基于DNA-RNA杂合分子的纳米载体及其制备方法与应用

：本发明属于纳米载体，涉及一种基于dna-rna杂合分子的纳米载体及其制备方法与应用。

背景技术

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背景技术：

1、卵巢癌(ovarian cancer)作为一种妇科肿瘤，是常见严重危害女性生命健康的癌症之一，其发病率占女性癌症总比例的2.7％。卵巢癌常见于50-70岁患者，但在青壮年患者中发病数量同样较多。卵巢癌的发生发展与遗传因素、环境因素等多种因素有关，但也与一些基因的表达密切相关。

2、rna干扰(rna interference，rnai)和rna激活(rna activation，rnaa)现象的发现，为基因表达调控提供了新方法，可以为开发卵巢癌的治疗带来新的策略。自发现sirna、sarna及mirna等对细胞的目的基因存在明显调节作用以来，人们就开始了rna药物的研发。逐渐地rna药物显示出简单高效、靶点明确、低副作用的优点。然而，rna药物的发展受到递送系统的限制，尤其商品化的sirna和sarna的递送系统存在靶向性差、细胞毒性强、过高的免疫原性、递送效率差等多方面问题。目前常用的rna递送有脂质体法、抗体或配体化学偶联法等。因此，研发新的强靶向性、低细胞毒性、低免疫原性和成本低廉的递送系统，非常急需。

3、p21作为一种抑癌基因，是细胞周期依赖性激酶抑制剂家族中的重要成员之一。p21参与细胞周期调节，为重要的细胞周期调节因子，参与细胞内dna的复制及修复过程，与p53基因共同作用组成细胞周期的g1期检查点，阻止癌症的发生发展。因此，p21基因在细胞增殖中发挥着非常重要的作用，其活性的异常变化常常与癌症等多种疾病有关。

4、在t淋巴细胞表面，存在许多重要的功能调控分子，他们对t细胞的活化、增殖和发挥抗肿瘤效应具有非常重要意义。相对目前熟悉的vtcn1(v-set domain containing tcell activation inhibitor 1)、pd-l1(programmed cell death 1ligand 1)、ctla-4(cytotoxic t-lymphocyte associated protein 4)、lag-3(lymphocyte activating 3)、havcr2(hepatitis a virus cellular receptor 2)、cd160、cd244等免疫检查点而言，tigit也是细胞表面蛋白，作为免疫球蛋白超家族中的一员，tigit具有显著的免疫抑制功能，其全名为具有ig和itim结构域的t细胞免疫受体(t cell immune receptor with igand itim domains,tigit)。tigit是一种抑制性受体，在多种免疫细胞上表达，包括活化的cd8+t细胞、cd4+t细胞、nk细胞、调节性t细胞(regulatory t cells,tregs)等。除此之外，tigit在调节性t细胞抑制性免疫细胞上表达较多，并参与行使其免疫抑制功能，帮助肿瘤免疫抑制微环境的形成。

5、核酸适配体是利用体外筛选技术，即指数富集的配体系统进化技术(systematicevolution of ligands by exponential enrichment，selex)，筛选寡核苷酸分子用于靶向目标蛋白或化合物。核酸适配体在功能上与抗体类似，具特异靶向性，一般为寡核苷酸序列。核酸适配体具有分子量小、无免疫原性、易于进行修饰等优点，常常用于靶向生物检测或传感器的制备。各种类型的核酸适配体中，as1411核酸适配体是由bates等人在1999年报道的，可有效靶向核仁素(nucleolin,ncl)，又称为核仁蛋白或c23蛋白。核仁素是一个110kda磷酸化蛋白，其功能与核糖体的生命活动密切相关，包括rrna的转录调节等。近年来研究表明，核仁素作为一种跨膜蛋白，大部分分布于强增殖能力或低分化肿瘤细胞膜上，在肿瘤细胞表面呈现大量表达。所以，结合核仁素的适配体as1411可广泛应用于肿瘤细胞的成像等，也可应用于肿瘤的治疗。但是，目前还未见有报道以适配体为靶向工具的dna-rna杂合纳米载体，完成核酸药物的靶向递送。

技术实现思路

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技术实现要素：

1、本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点，提供一种基于dna-rna杂合分子的纳米载体制备方法与应用。该载体以as1411适配体为导向，靶向肿瘤细胞表面的核仁蛋白，并连接目的小rna核酸药物，在细胞的内吞作用下把纳米载体摄入细胞，完成核酸药物的靶向和胞内递送，为传统的小核酸药物的靶向递送提供新的低毒性方案。

2、为了实现上述目的，本发明提供一种基于dna-rna杂合分子的纳米载体，包括dna-rna杂交分子、as1411适配体和小rna核酸药物(或目的rna)，dna-rna杂交分子是as1411适配体和目的rna的连接桥梁；目的rna分子共价键与dna-rna杂交分子中的rna-3′连接。

3、所述dna-rna杂交分子的dna链3′端连接as1411适配体的5′端。

4、所述as1411适配体的序列，参考文献报道如seq id no：1所示；所述dna-rna杂交分子的dna序列如seq id no：2所示，rna序列如seq id no：3的5′端16个碱基。

5、所述目的rna的碱基u和c为2′-氟代修饰，即utp和ctp的2号位的-oh替换为-f。

6、所述目的rna为p21基因sarna或tigit基因sirna。

7、所述p21基因sarna的序列，参考文献报道如seq id no：3的3′端21个碱基和seqid no：4所示；tigit基因sirna的序列如seq id no：5的3′端23个碱基和seq id no：6所示。

8、本发明还提供所述基于dna-rna杂合分子的纳米载体的制备方法，首先合成所需的目的rna和dna-rna杂交分子-as1411适配体，并对目的rna的ctp和utp进行2′-氟代化学修饰；将dna-rna杂交分子-as1411适配体与相应的目的rna等摩尔混合制成溶液，与等体积杂交缓冲液(2xpbs-2mm mgcl2)混合，于热循环仪加热80℃3min，50℃5min，25℃15min，pcr仪上降温至4℃，20min，完成as1411适配体-dna-rna杂合纳米载体的制备。

9、本发明还提供所述基于dna-rna杂合分子的纳米载体在制备核酸药物中的应用。

10、本发明与现有技术相比，利用dna-rna杂交技术构建了一种携带sirna/sarna的dna-rna杂合纳米载体递送系统，这一递送系统较传统的转染试剂具有极低的细胞毒性和优良的靶向性，能成功将目的小rna靶向送入肿瘤细胞，并使其目的基因表达上调或下调，诱导肿瘤细胞凋亡，从而发挥抗肿瘤作用；这一递送系统的构建，为小rna递送系统的发展提供了新思路：通过dna-rna杂交分子将目的rna与适配体连接，既不影响适配体的靶向性，又达到了递送rna药物的作用。