一种基于黑色素瘤细胞膜的纳米疫苗及其制备方法和应用

1.本发明涉及疫苗的制备方法和应用，特别是一种基于黑色素瘤细胞膜的纳米疫苗及其制备方法和应用。


背景技术：

2.黑色素瘤是一种常发于皮肤，并能产生黑色素的恶性肿瘤，具有高致死率、高侵袭和高转移等典型特性。手术是当前恶性黑色素瘤的主要治疗方式，而放化疗在术后辅助治疗方面效果并不佳。由于黑色素瘤对免疫反应敏感，因此其免疫治疗一直是近年来的研究热点。然而，疫苗作为免疫治疗领域的重要分支，在黑色素瘤中研究甚少。
3.肿瘤疫苗的主要机制是诱导肿瘤抗原特异性t细胞的增殖和活化，进而杀伤肿瘤细胞。若要实现抗原特异性t细胞的激活，树突状细胞和巨噬细胞等免疫细胞在提呈肿瘤相关抗原的同时也要处于活化状态。若要达到此种状态，这些抗原提呈细胞需同时接触疫苗的抗原和佐剂，也即是抗原和佐剂需共定位在同一个颗粒上。因此，如何实现抗原和佐剂的稳定整合是目前提高肿瘤疫苗效果的关键所在。


技术实现要素：

4.发明目的：本发明目的是提供一种基于黑色素瘤细胞膜的纳米疫苗及其制备方法和应用。
5.该方法构建一种黑色素瘤细胞膜和细菌外泌体组成的融合膜系统，并在其表面修饰peg和甘露糖，从而对黑色素瘤的发生起到一定的预防作用。
6.技术方案：所述基于黑色素瘤细胞膜的纳米疫苗，包括黑色素瘤细胞膜、大肠杆菌外泌体和修饰剂dspe-peg-mannose。
7.所述的基于黑色素瘤细胞膜的纳米疫苗制备方法，包括以下步骤：
8.1)提取黑色素瘤细胞膜；
9.2)提取大肠杆菌外泌体；
10.3)合成dspe-peg-mannose；
11.4)将所述步骤1)、2)和3)制成仿生纳米疫苗。
12.进一步地，所述步骤1)和2)中黑色素瘤细胞膜和大肠杆菌外泌体的提取方法均采用超速离心法。
13.进一步地，所述步骤3)中dspe-peg-mannose的合成原料包括：将5mg dspe-peg2000-nh2与1mg mannose-nhs溶于dmso中，透析，然后将保留液进行冷冻干燥，最终得到dspe-peg-mannose。
14.进一步地，所述步骤4)中仿生纳米疫苗的制备步骤包括：将黑色素瘤细胞膜、大肠杆菌外泌体和dspe-peg-mannose在pbs里充分混合均匀；用脂质体挤出器对混合物进行挤压，并依次经过400nm、200nm、100nm和50nm的聚碳酸酯膜；透析并收集保留液，调整总蛋白终浓度，过滤除菌，加入青链霉素，即可。
15.基于黑色素瘤细胞膜的纳米疫苗在制备抗肿瘤药物中的用途。
16.本发明所述肿瘤疫苗包括黑色素瘤细胞膜、大肠杆菌外泌体和修饰剂dspe-peg-mannose，其中肿瘤细胞膜包含多种肿瘤特异性抗原，可诱导出多种肿瘤抗原特异性t细胞的增殖和活化，从而增强抗肿瘤效果；细菌外泌体含脂多糖、脂蛋白和糖蛋白等免疫刺激性物质，是有效的生物性佐剂。利用脂质体挤出器将细胞膜和细菌外泌体进行膜融合，并在其表面修饰peg和甘露糖以增强其稳定性，靶向免疫细胞并刺激其至成熟状态以引发抗肿瘤免疫应答。本发明所涉及的仿生纳米疫苗均为非无机材料所组成，尺寸小且具有生物可降解性；制备方法简单，靶向性强，能够激发特异性免疫和非特异性免疫，为发展个性化肿瘤疫苗奠定基础。
17.肿瘤细胞膜包含多种肿瘤特异性抗原，可诱导出多种肿瘤抗原特异性t细胞的增殖和活化，从而增强抗肿瘤效果。而细菌外泌体是由细菌自然衍生而来，表面含有多种具有lps、脂蛋白和糖蛋白等免疫刺激性病原相关分子模式，是一种有效的生物性佐剂。另外，细菌外泌体含有较少的细菌细胞壁刚性结构成分，在与肿瘤细胞膜进行挤出器挤压时容易发生融合或被包埋。本发明还在这个混合膜的表面作peg和甘露糖修饰，使之增强稳定性和免疫细胞靶向性。因此，开发这种基于黑色素瘤细胞膜的纳米疫苗是可行且有意义的。
18.有益效果：本发明与现有技术相比，具有如下优势：
19.1、本发明的仿生纳米疫苗抗原和佐剂共定位在同一个纳米颗粒上，有利于肿瘤抗原的摄取和呈递。
20.2、本发明的仿生纳米疫苗表面作peg和甘露糖修饰，有利于疫苗的长期稳定和免疫细胞靶向性。
21.3、本发明的仿生纳米疫苗尺寸小，有利于疫苗向淋巴结位置迁移。
22.4、本发明的仿生纳米疫苗在制作过程方面可操作性强，对于适合免疫治疗和抗原特异性强的多种肿瘤，参考本发明均可制成相应的肿瘤疫苗。
23.5、本发明的仿生纳米疫苗在临床上具有一定的应用前景。在手术切除患者的肿瘤后，提取自身肿瘤组织的细胞膜后可参考本发明可制成个性化肿瘤疫苗，待患者术后恢复到一定程度后可与临床上的免疫治疗剂开展联合治疗。
附图说明
24.图1是仿生纳米疫苗的透射电镜图；
25.图2是在小鼠腹股沟附近皮下注射三针仿生纳米疫苗期间的小鼠体重变化曲线图；
26.图3是第21天(注射第三针仿生纳米疫苗后的第七天)小鼠心、肝、肺、肾、大脑皮质、淋巴结和肾脏的he染色结果图；
27.图4是荷瘤后的小鼠体重变化曲线图；
28.图5是荷瘤后的小鼠肿瘤体积变化曲线图；
29.图6是剥离后的肿瘤形态图；
30.图7是剥离后的肿瘤重量统计图。
具体实施方式
31.实施例一 本实施例的基于黑色素瘤细胞膜的纳米疫苗制备方法，包括如下步骤：
32.1、黑色素瘤细胞膜的提取
33.用预冷的pbs洗涤1次培养瓶中的贴壁细胞。
34.用含2mm edta的预冷pbs消化细胞20min，使细胞脱壁。
35.以7min，680
×
g转速离心收集细胞，弃上清液。
36.用pbs重悬细胞并以7min，680
×
g转速离心收集细胞，弃上清。
37.用含有蛋白酶抑制剂复合物的低渗裂解液重悬细胞，并在冰浴环境裂解细胞10min。
38.在冰浴环境用数控超声波细胞粉碎机对细胞进行机械破坏(超声时间2min，超声功率70w，超声1秒/间隙1秒)，在显微镜下观察细胞是否被完全破碎(如果是，继续下一步；如果否，重复破碎。)。
39.用4℃离心机收集细胞(9970
×
g，25min)，并收集上清液，弃沉淀物；
40.将上清液转移到超高速离心管中，并进行称重平衡(配平精确到毫克级)；
41.将样品对称放入beckman optima l-100k超速离心机中，并设置4℃和抽真空，然后以50000rpm离心1h。
42.用预冷的pbs充分重悬离心之沉淀，并分装储存于-80℃冰箱备用。
43.2、大肠杆菌外泌体的提取
44.将大肠杆菌接种到lb液体培养基上，放置细菌悬液于37℃烘箱内震荡(150rpm)培养12h。
45.收集细菌悬液，按1∶200重新接种到新鲜培养基上，继续培养20h。
46.用紫外光谱仪检测细菌悬液在600nm处的吸光度。
47.将细菌悬液4℃，11000
×
g离心5min，并收集上清液。
48.将上清液用0.45μm的针头式过滤器过滤，以去除细菌和碎屑等相对大颗粒，并收集滤液。
49.用100kda的超滤管浓缩滤液(3000
×
g，5min)，并收集浓缩液。
50.将浓缩液转移到超高速离心管中，并进行称重平衡(配平精确到毫克级)。
51.将样品对称放入beckman optima l-100k超速离心机中，并设置4℃，50000rpm离心2h。
52.用pbs充分重悬离心之沉淀，然后用0.22μm的针头式过滤器过滤重悬液。
53.分装并置于-80℃冰箱备用。
54.3、dspe-peg-mannose的合成
55.将5mg dspe-peg2000-nh2与1mg mannose-nhs溶于3ml dmso中。
56.收集溶液于1kda的透析袋中。
57.四度搅拌透析24h，期间换水不少于5次。
58.待透析完成后，将保留液进行冷冻干燥，最终得到dspe-peg-mannose。
59.4、仿生纳米疫苗的制备
60.利用bca法分别测量黑色素瘤细胞膜和大肠杆菌外泌体的蛋白浓度。
61.先按照每110μg总蛋白准备1ml pbs于离心管中，然后将黑色素瘤细胞膜和大肠杆
菌外泌体以10∶1(总蛋白量比值)在pbs里充分混合均匀，并加入终浓度为0.01mg/ml的dspe-peg-mannose。
62.利用脂质体挤出器对混合物进行挤压，并依次经过400nm、200nm、100nm和50nm的聚碳酸酯膜，如果聚碳酸酯膜破或者挤压时阻力过大需及时更换新的聚碳酸酯膜。
63.4℃搅拌透析24h，并在期间更换3-5次透析液，以去除保留液中游离的dspe-peg-mannose。
64.收集保留液，并调整总蛋白终浓度至100μg/ml。
65.利用220μm针式过滤器对疫苗进行过滤除菌。
66.加入体积终浓度为1％青链霉素，并分装避光保存于4℃。
67.实施例二：仿生纳米疫苗的透射电镜观察
68.实验步骤：
69.用移液枪吸取仿生纳米疫苗20μl滴在涂有碳的300平方目铜网格上，等待样品处于略干状态。
70.滴加20μl质量分数2％的磷钨酸染液。
71.滤纸吸取铜网表面多余的磷钨酸，滴加去离子水清洗，自然晾干。
72.上机检测。
73.实验结论：透电下仿生纳米疫苗的尺寸在50nm以内。
74.实施例三：仿生纳米疫苗预防黑色素瘤的动物实验
75.实验分组：pbs+b16f10、lm+b16f10、bm+b16f10、tm+b16f10、tbm+b16f10、tbm1+b16f10、pbs+mc38和tbm+mc38，其中lm表示脂质体和dspe-peg-mannose所制得疫苗，bm表示大肠杆菌外泌体和dspe-peg-mannose所制得疫苗，tm表示黑色素瘤细胞膜和dspe-peg-mannose所制得疫苗，tbm表示黑色素瘤细胞膜、大肠杆菌外泌体和dspe-peg-mannose所制得疫苗，tbm1表示黑色素瘤细胞膜、大肠杆菌外泌体和dspe-peg-mannose所制得疫苗且被放置了一个月；b16f10代表小鼠黑色素瘤细胞；mc38代表小鼠结肠癌细胞。
76.将仿生纳米疫苗注射到6-8周龄c57bl/6小鼠左侧腹股沟皮下，共免疫3次，每次间隔7天。
77.在末次免疫第7天，各组随机选取三只小鼠，对小鼠的心、肝、肺、肾、大脑皮质、淋巴结和肾脏进行he染色。接下来将8组小鼠于左侧背部皮下注射10万个b16f10细胞或mc38细胞(5只/组)。在接下来的观察中，若小鼠肿瘤体积大于2000mm3，或者小鼠体重下降超过20％即可终止实验。
78.每隔三天测量一次肿瘤的最大径a和最小径b，计算肿瘤体积大小(v＝ab2/2)。
79.每隔三天测量小鼠体重变化。
80.在荷瘤后的第15天脱颈处死小鼠，剥离肿瘤组织。
81.实验结论：仿生纳米疫苗对小鼠无明显毒性，并在一定程度上能预防黑色素瘤的发生，同时对结肠癌也有一定的预防作用，但由于动物伦理和为保证总体时间变量不变，我们没有对结肠癌细胞荷瘤小鼠进行继续观察。
82.图1透电下疫苗的尺寸在50nm以下；
83.图2三针疫苗期间各组小鼠的体重变化无明显差别，这说明tbm仿生纳米疫苗具有良好的生物安全性；
84.图3he染色结果显示tbm仿生纳米疫苗对小鼠各器官无明显毒性；
85.图4与pbs+b16f10组相比，lm+b16f10组小鼠体重无明显改变；与pbs+b16f10或lm+b16f10组相比，bm+b16f10和tm+b16f10组小鼠体重均呈现出下降的趋势，这是由于pbs+b16f10和lm+b16f10组在观察后期小鼠肿瘤体积增长过快所导致的；与bm+b16f10或tm+b16f10组相比，tbm+b16f10组小鼠的体重无明显改变；与tbm+b16f10组相比，tbm1+b16f10组小鼠的体重无明显改变；与pbs+mc38组相比，tbm+mc38组小鼠的体重无明显改变。这说明在tbm仿生纳米疫苗对小鼠体重无明显影响。
86.图5和图6与pbs+b16f10组相比，lm+b16f10组小鼠的肿瘤体积有增大的趋势，这是由于lm在靶向一些免疫细胞的同时并不具备免疫原性，这种竞争性的结合反而在一定程度上抑制了肿瘤调节的免疫力；与pbs+b16f10或lm+b16f10组相比，bm+b16f10和tm+b16f10组小鼠的肿瘤体积均明显减小；与bm+b16f10或tm+b16f10组相比，tbm+b16f10组小鼠的肿瘤体积明显减小；与tbm+b16f10组相比，tbm1+b16f10组小鼠的肿瘤体积无明显差异；与pbs+mc38组相比，tbm+mc38组小鼠的肿瘤体积明显减小。这说明tbm仿生纳米疫苗能明显抑制黑色素瘤的生长，且可以被长时间保存，同时我们发现tbm仿生纳米疫苗对结肠癌的进展也有一定的抑制作用；
87.图7与pbs+b16f10组相比，lm+b16f10组小鼠的肿瘤重量有增高的趋势；与pbs+b16f10或lm+b16f10组相比，bm+b16f10和tm+b16f10组小鼠的肿瘤重量均明显降低；与bm+b16f10或tm+b16f10组相比，tbm+b16f10组小鼠的肿瘤重量明显降低；与tbm+b16f10组相比，tbm1+b16f10组小鼠的肿瘤重量无明显差异；与pbs+mc38组相比，tbm+mc38组小鼠的肿瘤重量明显降低。这与各组小鼠的肿瘤体积变化具有一致性，体现出tbm仿生纳米疫苗对黑色素瘤和结肠癌的预防作用。