卡莫氟在制备调节肠道菌群改善肠道屏障的药物中的应用

1.本发明涉及医药技术领域，具体涉及卡莫氟在制备调节肠道菌群改善肠道屏障的药物中的应用。


背景技术：

2.肠道屏障是指肠道能够防止肠内的有害物质如细菌和毒素穿过肠粘膜进入人体内其他组织、器官和血液循环的结构和功能的总和，包括:肠粘膜上皮、肠粘液、肠道菌群、分泌性免疫球蛋白、肠道相关淋巴组织、胆盐、激素和胃酸等。正常情况下，肠粘膜上皮提供保护防止病原菌和共生菌的屏障从肠腔逃逸和激活全身免疫系统。
3.现有研究人类和啮齿动物的代谢性疾病模型中，发现肠道屏障受损引起的低级别炎症，特别是内毒素血症(即血浆中相对大量的肠道微生物来源的脂多糖)已被确定为与肥胖相关的代谢性疾病(例如胰岛素抵抗，2型糖尿病等)的发病和进展的一个重要因素。饮食中高脂肪含量和肠道屏障功能的改变被认为是内毒素血症的重要因素。肠道屏障可以隔离肠道内容物中各种细菌或病毒病原体；许多病原体通过产生毒素从而破坏肠道菌群或导致肠粘膜上皮细胞功能异常增加影响肠道屏障的通透性。糖尿病状态下代谢改变引起肠道微环境的变化会导致肠道微生物组改变，从而增加肠道致病性菌的定值。常见的致病性大肠杆菌有肠致病性大肠杆菌(epec)、肠产毒性大肠杆菌(etec)、肠侵袭性大肠杆菌(eiec)、肠出血性大肠杆菌(ehec)、肠黏附性大肠杆菌(eaec)和弥散粘附性大肠杆菌(daec)，它们在宿主上皮细胞定植时形成病变，被称为附着和抹去(ae)病原体。而epec、ehec通过紧密附着在肠道细胞上并分泌细菌效应物来操纵宿主细胞过程，引起肠道内容物中的毒力因子表达增加，会导致肠道上皮屏障功能的完整性受损，加重糖尿病的发生发展。由此可知，可以尝试从抑制糖尿病肠道微生物毒力因子的表达改善肠道屏障，作为治疗糖尿病的新靶点。
4.现有技术中对肠道屏障的治疗包括：(1)药物治疗增加肠道上皮细胞功能上调屏障蛋白表达；(2)粪便移植和益生菌的添加改变肠道菌群组成。但是均存在如下缺陷：一是药物治疗需长期服药有一定的副作用；二是粪便移植治疗伴随着肠道感染的风险且治疗过程繁琐；(3)益生菌治疗法无法靶向改善肠道病原体的致病性治疗效果局限。卡莫氟，英文名称：carmofur，中文别名：密福禄，英文别名：miforol、yamfur，cas号：61422-45-5，分子式为c
11h16
fn3o3，分子量为257.26，化学结构式为：卡莫氟是嘧啶的281类似物，衍生自5-氟尿嘧啶。现有技术中，carmofur可靶向胸苷酸合酶(thymidylate synthase,ts)的活性，可以抑制细胞增殖和抑制细胞内神经酰胺酶，常作为治疗结直肠癌的抗肿瘤剂。
5.但是目前，尚未有关卡莫氟(carmofur)抑制肠道菌群致病菌毒力因子表达，改善肠道屏障受损，治疗2型治疗糖尿病等代谢性疾病的报道。鉴于此，有必要提供一种新的调节肠道菌群改善肠道屏障的药物，以解决现有技术的不足。


技术实现要素：

6.本发明所要解决的技术问题是提供卡莫氟在制备调节肠道菌群改善肠道屏障的药物中的应用。目的是开辟卡莫氟新的应用领域，开辟新的糖尿病治疗药物。
7.本发明解决上述技术问题的技术方案如下：卡莫氟在制备调节肠道菌群改善肠道屏障的药物中的应用。
8.本发明分别进行了如下研究试验：
9.1)进行了卡莫氟小鼠灌胃试验，得出的试验结论是：卡莫氟可抑制糖尿病小鼠肠道中致病菌的毒力因子表达。
10.2)进行了肠道屏障检测试验，得出的试验结论是：卡莫氟可抑制糖尿病小鼠肠道中致病菌的毒力因子表达，改善糖尿病小鼠肠道屏障功能。
11.3)进行了糖尿病小鼠糖耐量试验，得出的试验结论是：卡莫氟可抑制糖尿病小鼠肠道中致病菌的毒力因子表达，改善糖尿病小鼠肠道屏障功能，可改善糖尿病小鼠的血糖值和糖耐受。
12.4)进行了肠道菌群qpcr试验，得出的试验结论是：莫氟可抑制糖尿病小鼠肠道中致病菌的毒力因子表达，通过减低肠道中致病菌的定植，恢复糖尿病小鼠肠道微生物群，同时增加肠道屏障连接蛋白的mrna表达。
13.本发明经过研究发现，卡莫氟能用于制备调节肠道菌群改善肠道屏障药物，可以特异性抑制肠道菌群中致病菌的毒力因子，恢复肠道屏障功能，并且可以减少内毒素血症、慢性炎症等的产生，达到治疗糖尿病的效果，此外还可抑制肠道致病菌的定植，恢复糖尿病正常的肠道菌群。既开辟了卡莫氟新的应用领域，也开辟了新的糖尿病治疗药物，具有积极的药学价值和广泛的社会意义。
14.进一步，所述药物抑制肠道菌群中的致病性菌的毒力因子。
15.进一步，所述药物抑制肥胖相关的代谢性疾病中的肠道菌群中的致病性菌的毒力因子。
16.进一步，所述肥胖相关的代谢性疾病包括胰岛素抵抗病或2型糖尿病。
17.进一步，所述肠道菌群中的致病性菌包括肠致病性大肠杆菌(epec)、肠产毒性大肠杆菌(etec)、肠侵袭性大肠杆菌(eiec)、肠出血性大肠杆菌(ehec)、肠黏附性大肠杆菌(eaec)和弥散粘附性大肠杆菌(daec)中的一种或多种。
18.本发明的另一个目的是提供一种调节肠道菌群改善肠道屏障的药物组合物，所述药物组合物包括卡莫氟。所述药物中卡莫氟的剂量质量分数为5～12％。
19.采用上述进一步的有益效果是：本发明经过试验发现，在调节肠道菌群改善肠道屏障的药物中，卡莫氟采用上述剂量，可以达到较佳的药效。
20.进一步，所述调节肠道菌群改善肠道屏障的药物中卡莫氟的剂量质量分数为8～10％。
21.采用上述进一步的有益效果是：本发明经过试验发现，在调节肠道菌群改善肠道屏障的药物中，卡莫氟采用上述剂量，可以达到最佳的药效。
22.进一步，所述药物中包括卡莫氟和药学上可接受的载体。
23.采用上述进一步的有益效果是：卡莫氟作为有效成分，具有良好的调节肠道菌群改善肠道屏障的活性，可以和药学上可接受的载体一起，制成调节肠道菌群改善肠道屏障，
用于抑制肠道菌群中的致病性菌的毒力因子。
24.进一步，所述载体为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂和润滑剂中的任意一种或两种以上的混合物。
25.采用上述进一步的有益效果是：上述种类的载体，有利于药物释放、提高用药量准确性，增加药用的稳定性。
26.进一步，所述药物制剂的剂型为口服剂、膏剂、糊剂、涂剂、凝胶剂、胶囊剂和喷雾剂中的任意一种。
27.采用上述进一步的有益效果是：本发明的调节肠道菌群改善肠道屏障的药物可以制成多种剂型，适用于多种给药途径，更方便不同的病患者使用。
附图说明
28.图1为本发明t3ss的eae相对表达变化图；
29.图2为本发明t3ss的eaea相对表达变化图；
30.图3为本发明t3ss的ler相对表达变化图；
31.图4为本发明葡萄聚糖渗透性图；
32.图5为本发明乳果糖甘露醇比值图；
33.图6为本发明糖尿病小鼠、糖尿病小鼠灌柠檬酸杆菌及糖尿病小鼠灌柠檬酸杆菌加药免疫荧光染色对照图；
34.图7为本发明小鼠周龄与血糖值关系图；
35.图8为本发明测血糖时间与血糖值关系图；
36.图9为本发明闭合蛋白相对表达量图；
37.图10为本发明闭锁链接蛋白相对表达量图；
38.图11为本发明封闭蛋白相对表达量图；
39.图12为本发明肠道菌群柠檬酸杆菌相对丰度图。
具体实施方式
40.以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下列实施例中所用的方法如无特别说明均是常规的实验方法。所述试剂和生物材料，如无特别的说明，均可从商业途径获得。
41.实施例
42.1.实验材料和方法
43.1.1构建t2d小鼠模型
44.选取c57bl/6小鼠(4周龄)(购买于赛业模式生物研究中心有限公司)，在5周龄时，c57bl/6小鼠被喂食hfd(60％的卡路里，其来自脂肪)。在hfd喂养3周时，给小鼠注射每天40mg/kg链脲佐菌素(stz，sigma-aldrich,st.louis,mo,usa)连续3天，以生成t2d小鼠模型30只。
45.1.2分组和治疗
46.通过口服管饲法灌胃上述生成的t2d小鼠30只，分成三组，分别为糖尿病小鼠组、糖尿病小鼠柠檬酸杆菌灌胃组、糖尿病小鼠柠檬酸杆菌灌胃加卡莫氟治疗组。首先选取10
只t2d小鼠模型，将含有约2.5
×
108鼠类柠檬酸杆菌(c.rodentium)的luria肉汤用0.1ml过夜细菌培养物感染小鼠一周。然后一组选取10只t2d小鼠模型，将含有约2.5
×
108鼠类柠檬酸杆菌(c.rodentium)的luria肉汤用0.1ml过夜细菌培养物感染小鼠，一周后小鼠给予卡莫氟灌胃治疗两周。然后，收集被感染的小鼠肠道组织(包括粪便)，统计柠檬酸杆菌数目。
47.1.3致病菌的毒力因子表达检测
48.对1.2部分的实验组和对照组，连续治疗两周后，通过收集小鼠粪便检测治疗组和对照组糖尿病小鼠肠道中致病菌的毒力因子表达。
49.1.4肠道屏障功能检测
50.对1.2部分的三组分别为糖尿病小鼠组、糖尿病小鼠柠檬酸杆菌灌胃组、糖尿病小鼠柠檬酸杆菌灌胃加卡莫氟治疗组，连续治疗两周后检测肠道屏障功能，进行fitc-葡聚糖测定。通过口服管饲法将pbs中的0.15ml 80g/lfitc-葡聚糖(fd4；sigma-aldrich，oakville，on，canada)灌胃小鼠，在2小时(灌肠)或4小时(口服管饲法)后，收集血清并用荧光计测量。小鼠被禁食4小时后，灌胃0.2ml含有100mg蔗糖的10ml糖探针后，12mg乳果糖、8毫克甘露醇和6毫克三氯蔗糖。关在代谢笼中收集尿液，检测尿液中乳果糖和甘露醇的比值。此外通过收集小鼠肠道组织进行切片，对肠道组织中紧密连接蛋白进行免疫荧光染色。
51.1.5糖尿病的严重程度评估
52.对1.2部分的三组分别为糖尿病小鼠组、糖尿病小鼠柠檬酸杆菌灌胃组、糖尿病小鼠柠檬酸杆菌灌胃加卡莫氟治疗组，测量糖t2d小鼠每周的空腹血糖值。我们利用糖耐量实验评估小鼠糖尿病的严重情况，具体为使小鼠禁食12小时后给予小鼠腹腔注射2g/kg葡萄糖溶液，在0分钟、30分钟、60分钟和120分钟。分别检测血糖值并绘制了血糖变化的曲线。
53.1.6mrna表达情况检测
54.通过收集三组分别为糖尿病小鼠组、糖尿病小鼠柠檬酸杆菌灌胃组、糖尿病小鼠柠檬酸杆菌灌胃加卡莫氟治疗组小鼠的粪便，提取粪便dna，利用qpcr技术检测肠道菌群中柠檬酸杆菌丰度，同时收集肠道组织，并提取肠道rna，后通过qpcr技术检测三组小鼠肠道屏障功能蛋白的mrna表达情况。
55.2.结果
56.2.1致病菌的毒力因子表达检测
57.进行了卡莫氟小鼠灌胃试验，根据图1至3，可知与对照组相比，在加入卡莫氟后三型分泌系统代表性基因eae、espa、ler的mrna表达显著下调，此外随着加入卡莫氟的药物浓度增加，三型分泌系统代表性基因eae、espa、ler的mrna表达随着药物浓度的增加表达进一步下调。由此可知，卡莫氟可抑制糖尿病小鼠肠道中致病菌的毒力因子表达。
58.2.2肠道屏障检测试验
59.进行了肠道屏障检测试验，根据图4至6，对糖尿病小鼠组、糖尿病小鼠柠檬酸杆菌灌胃组、糖尿病小鼠柠檬酸杆菌灌胃加卡莫氟治疗组，通过口服管饲法将pbs中的0.15ml 80g/l fitc-葡聚糖(fd4；sigma-aldrich，oakville，on，canada)灌胃小鼠，在2小时(灌肠)或4小时(口服管饲法)后，收集血清并用荧光计测量，发现糖尿病小鼠柠檬酸杆菌灌胃组相比于糖尿病小鼠组的fitc-葡聚糖渗透性显著增加，相反糖尿病小鼠柠檬酸杆菌灌胃加卡莫氟治疗组中fitc-葡聚糖渗透性显著恢复。另外三组小鼠被禁食4小时后，灌胃0.2ml含有100mg蔗糖的10ml糖探针后，12mg乳果糖、8毫克甘露醇和6毫克三氯蔗糖。关在代谢笼中收
集尿液，检测尿液中乳果糖和甘露醇的比值。发现糖尿病小鼠柠檬酸杆菌灌胃组相比于糖尿病小鼠组的尿液中乳果糖和甘露醇的比值显著增加，相反糖尿病小鼠柠檬酸杆菌灌胃加卡莫氟治疗组中尿液中乳果糖和甘露醇的比值显著恢复。此外通过收集小鼠肠道组织进行切片，对肠道组织中紧密连接蛋白进行免疫荧光染色。发现糖尿病小鼠柠檬酸杆菌灌胃组相比于糖尿病小鼠组肠道的闭锁蛋白-1表达显著减低，相反糖尿病小鼠柠檬酸杆菌灌胃加卡莫氟治疗组肠道的闭锁蛋白-1表达显著恢复。得出的试验结论是：卡莫氟可抑制糖尿病小鼠肠道中致病菌的毒力因子表达，改善糖尿病小鼠肠道屏障功能。
60.2.3糖尿病的严重程度评估
61.进行了糖尿病小鼠糖耐量试验，根据图7和8，可知对糖尿病小鼠组、糖尿病小鼠柠檬酸杆菌灌胃组、糖尿病小鼠柠檬酸杆菌灌胃加卡莫氟治疗组，测量糖t2d小鼠每周的空腹血糖值，发现构建的t2d小鼠模型在进行柠檬酸杆菌灌胃后小鼠血糖值显著增加，而加入药物干预柠檬酸杆菌功能后糖尿病小鼠血糖未显著增加。此外，对三组使小鼠禁食12小时后给予小鼠腹腔注射2g/kg葡萄糖溶液，在0分钟、30分钟、60分钟和120分钟。分别检测血糖值并绘制了血糖变化的曲线。发现构建的t2d小鼠模型在进行柠檬酸杆菌灌胃后小鼠糖耐量显著减低，而加入药物干预柠檬酸杆菌功能后糖尿病小鼠糖耐量恢复。得出的试验结论是：卡莫氟可抑制糖尿病小鼠肠道中致病菌的毒力因子表达，改善糖尿病小鼠肠道屏障功能，可改善糖尿病小鼠的血糖值和糖耐受。
62.2.4 mrna表达情况检测
63.进行了肠道菌群qpcr试验，根据图9至12，可知通过收集糖尿病小鼠组、糖尿病小鼠柠檬酸杆菌灌胃组、糖尿病小鼠柠檬酸杆菌灌胃加卡莫氟治疗组小鼠的粪便，提取粪便dna，利用qpcr技术检测肠道菌群中柠檬酸杆菌丰度，发现糖尿病小鼠柠檬酸杆菌灌胃组中柠檬酸杆菌定植显著增加，相反在糖尿病小鼠柠檬酸杆菌灌胃加卡莫氟治疗组中柠檬酸杆菌定植减少。同时收集肠道组织，并提取肠道rna，后通过qpcr技术检测三组小鼠肠道屏障功能蛋白的mrna表达情况，发现在糖尿病小鼠柠檬酸杆菌灌胃组中肠道的闭锁连接蛋白、封闭蛋白的mrna表达显著减低，相反在糖尿病小鼠柠檬酸杆菌灌胃加卡莫氟治疗组中肠道的闭锁连接蛋白、封闭蛋白的mrna表达得到恢复。得出的试验结论是：莫氟可抑制糖尿病小鼠肠道中致病菌的毒力因子表达，通过减低肠道中致病菌的定植，恢复糖尿病小鼠肠道微生物群，同时增加肠道屏障连接蛋白的mrna表达。
64.综上所述，本发明经过研究发现，卡莫氟能用于制备调节肠道菌群改善肠道屏障药物，可以特异性抑制肠道菌群中致病菌的毒力因子，恢复肠道屏障功能，并且可以减少内毒素血症、慢性炎症等的产生，达到治疗糖尿病的效果，此外还可抑制肠道致病菌的定植，恢复糖尿病正常的肠道菌群。既开辟了卡莫氟新的应用领域，也开辟了新的糖尿病治疗药物，具有积极的药学价值和广泛的社会意义。
65.尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。