咽舒合剂用于新冠病毒治疗新用途的制作方法

1.本发明涉及中药应用技术领域，具体涉及咽舒合剂在新冠病毒治疗中的应用。


背景技术：

2.咽舒合剂来源于彝族医药——老彝医鲁廷凯一九七二年献出的家传验方“二草汤”。该方组方符合彝族医药理论，通过现代药理及药学研究研制而成，其主要成分为虎掌草、午香草、玄参、牛蒡子、射干、桔梗、陈皮、甘草；辅料为蜂蜜、蔗糖。性状为棕褐色的粘稠液体；气微香，味苦，微酸。功能主治：清咽利喉，止咳化痰。用于风热证或痰热证引起的咽喉肿痛，咳嗽、痰多、发热、口苦；急慢性咽炎、扁桃体炎。
3.感染奥密克戎的症状：主要症状包括极度疲倦、肌肉酸痛、头部酸痛、喉咙沙哑和干咳，而没有发现感染传统新冠病毒后出现的嗅觉或味觉丧失、呼吸困难等明显症状。
4.中医进行辩证论治有湿热蕴肺证，临床表现：低热或不发热，微恶寒，乏力，头身困重，肌肉酸痛，干咳痰少，咽痛，口干不欲多饮，或伴有胸闷脘痞，无汗或汗出不畅，或见呕恶纳呆，便溏或大便粘滞不爽。舌淡红，苔白厚腻或薄黄，脉滑数或濡。中医证明宜清热刮湿，宣肺化痰。
5.本发明专利组方：虎掌草，据《云南省中药材标准》记载，清热解毒，止咳祛痰，利湿消黄；午香草，据《全国中药材汇编》记载，具有清热利湿，止咳截症，另据《中国彝族药学》记载，具有清火利湿、止咳，两者都具有清热利湿、止咳祛痰的功效，为本组方之君药。
6.玄参，据《中华药海》记载，具有清热、凉血、解毒、降火，玄参具禀至阴之品，能退血热，甘能滋阴，用于肺阴亏损，另据《医学衷中参西录》：“玄参，味甘微苦，性凉多液，原为清补肾经之药。又能入肺以清肺家烁热，解毒消火，最宜于肺病结核，肺热咳嗽。射干，据《医学本草》记载，具有解毒利咽，清热化痰之功效。牛蒡子，据《本草求真》：“牛蒡味辛且苦，既能降气下行，复能散风除热，是以感受风邪热毒而见面目浮肿，咳嗽痰壅，咽间肿痛，疮疡斑疹，及一切臭毒、痧闭、痘疮紫黑、便闭等症，无不借此表解里清。但性冷滑利，多服则中气有损，且更令表益虚矣。至于脾虚泄泻为尤忌焉。”以上三味具有解毒、利咽、滋阴降火之功效，为臣药。
7.陈皮，《本草汇言》：“味辛善散，故能开气；胃苦开泄，故能行痰；其气温平，善于通达，故能止呕、止咳，健脾和胃者也，具有健肝理气、燥湿化痰之功效，能辅佐君臣药，具有避免苦寒药性伤其肝胃的功效。桔梗，性苦、辛、平，归肺经，具有宣肺解表，提肺气之功效，引药入肺。甘草味甘，性平,归心、肺、脾、胃经,补脾益气，清热解毒，祛痰止咳，缓急止痛，调和诸药；三者共为使药。
8.以上八味配伍具有清热利湿、宣肺化痰之功效。因此，从中医理论上分析，咽舒合剂的功效是符合中医治疗新冠肺炎理论的。
9.根据中医理论和新冠疫情的症状以及咽舒合剂的配伍原理，申请人推测咽舒合剂可能具有对新冠病毒的抑制作用，为了探究咽舒合剂是否可以预防新冠病毒，本发明通过病毒实验，为进一步抗疫提供病毒学依据。


技术实现要素：

10.本发明的目的是提供一种新冠病毒治疗的中药学新途径，具体为咽舒合剂在新型冠状病毒omicron变异株预防和治疗中的应用。
11.为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：本发明应用细胞病变效应法（cpe法）评价受试药物咽舒合剂对新型冠状病毒野生株及omicron变异株在vero e6细胞内的体外抗新型冠状病毒（sars-cov-2）活性，并测试了咽舒合剂在vero e6细胞内细胞毒性。试验结果如下：在体外药效试验中，咽舒合剂对新型冠状病毒omicron变异株具有明显抑制活性，但对新冠病毒野生株的抑制作用不明显，其ic50值分别为原液稀释2730倍（omicron株）和581.0倍（野生株）；细胞毒性结果显示咽舒合剂对vero e6细胞的毒性cc50值为原液稀释146.2倍。因此，在体外抗新冠病毒感染的细胞模型中，咽舒合剂对新冠病毒omicron变异株在vero e6细胞中的复制具有明显抑制作用。
12.综上所述，咽舒合剂可以有效抑制新冠病毒，用于预防和治疗新冠病毒导致的疫情感染，所述新冠病毒指新型冠状病毒omicron变异株。
13.本发明的有益技术效果是：在体外药效试验中，咽舒合剂对新型冠状病毒omicron变异株具有明显抑制活性，因此咽舒合剂对于新冠病毒omicron变异株的治疗具有积极的现实价值。
附图说明
14.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
15.图1是本发明咽舒合剂对vero e6细胞的毒性试验结果；图2是本发明咽舒合剂对新冠病毒野生株抗病毒试验结果；图3是本发明咽舒合剂对新冠病毒omicron变异株抗病毒试验结果。
具体实施方式
16.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
17.以下实施例中，所用设备及原料均为市售或者第三方保存，其中：1.受试物中文名称：咽舒合剂生产单位：云南金碧制药有限公司性状：合剂受试物贮存：遮光，密封4℃保存。
18.配制方法：体外试验时配制溶液时以细胞工作液进行稀释溶解到所需浓度进行试验。
19.2.细胞和病毒（1）细胞及来源：vero e6细胞，由广州呼吸健康研究院呼吸疾病国家重点实验室
病毒室保存。地址：广州市越秀区沿江西路151号。
20.分类命名：非洲绿猴肾细胞，veroc1008(e6)细胞是vero76细胞的克隆细胞株，而vero76细胞是初始vero细胞株的一个衍生株。
21.细胞特性：
①
非洲绿猴肾细胞；veroe6组织来源于实验动物的正常组织。
22.②
细胞鉴定：细胞角蛋白-18(ck-18)免疫荧光染色为阳性。
23.③
经鉴定细胞纯度高于90%。
24.④
不含有hiv-1、hbv、hcv、支原体、细菌、酵母和真菌。
25.⑤
细胞生长方式：上皮样，不规则细胞，贴壁培养。
26.（2）病毒来源及质量属性：两种新型冠状病毒（sars-cov-2）毒株(野生株和omicron变异株)，保存在广州海关技术中心p3实验室（呼吸疾病国家重点实验室高致病病原微生物研究室）。
27.保存条件：-80℃超低温冰箱保存。
28.培养方法：用含2%胎牛血清的dmem培养基在veroe6细胞载体中进行病毒分离培养。
29.使用前的适用性评估：不同亚型的新型冠状病毒（sars-cov-2）毒株能引起veroe6细胞出现显著病变，并在veroe6细胞中获得适应性培养扩增，备用。
30.3.试验材料（1）主要试剂（2）主要仪器
实施例1：细胞毒性试验表格 1 咽舒合剂细胞毒性试验分组试验在bsl-2实验室进行。设细胞对照、空白对照（溶剂对照）、不同浓度受试物组。
31.将密度为2
×
105cells/ml的vero e6混悬液细胞接种于96孔无菌培养板中，100μl/孔，在37℃、5%co2环境下培养24h；弃培养上清液，单层细胞用pbs洗涤1次，每孔加入100
µ
l的2倍梯度稀释的咽舒合剂药物，每个浓度3个复孔，正常细胞组和空白对照组孔加入等体积培养液，常规培养4日，其中培养液为常规dmem培养基加入100u/ml青霉素和100u/ml链霉素以及5%胎牛血清的细胞培养液；每孔加入浓度为5mg/ml的mtt溶液20
µ
l，继续孵育4h；弃上清，每孔加入100
µ
ldmso，低速振荡5min，使结晶物充分融解，使用酶标仪于490nm波长下测定吸光值（od），计算抑制率。其中所述dmso为二甲基亚砜，非质子极性溶剂，
为测定吸光值时的溶剂。抑制率=（正常组平均od值-药物组平均od值）/（正常组平均od值-空白组平均od值）
×
100%。
32.reed-meunch法计算药物半数毒性浓度（cc
50
）。
33.细胞毒性结果显示（图1）咽舒合剂对vero e6细胞的毒性cc
50
值为原液稀释146.2倍。
34.实施例2：抗病毒试验表格 2 咽舒合剂抗病毒试验分组试验在bsl-3实验室进行。设细胞对照、空白对照（溶剂对照）、病毒对照（阴性对照）、不同浓度受试物组。
35.将密度为2
×
105cells/ml的vero e6混悬液细胞接种于96孔无菌培养板中，每孔加入100 μl，在37℃、5%co2环境下培养24h；弃培养上清液，实验组和病毒对照组加入100tcid
50
病毒液，100 μl/孔，常规培养吸附2h；弃去培养上清液，每孔加入100
ꢀµ
l的不同浓度的药物，2倍梯度稀释，设4复孔，常规培养孵育3-4天。
36.光学显微镜下观察细胞病变（cpe），细胞出现病变程度按以下6级标准记录：
“‑”
为细胞无病变；
“±”
为细胞病变少于10%；“+”为细胞病变约25%；“++”为细胞病变约50%；“+++”为细胞病变约75%：“++++”为细胞病变超过75%。
37.采用reed-muench法或graphpad prism5.0计算半数抑制浓度(ic
50
)。
38.咽舒合剂：接种vero e6混悬液细胞，加入最大无毒浓度的咽舒合剂，在要求环境培养观察。
39.细胞对照：接种vero e6混悬液细胞，在要求环境培养观察。
40.空白对照：接种vero e6混悬液细胞，加入不含病毒的培养液，在要求环境培养观察。
41.阴性对照：接种vero e6混悬液细胞，加入病毒液，在要求环境培养观察。
42.试验组：接种vero e6混悬液细胞，加入不同稀释浓度的的咽舒合剂，加入病毒液，
在要求环境培养观察。
43.由实验结果可知，咽舒合剂对新型冠状病毒omicron变异株有明显抑制活性，但对新冠病毒野生株的抑制作用不明显，其ic
50
值分别为原液稀释2730倍（omicron株）和581.0倍（野生株），结果如图2和图3所示结果如图2和图3所示综上所述，在体外抗新冠病毒感染的细胞模型中，咽舒合剂对新冠病毒omicron变异株在vero e6细胞中的复制具有抑制作用。
44.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。