病毒的复制过程。pp1a和pp1ab通过两种由病毒编码的木瓜蛋白酶和主蛋白酶(mainprotease)可以将其切割成16个非结构蛋白nsp1‑ꢀ16，只有当这些功能亚基被病毒编码的蛋白酶切割成独立的蛋白单元，病毒才能完成正常536)。由于高水平的trx-1与结直肠癌、胃癌和肺癌相关，因此，对于晚期转移癌患者，px-12被认为是一种与化疗联合使用的潜在癌症治疗手段(jordan,bénédictef.,etal."thethioredoxin‑ꢀ1inhibitor1-methylpropyl2-imidazolyldisulfide(px-12)decreasesvascularpermeabilityintumorxenograftsmonitoredbydynamiccontrastenhancedmagneticresonanceimaging."clinicalcancerresearch11.2(2005):529-536.)。19.dixanthogen(分子式为c6h10o2s4；cas号：502-55-6)是芽前使用的非持效性触杀型除草剂。防治洋葱、胡萝卜、甜菜、菜豆等、马齿苋、藜、匍匐冰草、野燕麦、马唐、繁缕等一年生阔叶杂草和禾本科杂草。大鼠急性口服半数致死率ld50为603mg/kg，兔为770mg/kg，豚鼠为500mg/kg。20.卡莫氟(carmofur，分子式为c11h16fn3o3；cas号：61422-45-5)是氟尿嘧啶的衍生物，是一种抗肿瘤药，口服后从肠道迅速吸收，在体内缓缓释出氟尿嘧啶，借氟尿嘧啶的抗代谢作用而发挥抗肿瘤作用。卡莫氟口服后有效血药浓度较氟尿嘧啶静注长久。抗瘤谱广，治疗指数高，对多种实验肿瘤有较好的抗肿瘤作用。临床上对胃癌、结直肠癌及乳腺癌有一定疗效，尤以结直肠癌的有效率较为突出(kamikamakanehito；kikuchimasahiko.stablecarmofur-beta-cyclodextrinclathratecompound[p].；jps60185772,1985-09-21.)。[0021]胆酸甲酯(methylcholate；分子式c25h42o5；cas号：1448-36-8)用作胆汁酸衍生物，具有抗炎和抗肿瘤作用。不溶于水，溶于中等极性有机溶剂。可作为一种去污剂。[0022]二氢杨梅素(dihydromyricetin；分子式：c15h12o8；cas号：27200-12-0)是一种二氢黄酮醇类黄酮化合物，具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抑制体内血栓形成等多方面的药理作用。二氢杨梅素可以降低细胞内atp水平激活ampk通路，从而增加细胞自噬相关基因表达水平和细胞内自噬小体的数量，从而发挥抗衰老的作用。除此之外，二氢杨梅素具有显著的抗甲型流感病毒的活性，它可以特异性地破环pb2cap和宿主细胞帽状结构的相互作用，影响病毒的入侵复制(cuilang；fanxiaolan；maoxueping；anti‑ꢀagingmedicinebasedondihydromyricetin[p].中国：cn107496415a2017-12-22chenfangzhao；chenfeimin；liumiaomiao；applicationsofdihydromyricetininpreparationofanti-influenzavirusdrugs[p].中国：cn108354923a2018-08-03)。[0023]柯里拉京(corilagin分子式：c27h22o18；cas号：23094-69-1)是一种逆没食子酸鞣质，对许多心血管疾病，包括高血压，动脉粥样硬化、中风、充血性心衰和缺血性心肌病，有很好的作用。柯里拉京以25μg/ml的mic抑制金黄色葡萄球菌的生长。柯里拉京对肝细胞癌和卵巢癌显示出良好的抗肿瘤活性。柯里拉京是一种天然产物，且具有漫长的药用史，对正常细胞和组织显示出较低水平的毒性。此外，柯里拉京还可以抑制rna肿瘤病毒的逆转录酶活性以及乙肝病毒dna聚合酶活性(抗肝炎b病毒dna-聚合酶的ic50为0.2mm。)(chengyung-chi；inhibitionofhumanretroviruses.epo:wo9004968a11990-05-17chungchongchan；pharmaceuticalcompositionforthetreatmentofhepatitisbcomprisingcorilaginorbrevifolincarboxylicacid.epo:wo0027413a12000-05-18)。[0024]氯胺t(chloramine-t分子式：c7h7clnnao2s；cas号：127-65-1)为外用消毒药，对细xuj,yaoz,zhangx,gonzalezfj,yaox,.theeffluxmechanismoffraxetin-o-glucuronidesinugt1a9-transfectedhelacells:identificationofmultidrugresistance-associatedproteins3and4(mrp3/4)astheimportantcontributors.frontpharmacol.2019may7；10:496)。体外实验表明，fraxetin对真菌具有较好的抑制作用，能够恢复抗真菌药氟康唑对耐药真菌的作用，因此可以作为抗真菌药和抗真菌药的增效剂(cn108771676a)。[0035]乳酸乙吖啶一水合物(ethacridinelactatemonohydrate；分子式为c18h23n3o5；cas号：6402-23-9)用于人类和其他动物的破坏有害微生物或抑制其活性的物质。[0036]甲异靛(meisoindigo；分子式为c17h12n2o2；cas号：97207-47-1)是一种有效的药物，可用于治疗慢性粒细胞白血病(cml)(wangy,zhuxf,xiaozj,wanghh,zhoujm,meiyp,dengr,jiangwq,liuzc.inducementeffectofmeisoindigoonapoptosisofleukemiacelllinehl-60anditsmechanism.aizheng.2005dec；24(12):1464-8)。[0037]迷迭香酸(rosmarinicacid；分子式为c18h16o8；cas号：20283-92-5)是一种天然的酚类抗氧化剂羧酸，具有多种生物活性，包括抗炎和抗肿瘤作用，这是其抑制炎症过程和活性氧清除的结果(sotnikovar,okruhlicoval,vlkovicovaj,navarovaj,gajdacovab,pivackoval,fialovas,krenekp.rosmarinicacidadministrationattenuatesdiabetes-inducedvasculardysfunctionoftherataorta.jpharmpharmacol.2013may；65(5):713-23.)。[0038]南索拉唑(lansoprazole；分子式为c16h14f3n3o2s；cas号：103577-45-3)是一种胃酸分泌抑制剂，在体外对幽门螺杆菌有抗菌作用(mathesonaj,jarvisb.lansoprazole:anupdateofitsplaceinthemanagementofacid-relateddisorders.drugs.2001；61(12):1801‑ꢀ33.)。可用于治疗胃溃疡。[0039]埃索美拉唑镁(esomeprazolemagnesium；分子式为c34h36mgn6o6s2；cas号：161973‑ꢀ10-0)具有胃质子泵抑制剂活性，被用作抗溃疡药，有时代替组胺h2拮抗剂用于胃食管反流。[0040]现有技术中尚无以上药物可用于治疗冠状病毒引发的相关疾病。技术实现要素：[0041]本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中尚无有效治疗和/或预防冠状病毒所引发的疾病的药物的缺陷，提供多酚类物质在抗冠状病毒中的应用，具体涉及多酚类物质等化合物在制备治疗和/或预防冠状病毒引发的疾病的药物中的应用。[0042]本发明主要通过以下技术方案解决上述技术问题。[0043]本发明提供多酚类物质、质子泵抑制剂、对苯醌(cas号：106-51-4)及其衍生物、苏木的活性成分、tdzd-8(cas号：327036-89-5)、硫柳汞(cas号：54-64-8)、紫草素(cas号：517-89-5)、tideglusib(cas号：865854-05-3)、原黄素(cas号：92-62‑ꢀ6)、杨梅黄酮(cas号：529-44-2)、px-12(cas号：141400-58-0)、dixanthogen(cas号：502-55-6)、胆酸甲酯(cas号：1448-36-8)、卡莫氟(cas号：61422-45-5)、柯里拉京(cas号：23094-69-1)、二氢杨梅素(cas号：27200-12-0)、氯胺t(cas号：127-65-1)、汞溴红(cas号：129-16-8)、没食子儿茶素(cas号：970-73-0)、秦皮素(cas号：574-84-5)、甲异靛(cas号：97207-47-1)、乳酸乙bronchitisvirus,ibv；gamma冠状病毒属)等动物疾病。[0054]因此，本发明所述冠状病毒的较佳地选自sars-cov-2、sars-cov、mers-cov、hcov-hku1、hcov-nl63、hcov-oc43、hcov-229e、tgev、pedv、pdcov、fipv或者ibv。[0055]在某一方案中，本发明的以上化合物或其药学上可接受的盐以包含其的药物组合物的形式存在；较佳地，所述药物组合物以本发明所述化合物和/或其药学上可接受的盐作为所述药物组合物的唯一活性成份；和/或，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体，例如药学上可接受的药用辅料。[0056]在某一方案中，本发明的以上多种化合物或其药学上可接受的盐以包含其的套装药盒的形式存在，所述套装药盒还包括治疗与冠状病毒相关的疾病的药物和/或治疗其他病毒引起的疾病的药物。[0057]本发明提供了苏木的活性成分在制备抑制冠状病毒的药物中的应用。[0058]在某一方案中，所述的苏木的活性成分选自苏木精、原苏木素b或者巴西木素。[0059]在某一方案中，所述冠状病毒为sars-cov-2。[0060]本发明中涉及的以本发明多种化合物作为活性成份的药物组合物，均可根据本领域公知的方法制备。可通过将本发明化合物制成适于人或动物使用的任何剂型。本发明化合物在其药物组合物中的重量含量通常为0.1-99.0％。[0061]所述的药学可接受的载体可为本领域常规的载体，所述的载体可以为任意合适的生理学或药学上可接受的药物辅料。所述的药物辅料为本领域常规的药物辅料，较佳地包括药学上可接受的赋形剂、填充剂或稀释剂等。更佳地，所述的药物组合物包括0.01～99.99％的上述蛋白质和/或上述的抗体药物偶联物，和0.01～99.99％的药用载体，所述百分比为占所述药物组合物的质量百分比。[0062]本发明化合物或含其的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔、口腔粘膜、眼、肺和呼吸道、皮肤、阴道、直肠等。[0063]给药剂型可以是液体剂型、固体剂型或半固体剂型。液体剂型可以是溶液剂(包括真溶液和胶体溶液)、乳剂(包括o/w型、w/o型和复乳)、混悬剂、注射剂(包括水针剂、粉针剂和输液)、滴眼剂、滴鼻剂、洗剂和搽剂等；固体剂型可以是片剂(包括普通片、肠溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡腾片、口腔崩解片)、胶囊剂(包括硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊)、颗粒剂、散剂、微丸、滴丸、栓剂、膜剂、贴片、气(粉)雾剂、喷雾剂等；半固体剂型可以是软膏剂、凝胶剂、糊剂等。[0064]本发明化合物可以制成普通制剂、也可以制成缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。[0065]术语“药学上可接受的”是指盐、溶剂、辅料等一般无毒、安全，并且适合于患者使用。所述的“患者”优选哺乳动物，更优选为人类。[0066]术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物与相对无毒的、药学上可接受的酸或碱制备得到的盐。当本发明的化合物中含有相对酸性的功能团时，可以通过在纯的溶液或合适的惰性溶剂中用足够量的药学上可接受的碱与这类化合物的中性形式接触的方式获得碱加成盐。药学上可接受的碱加成盐包括但不限于：锂盐、钠盐、钾盐、钙盐、铝盐、镁盐、锌盐、铋盐、铵盐、二乙醇胺盐。当本发明的化合物中含有相对碱性的官能团时，可以通过在纯的溶液或合适的惰性溶剂中用足够量的药学上可接受的酸与这类化合物的中性形式接触的方式获得酸加成盐。所述的药学上可接受的酸包括无机酸，所述无机酸包括但不限于：盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硝酸、碳酸、磷酸、亚磷酸、硫酸等。所述的药学上可接受的酸包括有机酸，所述有机酸包括但不限于：乙酸、丙酸、草酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、反丁烯二酸、乳酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、水杨酸、酒石酸、甲磺酸、异烟酸、酸式柠檬酸、油酸、单宁酸、泛酸、酒石酸氢、抗坏血酸、龙胆酸、富马酸、葡糖酸、糖酸、甲酸、乙磺酸、双羟萘酸(即4,4’‑亚甲基-双(3-羟基-2-萘甲酸))、氨基酸(例如谷氨酸、精氨酸)等。当本发明的化合物中含有相对酸性和相对碱性的官能团时，可以被转换成碱加成盐或酸加成盐。具体可参见bergeetal.,"pharmaceuticalsalts",journalofpharmaceuticalscience66:1-19(1977)、或、handbookofpharmaceuticalsalts:properties,selection,anduse(p.heinrichstahlandcamilleg.wermuth,ed.,wiley-vch,2002)。[0067]在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。[0068]本发明所用试剂和原料均市售可得。[0069]本发明的积极进步效果在于：[0070]本发明通过体外酶活实验发现1,4-萘醌等33个化合物可以很好地抑制冠状病毒中的主蛋白酶的活性，填补了现有技术缺乏治疗冠状病毒引发的疾病的不足。可对该化合物进行进一步研究、改造以进行应用。附图说明[0071]图1：1,4-萘醌对新型冠状病毒主蛋白酶的抑制活性；1：dmso(阴性对照),2:化合物分子；3：阳性对照(n3抑制剂)。[0072]图2：tdzd-8对新型冠状病毒主蛋白酶的抑制活性；1：dmso(阴性对照),2:化合物分子；3：阳性对照(n3抑制剂)。[0073]图3：苏枋精对新型冠状病毒主蛋白酶的抑制活性；1：dmso(阴性对照),2:化合物分子；3：阳性对照(n3抑制剂)。[0074]图4：硫柳汞对新型冠状病毒主蛋白酶的抑制活性；1：dmso(阴性对照),2:化合物分子；3：阳性对照(n3抑制剂)。[0075]图5：紫草素对新型冠状病毒主蛋白酶的抑制活性；1：dmso(阴性对照),2:化合物分子；3：阳性对照(n3抑制剂)。[0076]图6：tideglusib对新型冠状病毒主蛋白酶的抑制活性；1：dmso(阴性对照),2:化合物分子；3：阳性对照(n3抑制剂)。[0077]图7：埃索美拉唑镁对新型冠状病毒主蛋白酶的抑制活性；1：dmso(阴性对照),2:化合物分子；3：阳性对照(n3抑制剂)。[0078]图8：苏木精对新型冠状病毒主蛋白酶的抑制活性；1：dmso(阴性对照),2:化合物分子；3：阳性对照(n3抑制剂)。[0079]图9：对苯醌对新型冠状病毒主蛋白酶的抑制活性；1：dmso(阴性对照),2:化合物分子；3：阳性对照(n3抑制剂)。[0080]图10：原黄素对新型冠状病毒主蛋白酶的抑制活性；1：dmso(阴性对照),2:化合物分子；3：阳性对照(n3抑制剂)。[0081]图11：雷贝拉唑钠对新型冠状病毒主蛋白酶的抑制活性；1：dmso(阴性对照),2:化合物分子；3：阳性对照(n3抑制剂)。[0082]图12：杨梅黄酮对新型冠状病毒主蛋白酶的抑制活性；1：dmso(阴性对照),2:化合物分子；3：阳性对照(n3抑制剂)。[0083]图13：px-12对新型冠状病毒主蛋白酶的抑制活性；1：dmso(阴性对照),2:化合物分子；3：阳性对照(n3抑制剂)。[0084]图14：dixanthogen对新型冠状病毒主蛋白酶的抑制活性；1：dmso(阴性对照),2:化合物分子；3：阳性对照(n3抑制剂)。[0085]图15：卡莫氟对新型冠状病毒主蛋白酶的抑制活性；1：dmso(阴性对照),2:化合物分子；3：阳性对照(n3抑制剂)。[0086]图16：胆酸甲酯对新型冠状病毒主蛋白酶的抑制活性；1：dmso(阴性对照),2:化合物分子；3：阳性对照(n3抑制剂)。[0087]图17：二氢杨梅素对新型冠状病毒主蛋白酶的抑制活性；1：dmso(阴性对照),2:化合物分子；3：阳性对照(n3抑制剂)。[0088]图18：柯里拉京对新型冠状病毒主蛋白酶的抑制活性；1：dmso(阴性对照),2:化合物分子；3：阳性对照(n3抑制剂)。[0089]图19：氯胺t对新型冠状病毒主蛋白酶的抑制活性；1：dmso(阴性对照),2:化合物分子；3：阳性对照(n3抑制剂)。[0090]图20：红汞对新型冠状病毒主蛋白酶的抑制活性；1：dmso(阴性对照),2:化合物分子；3：阳性对照(n3抑制剂)。[0091]图21：艾普拉唑钠对新型冠状病毒主蛋白酶的抑制活性；1：dmso(阴性对照),2:化合物分子；3：阳性对照(n3抑制剂)。[0092]图22：蟛蜞菊内酯对新型冠状病毒主蛋白酶的抑制活性；1：dmso(阴性对照),2:化合物分子；3：阳性对照(n3抑制剂)。[0093]图23：(-)-epigallocatechingallate对新型冠状病毒主蛋白酶的抑制活性；1：dmso(阴性对照),2:化合物分子；3：阳性对照(n3抑制剂)。[0094]图24：茶多酚对新型冠状病毒主蛋白酶的抑制活性；1：dmso(阴性对照),2:化合物分子；3：阳性对照(n3抑制剂)。[0095]图25：百里香醌对新型冠状病毒主蛋白酶的抑制活性；1：dmso(阴性对照),2:化合物分子；3：阳性对照(n3抑制剂)。[0096]图26：甲基儿茶酚对新型冠状病毒主蛋白酶的抑制活性；1：dmso(阴性对照),2:化合物分子；3：阳性对照(n3抑制剂)。[0097]图27：没食子儿茶素对新型冠状病毒主蛋白酶的抑制活性；1：dmso(阴性对照),2:化合物分子；3：阳性对照(n3抑制剂)。[0098]图28：原苏木素b对新型冠状病毒主蛋白酶的抑制活性；1：dmso(阴性对照),2:化合物分子；3：阳性对照(n3抑制剂)。[0099]图29：秦皮素对新型冠状病毒主蛋白酶的抑制活性；1：dmso(阴性对照),2:化合物分子；3：阳性对照(n3抑制剂)。[0100]图30：乳酸乙吖啶一水合物对新型冠状病毒主蛋白酶的抑制活性；1：dmso(阴性对照),2:化合物分子；3：阳性对照(n3抑制剂)。[0101]图31：甲异靛对新型冠状病毒主蛋白酶的抑制活性；1：dmso(阴性对照),2:化合物分子；3：阳性对照(n3抑制剂)。[0102]图32：迷迭香酸对新型冠状病毒主蛋白酶的抑制活性；1：dmso(阴性对照),2:化合物分子；3：阳性对照(n3抑制剂)。[0103]图33：南索拉唑对新型冠状病毒主蛋白酶的抑制活性；1：dmso(阴性对照),2:化合物分子；3：阳性对照(n3抑制剂)。[0104]图1～图33中纵坐标单位为rfu(relativefluorescenceunits；相对荧光的单位)。[0105]图34：卡莫氟对新冠病毒主蛋白酶的酶活抑制曲线。[0106]图35：卡莫氟在细胞水平上的抗病毒效果，数据通过qrt-pcr方法测得。[0107]图36：卡莫氟在细胞水平上的抗病毒效果，数据通过免疫荧光法测得，以氯喹作为阳性对照。[0108]图37：体外细胞毒性实验，测定细胞存活率。具体实施方式[0109]下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。[0110]以下所用veroe6细胞购自atcc。[0111]实施例1[0112]从不同的化合物库中进行高通量筛选，成功筛选的33种化合物对新型冠状病毒主蛋白酶均有较好的抑制效果。酶活实验条件具体为：[0113]酶活实验荧光底物：mca-avlqsgfr-lys(dnp)-lys-nh2，此荧光底物的激发波长和发射波长分别为320nm和405nm。[0114]酶活反应buffer为50mmtris–hcl(ph7.3)，1mmedta；酶活反应温度：30℃。反应起始通过添加蛋白酶，蛋白酶反应终浓度为0.2μm，底物浓度为20μm，抑制剂(33种小分子化合物)浓度1.5μm。(xuex,yangh,shenw,etal.productionofauthenticsars-covmprowithenhancedactivity:applicationasanoveltag-cleavageendopeptidaseforproteinoverproduction[j].journalofmolecularbiology,2007,366(3):965-975.)。[0115]所用阳性对照为n3抑制剂，已知其能够有效灭活冠状病毒主蛋白酶(杨海涛,谢卫青,xiaoyux,etal.designofwide-spectruminhibitorstargetingcoronavirusmainproteases[j].生命有机化学,2005,3(10):1742-1752.)，结构式如下所示：[0116][0117]根据图1～图33可知：33个化合物的酶活实验曲线，明显区别于阴性对照，对冠状病毒主蛋白酶有明显抑制活性。[0118]实施例2[0119]酶活抑制曲线测定使用的荧光底物：mca-avlqsgfr-lys(dnp)-lys-nh2，此荧光底物的激发波长和发射波长分别为320nm和405nm。[0120]酶活抑制曲线测定buffer为50mmtris–hcl(ph7.3)，1mmedta；反应温度：30℃。反应起始通过添加蛋白酶，蛋白酶反应终浓度为0.2μm，底物浓度为20μm，使用11个不同浓度的卡莫氟进行测量，测试结果显示ic50值为1.82μm(图34)(jinz,dux,xuy,etal.structureofmprofromcovid-19virusanddiscoveryofitsinhibitors[j].nature,2020,582(7811):1-9.)。[0121]体外细胞抗病毒实验使用6个不同浓度的卡莫氟处理感染sars-cov-2的veroe6细胞1小时，病毒moi(multiplicityofinfection)为0.05。然后去除病毒和药物和混合物，清洗后继续使用含不同浓度卡莫氟的培养基培养。经过24小时培养后取上清进行qrt‑ꢀpcr分析，同时将细胞固定通过免疫荧光法检测细胞内n蛋白水平进一步确定实验结果。实验发现卡莫氟可防止新型冠状病毒感染引起的细胞病变，ec50值为24.3μm(图35、图36)，因此卡莫氟可用于治疗冠状病毒引发的相关疾病(jin,z.,zhao,y.,sun,y.etal.structuralbasisfortheinhibitionofsars-cov-2mainproteasebyantineoplasticdrugcarmofur.natstructmolbiol27,529–532(2020).)。[0122]体外的细胞毒性实验使用8个不同浓度的卡莫氟处理veroe6细胞。veroe6细胞在96孔板中悬浮培养。第二天，在培养基中加入不同浓度的卡莫氟。24小时后，使用细胞计数试剂盒-8(cck8,beyotime)测定存活细胞的相对数量。如图37所示，卡莫氟的cc50值为133.37μm(jin,z.,zhao,y.,sun,y.etal.structuralbasisfortheinhibitionofsars‑ꢀcov-2mainproteasebyantineoplasticdrugcarmofur.natstructmolbiol27,529–532(2020).)。当前第1页12当前第1页12