1.本发明涉及一种生物医用材料技术领域的方法，具体是一种细胞外囊泡装载中空金纳米球的制备方法，一种基于细胞外囊泡的仿生纳米肿瘤诊疗平台的制备方法，将中空金纳米球经聚乙二醇链修饰后，与细胞共孵育，收集细胞上清并分离提纯细胞外囊泡，获得细胞外囊泡装载的中空金纳米球，可用于肿瘤的光热治疗与成像。
背景技术：
2.一直以来，癌症是人类生命健康的主要威胁之一。根据世界卫生组织国际癌症研究机构（iarc）发布的2020年全球最新癌症负担数据，2020年，中国新发癌症病例457万例，其中男性248万例，女性209万例，癌症死亡病例300万例，其中男性182万例，女性118万例。临床的传统治疗方式如化疗、放疗存在一定的局限性，例如化疗中药物无法准确地递送到肿瘤部位且常伴随非特异性的细胞毒性，对正常细胞造成损害，导致一系列的不良反应。而放疗是局部的疗法，无法带来全身的治疗效果且副作用较大。这些都导致了肿瘤治疗的不彻底，副作用大等问题。此外，癌症的早期筛查诊断对提高患者生存率具有重要意义。
3.光介导的纳米诊疗学是一种新兴的非侵入式肿瘤诊疗策略，它将多重癌症检测与治疗实时监测结合，有望推动纳米医学领域走向真正的个性化医疗。金纳米材料作为一种典型的贵金属纳米诊疗平台近年来被广泛关注，一方面其可作为优良的光热转换材料实现肿瘤的光热治疗，且某些特殊结构如金纳米笼也可作为载体实现药物的靶向递送。另一方面金纳米材料也可作为ct成像、光声成像、光学相干断层扫描成像的对比剂。其优势在于：首先金是化学惰性材料，生物相容性好，毒性低，其次金纳米材料与光相互作用时能发生表面等离子共振效应，具有优良的光学性能，最后金纳米材料的制备工艺简单，易于修饰。
4.细胞外囊泡是细胞内发生并释放至外环境的小囊泡，具有生物膜结构。在维持细胞内稳态、分子跨膜运输、细胞间通讯等方面具有重要作用。外泌体表面锚定有供体细胞特定的膜蛋白且尺寸介于40-160 nm 之间，使得其具有可穿透生理屏障、逃避免疫系统清除、病变部位聚集能力强等特点，因此被寄希望成为下一代纳米递药系统。作为药物载体，细胞外囊泡显示出高效的细胞摄取和靶向归巢能力。
5.因此本发明将中空金纳米球负载于细胞外囊泡内，得到一种纳米肿瘤诊疗平台。利用细胞外囊泡安全无毒性且肿瘤靶向能力强的载体特性、 中空金纳米球光吸收特性，实现对肿瘤的诊疗一体化。
技术实现要素：
6.本发明目的在于提供一种细胞外囊泡装载中空金纳米球的制备方法。
7.本发明的再一目的在于：提供上述方法获得的产品。
8.本发明的又一目的在于：提供所述产品的应用。
9.本发明目的通过以下方案实现：一种细胞外囊泡装载中空金纳米球的制备方法，先使用钴模板法制备中空金纳米球，并使用巯基聚乙二醇修饰，接着，通过主动装载法将中
空金纳米球装载到细胞外囊泡中，至少包括下述步骤：（1）中空金纳米球制备：称取723mg-1.2g的柠檬酸三钠、52mg的氯化钴溶于1000ml的去离子水中，氩气鼓泡60min去除溶液中的溶解氧，在氩气保护、700rpm磁力搅拌下，加入新鲜配置的2.5ml1m的硼氢化钠，溶液由淡粉色变为棕色，说明钴纳米颗粒的形成，继续氩气鼓泡60min使硼氢化钠完全水解；在另一个三颈烧瓶中配置0.04mm-0.1mm的氯金酸溶液600ml，氩气鼓泡60min去除溶解氧，之后将800ml的钴纳米颗粒迅速加入至氯金酸溶液中，在氩气保护下静置15min使金离子充分在钴纳米颗粒表面生长，再将溶液置于空气中700rpm磁力搅拌去除钴模板，获得中空金纳米球，15000rpm离心3次，去离子水重悬备用；（2）peg修饰中空金纳米球：将peg
2000-sh与中空金纳米球共混，孵育过夜，离心去除未偶联的peg
2000
；（3）制备装载中空金纳米球的细胞外囊泡：将peg修饰的中空金纳米球溶解于无外泌体的培养基内配置成200μg/ml的溶液，并将其与细胞在37℃、5%co2中共孵育24h，提取细胞培养上清液，2500g下离心10min取上清，去除上清中残留的细胞以及细胞碎片；（4）纯化：从步骤（3）上清液中提取细胞外囊泡，获得装载中空金纳米球的细胞外囊泡，最后纯化外泌体，去除未经包裹的中空金纳米球，得到纯化后的装载中空金纳米球的细胞外囊泡。
10.其中，所述的中空金纳米球平均粒径在30-50nm之间。
11.所述的中空金纳米球溶液的紫外可见吸收光谱的吸收峰在650-850nm之间。
12.步骤（3）中，所述的细胞包括人或鼠的细胞系或原代细胞。
13.步骤（4）中，所述的细胞外囊泡的提取方法包括差速离心法、色谱法、超滤法、免疫磁珠法或peg沉淀法。
14.步骤（4）中，所述的细胞外囊泡提纯方法包括色谱法、密度梯度离心法、超滤法。
15.本发明通过钴模板法制备中空金纳米球，表面偶联巯基聚乙二醇修饰修饰，与细胞共孵育后分离细胞外囊泡，获得细胞外囊泡装载中空金纳米球。
16.本发明还提供了一种细胞外囊泡装载中空金纳米球产品，是依据上述制备方法得到的。
17.本发明也提供了一种细胞外囊泡装载中空金纳米球产品在基于细胞外囊泡的纳米肿瘤诊疗平台中的应用，以满足临床需求的新型纳米诊疗平台。该纳米诊疗平台可通过细胞外囊泡的归巢效应实现在肿瘤组织中的特异性积累，此外，包裹在囊泡内的中空金纳米球在光的激发下能产生热能消融肿瘤细胞以及产生一系列光学特性用于肿瘤检测，实现对肿瘤的诊疗一体化。
18.本发明的优点在于：（1）细胞外囊泡的膜表面含整合素等受体，装载纳米球后可显著改变其生物分布，提高其在肿瘤组织中的积累。
19.（2）细胞外囊泡的包裹使金纳米球的生物相容性显著提高。
具体实施方式
20.以下实施例以发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操
作过程，但本发明的保护范围并不限于下述的实施例。
21.实施例1一种细胞外囊泡装载中空金纳米球，先使用钴模板法制备中空金纳米球，并使用巯基聚乙二醇修饰，接着，通过主动装载法将中空金纳米球装载到细胞外囊泡中，其中，按下述步骤制备：（1）中空金纳米球制备：称取723 mg的柠檬酸三钠、52 mg的氯化钴溶于1000 ml的去离子水中，氩气鼓泡60 min 去除溶液中的溶解氧，在氩气保护、700 rpm磁力搅拌下，加入新鲜配置的2.5 ml 1m的硼氢化钠，当溶液由淡粉色变为棕色，说明钴纳米颗粒的形成，继续氩气鼓泡60 min 使硼氢化钠完全水解；在另一个三颈烧瓶中配置0.04 mmol的氯金酸溶液600 ml，氩气鼓泡60 min去除溶解氧；之后，将800 ml的钴纳米颗粒迅速加入至氯金酸溶液中，在氩气保护下静置15 min使金离子充分在钴纳米颗粒表面生长，再将溶液置于空气中700 rpm磁力搅拌去除钴模板，获得中空金纳米球，15000 rpm离心3次，去离子水重悬备用；（2）巯基聚乙二醇（peg
2000-sh）修饰中空金纳米球：将peg
2000-sh与中空金纳米球共混，孵育过夜，离心去除未偶联的peg
2000
；3）制备装载中空金纳米球的细胞外囊泡：将peg修饰的中空金纳米球溶解于无外泌体的培养基内配置成200 μg/ml 的溶液，并将其与人结肠癌细胞系hct116细胞在37℃、5% co2中共孵育24 h，提取细胞培养上清液，2500g下离心10min取上清，去除上清中残留的细胞以及细胞碎片；（4）纯化：用qev尺寸色谱排阻柱提取细胞外囊泡，获得装载中空金纳米球的细胞外囊泡，最后使用密度梯度离心纯化细胞外囊泡，去除未经包裹的中空金纳米球，得到纯化后的装载中空金纳米球的细胞外囊泡。
22.其中，所述的中空金纳米球平均粒径在30-50 nm之间。中空金纳米球溶液的紫外可见吸收光谱的吸收峰在650-850 nm之间。
23.本实施例开发了一种基于细胞外囊泡的纳米肿瘤诊疗平台，是一种可满足临床需求的新型纳米诊疗平台。该纳米诊疗平台可通过细胞外囊泡的归巢效应实现在肿瘤组织中的特异性积累，此外，包裹在囊泡内的中空金纳米球在光的激发下能产生热能消融肿瘤细胞以及产生一系列光学特性用于肿瘤检测，实现对肿瘤的诊疗一体化。
24.其细胞外囊泡的膜表面含整合素等受体，装载中空纳米球后可显著改变其生物分布，提高其在肿瘤组织中的积累。而且，细胞外囊泡的包裹使金纳米球的生物相容性显著提高。
25.实施例2一种细胞外囊泡装载中空金纳米球，与实施例1步骤近似，按下述步骤制备：（1）中空金纳米球制备：称取1.2 g的柠檬酸三钠、52 mg的氯化钴溶于1000 ml的去离子水中，氩气鼓泡60 min 去除溶液中的溶解氧，在氩气保护、700 rpm磁力搅拌下，加入新鲜配置的2.5 ml 1m的硼氢化钠，溶液由淡粉色变为棕色，说明钴纳米颗粒的形成，继续氩气鼓泡60 min 使硼氢化钠完全水解；在另一个三颈烧瓶中配置0.1mm的氯金酸溶液600 ml，氩气鼓泡60 min去除溶解氧；之后，将800 ml的钴纳米颗粒迅速加入至氯金酸溶液中，在氩气保护下静置15 min使金离子充分在钴纳米颗粒表面生长，再将溶液置于空气中
700 rpm磁力搅拌去除钴模板，获得中空金纳米球，15000 rpm离心3次，去离子水重悬备用；（2）peg
2000-sh修饰中空金纳米球：将peg
2000-sh与中空金纳米球共混，孵育过夜，离心去除未偶联的peg
2000
；（3）制备装载中空金纳米球的细胞外囊泡：将peg修饰的中空金纳米球溶解于无外泌体的培养基内配置成200 μg/ml 的溶液，并将其与人卵巢癌细胞系skov-3细胞在37℃、5% co2中共孵育24 h，提取细胞培养上清液，2500g下离心10min取上清，去除上清中残留的细胞以及细胞碎片；（4）纯化：对步骤（3）的上清液使用15000g离心提取细胞外囊泡，获得装载中空金纳米球的细胞外囊泡，最后使用密度梯度离心纯化细胞外囊泡，去除未经包裹的中空金纳米球，得到纯化后的装载中空金纳米球的细胞外囊泡。
26.实施例3一种细胞外囊泡装载中空金纳米球，与实施例1步骤近似，按下述步骤制备：（1）中空金纳米球制备：称取723 mg的柠檬酸三钠、52 mg的氯化钴溶于1000 ml的去离子水中，氩气鼓泡60 min 去除溶液中的溶解氧；在氩气保护、700 rpm磁力搅拌下，加入新鲜配置的2.5 ml 1m的硼氢化钠，溶液由淡粉色变为棕色，说明钴纳米颗粒的形成，继续氩气鼓泡60 min 使硼氢化钠完全水解；在另一个三颈烧瓶中配置0.04 mm的氯金酸溶液600 ml，氩气鼓泡60 min去除溶解氧；之后，将800 ml的钴纳米颗粒迅速加入至氯金酸溶液中，在氩气保护下静置15 min使金离子充分在钴纳米颗粒表面生长，再将溶液置于空气中700 rpm磁力搅拌去除钴模板，获得中空金纳米球，15000 rpm离心3次，去离子水重悬备用；（2）peg
2000-sh修饰中空金纳米球：将peg
2000-sh与中空金纳米球共混，孵育过夜，离心去除未偶联的peg
2000
；（3）制备装载中空金纳米球的细胞外囊泡：将peg修饰的中空金纳米球溶解于无外泌体的培养基内配置成200 μg/ml 的溶液，并将其与人卵巢癌细胞系skov-3细胞在37℃、5% co2中共孵育24 h，提取细胞培养上清液，2500g下离心10min取上清，去除上清中残留的细胞以及细胞碎片；（4）纯化：对步骤（3）的上清液使用15000g离心提取细胞外囊泡，获得装载中空金纳米球的细胞外囊泡，最后使用尺寸排阻色谱柱纯化细胞外囊泡，去除未经包裹的中空金纳米球，得到纯化后的装载中空金纳米球的细胞外囊泡。
27.实施例4一种细胞外囊泡装载中空金纳米球，与实施例1步骤近似，按下述步骤制备：（1）中空金纳米球制备：称取1.2 g的柠檬酸三钠、52 mg的氯化钴溶于1000 ml的去离子水中，氩气鼓泡60 min 去除溶液中的溶解氧；在氩气保护、700 rpm磁力搅拌下，加入新鲜配置的2.5 ml 1m的硼氢化钠，溶液由淡粉色变为棕色，说明钴纳米颗粒的形成，继续氩气鼓泡60 min 使硼氢化钠完全水解；在另一个三颈烧瓶中配置0.1 mm的氯金酸溶液600 ml，氩气鼓泡60 min去除溶解氧；之后，将800 ml的钴纳米颗粒迅速加入至氯金酸溶液中，在氩气保护下静置15 min使金离子充分在钴纳米颗粒表面生长，再将溶液置于空气中700 rpm磁力搅拌去除钴模板，获得中空金纳米球；15000 rpm离心3次，去离子水重悬备用；（2）peg
2000-sh修饰中空金纳米球：将peg2000-sh与中空金纳米球共混，孵育过夜，离心去除未偶联的peg
2000
；
（3）制备装载中空金纳米球的细胞外囊泡：将peg修饰的中空金纳米球溶解于培养基内配置成200 μg/ml 的溶液，并将其与小鼠间充质干细胞共孵育（37℃，5% co2）24 h；提取细胞培养上清，2500 g 下离心10 min 取上清，去除上清中残留的细胞以及细胞碎片；（4）纯化：再对步骤（3）上清液使用15000g离心提取细胞外囊泡，获得装载中空金纳米球的细胞外囊泡；最后，使用尺寸排阻色谱柱纯化细胞外囊泡，去除未经包裹的中空金纳米球。
28.实施例5一种细胞外囊泡装载中空金纳米球，与实施例1步骤近似，按下述步骤制备：（1）中空金纳米球制备：称取723 mg的柠檬酸三钠、52 mg的氯化钴溶于1000 ml的去离子水中，氩气鼓泡60 min 去除溶液中的溶解氧；在氩气保护、700 rpm磁力搅拌下，加入新鲜配置的2.5 ml 1m的硼氢化钠，溶液由淡粉色变为棕色，说明钴纳米颗粒的形成，继续氩气鼓泡60 min 使硼氢化钠完全水解；在另一个三颈烧瓶中配置0.04 mm的氯金酸溶液600 ml，氩气鼓泡60 min去除溶解氧；之后，将800 ml的钴纳米颗粒迅速加入至氯金酸溶液中，在氩气保护下静置15 min使金离子充分在钴纳米颗粒表面生长，再将溶液置于空气中700 rpm磁力搅拌去除钴模板，获得中空金纳米球；15000 rpm离心3次，去离子水重悬备用；（2）peg
2000-sh修饰中空金纳米球：将peg
2000-sh与中空金纳米球共混，孵育过夜，离心去除未偶联的peg
2000
；（3）制备装载中空金纳米球的细胞外囊泡：将peg修饰的中空金纳米球溶解于培养基内配置成200 μg/ml 的溶液，并将其与小鼠巨噬细胞系raw267.4共孵育（37℃，5% co2）24 h；提取细胞培养上清，2500 g 下离心10 min 取上清，去除上清中残留的细胞以及细胞碎片；纯化：再使用尺寸色谱排阻柱提取细胞外囊泡，获得装载中空金纳米球的细胞外囊泡。最后使用密度梯度离心纯化细胞外囊泡，去除未经包裹的中空金纳米球。