反义寡核苷酸在制备治疗肺癌药物中的应用的制作方法

本公开涉及肺癌的基因疗法领域，具体涉及一种以胰岛素样生长因子-1受体igf1r基因为靶标的全硫代反义寡核苷酸或其组合物在抑制肺癌细胞增殖和治疗肺癌中的用途。

背景技术：

1、反义寡聚脱氧核糖核苷酸(antisense oligonucleotide，asodn)是一类经过人工合成的寡核苷酸片段，长度多为15～30个核苷酸，主要通过碱基互补配对原则，干扰靶基因的转录和翻译，从而实现基因的靶向治疗。asodn具有候选靶点丰富，定向合理设计，体内外作用高效和可人工大规模合成等优势，被认为是极具潜力的基因治疗药物。近几年，随着核苷酸化学修饰技术和递送技术的突破，asodn药物研发掀起了新的浪潮，国内外一些著名制药企业已将反义药物作为其新药研发的重点方向之一。目前已有9款反义寡核苷酸药物上市(表1)。

2、表1已上市的反义寡核苷酸药物

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4、肺癌是世界上患病率和死亡率最高的癌症。肺癌是起源于肺部支气管黏膜或腺体的恶性肿瘤，其发病机制复杂，临床无明显症状，多数肺癌患者检查时已确诊为晚期，每年约有160万人死于肺癌，预测的5年生存率仍低于15％。在大多数情况下，肺癌在晚期被诊断。因此，患者经常在肺或其他器官中已经出现转移，即肺外转移。

5、肺癌的两种主要类型是小细胞肺癌(sclc)和非小细胞肺癌(nsclc)，后者占肺癌所有病例的大约85％。

6、肺癌的主要风险因素是吸烟，其占所有肺癌相关死亡的85％以上。肺癌的风险随着每天的吸烟数量和吸烟年数而增加。除了一手烟的危害之外，暴露的非吸烟者发展肺癌的相对风险增加。氡气(由镭226衰变产生的放射性气体)是肺癌的第二大原因。这种同位素的衰变导致产生发射α粒子的物质，这可能导致细胞损伤且因此增加恶性转化的可能性。

7、因此，本领域存在开发出治疗肺癌的药物的需求。

技术实现思路

1、对此，本公开通过设计出独特序列的靶向胰岛素样生长因子-1受体igf1r的反义寡核酸s-asodn-1来治疗肺癌，解决了此技术问题。

2、本公开首次发现，针对胰岛素样生长因子-1受体igf1r的具有特定序列的反义寡核苷酸s-asodn-1可以有效地抑制肺癌细胞增殖和肺癌肿瘤的生长，用于治疗肺癌。实质上，现有的目前已经批准或者进入临床阶段的治疗肺癌的药物中并没有一个以胰岛素样生长因子-1受体igf1r为靶点。并且目前在研的与igf1r受体为靶点的药物的适应症中并不涉及肺癌(具体描述见下表2和表3)。并且，并不是针对igf1r的任何序列的反义寡核苷酸能够治疗肺癌，例如本公开的其他反义寡核苷酸序列s-asodn-2，s-asodn-3，s-asodn-4，s-asodn-5均不能抑制肺癌细胞增殖和肺癌肿瘤的生长，不能用于治疗肺癌(参见实施例2)。

3、肺癌是世界范围内发病率较高的恶性肿瘤疾病，它在我国的发病率正在逐渐增加，对人民的健康和生命安全构成严重威胁。肺癌是一种原发性支气管肺癌，主要分为小细胞癌(约10％-15％)和非小细胞癌(nsclc，占85～90％)。通常，早期肿瘤的治疗选择是手术切除，化疗；靶向治疗和化学免疫治疗主要用于晚期肺癌患者发生转移时。肺癌的早期诊断率约为15％，75％的患者诊断为局部晚期或转移期；晚期肺癌患者的预后被认为是有缺陷的。

4、肺癌的病因不完全明确，大量数据表明，除遗传因素外，后续肿瘤形成的过程在很大程度上取决于致癌物，如烟草、酒精、室内外空气污染、基因突变和饮食不平衡都是导致肺癌发病率增加的原因。

5、表2介绍了目前已经批准或者进入临床阶段的用于治疗肺癌相关的药物，由表2中可见，目前在研究的治疗肺癌的药物中并没有任何一个以胰岛素样生长因子-1受体igf1r为靶点。

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23、胰岛素样生长因子(igfs)，亦称生长调节素，包括igf-i和igf-ii，这些生长因子只有与其受体igf1r结合才能发挥生物效应。胰岛素样生长因子-1受体igf1r属受体酪氨酸激酶家族，位于细胞膜上，与igfs结合后发生二聚化，酪氨酸结构域得以靠近并引发自身磷酸化，随即激活胞内ras-raf-mapk、pi3k-pkb/akt等细胞增殖相关的信号通路。igf1r的活化对刺激肿瘤细胞的生长和存活至关重要。

24、表3显示了目前在研的以igf1r受体为靶点的药物的适应症情况。

25、表3在研以igf1r受体为靶点的药物信息

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27、简单来说，本公开根据已公开的胰岛素样生长因子-1受体igf1r的mrna序列bc113610.1作为靶标进行抗肿瘤反义寡核酸的设计，通过与genebank联机blast序列比对，所选择的靶序列具有很好的特异性，不会干扰人类其他正常基因的表达。对设计的若干反义寡核苷酸进行了全硫代修饰，以延长在体内的作用时间，并通过固相方法进行合成。

28、细胞增殖抑制实验结果显示，此系列全硫代反义寡核苷酸对肺癌细胞的抑制活性差别很大，在0.025～1.6μmol/l浓度范围内，s-asodn-1对人高转移肺癌细胞95d、人小细胞肺癌细胞nci-h4460、人低分化肺腺癌细胞glc-82、人肺腺癌细胞a549的细胞增殖抑制活性最高，与阳性对照药物顺铂相当，而s-asodn-2～5对这4种细胞基本无抑制作用。s-asodn-1在0.025μmol/l浓度即对95d、nci-h4460、glc-82、a549有抑制作用，s-asodn-1对这4种细胞的抑制率在0.4μmol/l时分别为57.45％、69.26％、65.62％和47.78％，在0.8μmol/l时分别为70.32％、78.13％、72.56％和78.34％，在1.6μmol/l时分别可达80.86％、91.89％、81.10％和86.49％。人nci-h446肺癌细胞移植瘤模型生长抑制实验结果表明，s-asodn-1可以有效抑制nci-h446肺癌肿瘤生长，作用效果与阳性对照顺铂相当。

29、具体来说，本公开提供了如下技术方案：

30、一方面，本公开涉及治疗有效量的靶向igf1r基因的硫代反义寡核苷酸或其组合物在制备用于抑制肺癌细胞增殖和/或在患有肺癌的受试者中治疗肺癌的药物中的用途，所述靶向igf1r基因的硫代反义寡核苷酸的序列包含与seq id no:1所示序列(5’-tcctccggagccagacttca-3’)具有80％以上的核苷酸同一性的核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上的核苷酸同一性的核苷酸序列；更优选地，所述靶向igf1r基因的硫代反义寡核苷酸的序列如seq id no:1所示。

31、“治疗有效量”或“治疗有效剂量”为当给予患者时能改善疾病或症状的治疗剂的量或者剂量。“预防有效量”或“预防有效剂量”为当给予受试者时能预防疾病或症状的预防剂的量或者剂量。构成“治疗有效量”的治疗剂的量或“预防有效量”的预防剂的量随着治疗剂/预防剂、疾病状态及其严重性、待治疗/预防的患者/受试者的年龄、体重等而变化。本领域普通技术人员可根据其知识以及本公开常规地确定治疗有效量和预防有效量。

32、同理，构成“治疗有效剂量”的治疗剂的剂量或“预防有效剂量”的预防剂的剂量随着治疗剂/预防剂、疾病状态及其严重性、待治疗/预防的患者/受试者的年龄、体重等而变化。本领域普通技术人员可根据其知识以及本公开常规地确定治疗有效剂量和预防有效剂量。

33、术语“核苷酸同一性”是指两个核苷酸序列中相同的核苷酸数量占其中一个核苷酸序列中核苷酸数量的百分比，比如，序列1为5’-tcctccggagccagacttca-3’(20个核苷酸)，序列2为tcctccggagccagactt(18个核苷酸)，序列2与序列1具有90％的核苷酸同一性。

34、在一个优选的实施方案中，在本公开的硫代反义寡核苷酸或其组合物的用途中，所述靶向igf1r基因的硫代反义寡核苷酸还具有其他的化学修饰。

35、在一个优选的实施方案中，在本公开的硫代反义寡核苷酸或其组合物的用途中，所述其他的化学修饰选自以下的一种或多种：锁核酸修饰、2位甲氧乙基修饰和2位氧甲基修饰。

36、在一个优选的实施方案中，在本公开的硫代反义寡核苷酸或其组合物的用途中，所述组合物进一步包含至少一种另外的活性剂。

37、在一个优选的实施方案中，在本公开的硫代反义寡核苷酸或其组合物的用途中，所述至少一种另外的活性剂是治疗剂或非治疗剂，或治疗剂和非治疗剂的组合。

38、在一个优选的实施方案中，在本公开的硫代反义寡核苷酸或其组合物的用途中，所述至少一种另外的活性剂是治疗剂，其选自：abitrexate(甲氨蝶呤)、abraxane(紫杉醇白蛋白稳定的纳米颗粒制剂)、二马来酸阿法替尼、爱宁达(培美曲塞二钠)、阿瓦斯丁(贝伐单抗)、贝伐单抗、卡铂、色瑞替尼、顺铂、克唑替尼、cyramza(雷莫芦单抗)、多西他赛、盐酸埃罗替尼、folexpfs(甲氨蝶呤)、吉非替尼、gilotrif(二马来酸阿法替尼)、盐酸吉西他滨、健择(盐酸吉西他滨)、易瑞沙(吉非替尼)、盐酸氮芥、甲氨蝶呤、甲氨蝶呤lpf(甲氨蝶呤)、mexate(甲氨蝶呤)、mexate-aq(甲氨蝶呤)、mustargen(盐酸氮芥)、诺维本(酒石酸长春瑞滨)、紫杉醇、紫杉醇白蛋白稳定的纳米颗粒制剂、paraplat(卡铂)、铂尔定(卡铂)、培美曲塞二钠、顺氯氨铂(顺铂)、顺氯氨铂-aq(顺铂)、雷莫芦单抗、特罗凯(盐酸埃罗替尼)、紫杉酚(紫杉醇)、泰索帝(多西他赛)、酒石酸长春瑞滨、赛可瑞(克唑替尼)、zykadia(色瑞替尼)、卡铂-紫杉酚、吉西他滨-顺铂、丝裂霉素、人参皂苷rg3、去甲斑蝥酸、参芪扶正、多柔比星、尼莫司汀、康艾、恩美曲妥珠单抗、斑蝥酸、氮芥、消癌平、清肺散结、米托蒽醌、艾迪、表柔比星、马蔺子素、鸦胆子油以及其组合。

39、在一个优选的实施方案中，在本公开的硫代反义寡核苷酸或其组合物的用途中，所述治疗剂是选自由以下组成的组的糖皮质激素：泼尼松、布地奈德、糠酸莫米松、丙酸氟替卡松、糠酸氟替卡松、及其组合。

40、在一个优选的实施方案中，在本公开的硫代反义寡核苷酸或其组合物的用途中，所述治疗剂是选自由以下组成的组的支气管扩张剂：白三烯调节剂、抗胆碱能支气管扩张剂、短效β2激动剂和长效β2激动剂以及其组合。

41、在一个优选的实施方案中，在本公开的硫代反义寡核苷酸或其组合物的用途中，所述治疗剂是镇痛剂。

42、在一个优选的实施方案中，在本公开的硫代反义寡核苷酸或其组合物的用途中，所述治疗剂是抗感染剂。

43、在一个优选的实施方案中，在本公开的硫代反义寡核苷酸或其组合物的用途中，所述至少一种另外的活性剂是非治疗剂。

44、在一个优选的实施方案中，在本公开的硫代反义寡核苷酸或其组合物的用途中，所述非治疗剂选自：止吐药、抗贫血药和抗黏膜炎药。

45、在一个优选的实施方案中，所述非治疗剂选自昂丹司琼、格拉司琼、多拉司琼和帕洛诺司琼。

46、在一个优选的实施方案中，在本公开的硫代反义寡核苷酸或其组合物的用途中，所述肺癌选自由以下组成的组：原发性肺癌、继发性肺癌、复发性肺癌、难治性肺癌以及其组合。

47、在一个优选的实施方案中，在本公开的硫代反义寡核苷酸或其组合物的用途中，所述肺癌选自小细胞肺癌和非小细胞肺癌。

48、在一个优选的实施方案中，在本公开的硫代反义寡核苷酸或其组合物的用途中，所述非小细胞肺癌选自肺腺癌、肺鳞癌和大细胞肺癌及其组合。

49、在一个优选的实施方案中，所述非小细胞肺癌所涉及的细胞为人高转移肺癌细胞95d、人小细胞肺癌细胞nci-h4460、人低分化肺腺癌细胞glc-82和人肺腺癌细胞a549及其组合。

50、在一个优选的实施方案中，在本公开的硫代反义寡核苷酸或其组合物的用途中，所述靶向igf1r基因的硫代反义寡核苷酸或其组合物被配制为冻干剂或者注射剂。

51、在一个优选的实施方案中，在本公开的硫代反义寡核苷酸或其组合物的用途中，所述靶向igf1r基因的硫代反义寡核苷酸或其组合物与一种或多种抗癌疗法组合施用。

52、在一个优选的实施方案中，在本公开的硫代反义寡核苷酸或其组合物的用途中，所述抗癌疗法为包括选自由静脉输注或口服化学疗法、免疫疗法、靶向疗法、激素疗法、肿瘤消融手术、用于切除部分或全部荷瘤器官的消融手术、根治性手术、放射疗法及其组合组成的组的一种疗法以及作为附加疗法的至少一个经吸入化学疗法。

53、根据本公开的靶向igf1r基因的硫代反义寡核苷酸或其组合物或者治疗组合依不同情况包括特定药物的药代动力学、药物动力学、给药模式、给药途径、受者的年龄、体重、肝肾功能状态、疾病的程度及治疗时限等，以适宜的剂量给药。

54、本公开所取得的有益效果至少如下：

55、本公开以胰岛素样生长因子-1受体igf1r的mrna序列为靶标，设计并合成出的全硫代反义寡核酸s-asodn-1具有良好的抑制人高转移肺癌细胞95d、人小细胞肺癌细胞nci-h4460、人低分化肺腺癌细胞glc-82、人肺腺癌细胞a549细胞株增殖活性。实验结果显示，此系列全硫代反义寡核苷酸对肺癌细胞的抑制活性差别很大，s-asodn-2～5对人高转移肺癌细胞95d、人小细胞肺癌细胞nci-h4460、人低分化肺腺癌细胞glc-82、人肺腺癌细胞a549基本无抑制作用，s-asodn-1活性最高，抑制效果与阳性对照药物顺铂相当。s-asodn-1对95d、nci-h4460、glc-82、a549细胞的抑制率在0.4μmol/l时57.45％、69.26％、65.62％和47.78％，在0.8μmol/l时分别为70.32％、78.13％、72.56％和78.34％，在1.6μmol/l时分别为80.86％、91.88％、81.10％和86.49％。人nci-h446肺癌细胞移植瘤模型生长抑制实验结果表明，s-asodn-1可以有效抑制nci-h446肺癌肿瘤生长，作用效果与阳性对照顺铂相当。