1.本发明涉及肿瘤疫苗技术领域，具体为一种非特异性免疫细胞肿瘤疫苗的制备方法。
背景技术：
2.肿瘤的发生一方面与环境污染、生活习惯有着密切关系，另一方面我国的肿瘤防治工作也一直存在重治轻防的问题，肿瘤的预防保健教育未能广泛开展，或者仅存在于喊口号阶段，没有实际行动。公众对于肿瘤的预防保健认识不够，或者不知如何进行肿瘤的预防保健。由此可见，对肿瘤的预防保健措施的细化将成为肿瘤防治工作的重点。
3.肿瘤疫苗作为肿瘤的防治手段，是近年研究的热点之一，其原理将肿瘤抗原以多种形式如：肿瘤细胞、肿瘤相关蛋白或多肽、表达肿瘤抗原的基因等，导入患者体内，克服肿瘤引起的免疫抑制状态，增强免疫原性，激活患者自身的免疫系统，诱导机体细胞免疫和体液免疫应答，从而达到控制或清除肿瘤的目的。
4.因此，本方案旨在提供一种新的非特异性免疫细胞肿瘤疫苗的制备方法。
技术实现要素：
5.针对上述情况，为弥补上述现有缺陷，本发明提供了一种非特异性免疫细胞肿瘤疫苗的制备方法。
6.本发明提供如下的技术方案：本发明提出的一种非特异性免疫细胞肿瘤疫苗的制备方法，具体包括下列步骤：
7.步骤一、根据抗肿瘤能力指标从健康群体中筛选具有抗肿瘤能力者；
8.步骤二、从所述具有抗肿瘤能力者采集外周血，并采用生理盐水对抗肿瘤能力者的外周血进行稀释，用淋巴细胞分离液分离外周血单核细胞，采用淋巴细胞培养液aim-v调节外周血单核细胞的密度成3
×
106～5
×
106/ml的细胞悬液；
9.步骤三、将细胞悬浮液置入37℃、5％co2的培养箱温育2小时，然后用移液管轻轻冲吸细胞之后置入离心机中，在离心速度为2000rpm的条件下离心，离心之后的上清液a移入培养瓶中，继续置入37℃、5％co2的培养箱温育24小时；
10.步骤四、从培育箱中温育24小时的上清液a中分离一代免疫细胞，并将一代免疫细胞进行破碎，离心之后收集上清液b，上清液b即为一代免疫细胞的粗提物；
11.步骤五、将一代免疫细胞的粗提物移入培养瓶中，并向培养瓶中加入cd3单克隆抗体，继续培养2～3天后得到二代免疫细胞，在显微镜下对二代免疫细胞计数；
12.步骤六、采用cik细胞培养液将二代免疫细胞的密度调整至3
×
105～5
×
105/ml，之后置入培养瓶中扩大培养，培养瓶中加入细胞裂解液，培养2～3天，即可得到三代免疫细胞；
13.步骤七、从三代免疫细胞培养物分离免疫细胞，留下无细胞培养液待用；
14.步骤八、破碎三代免疫细胞，离心后收集上清液c，将上清夜c与无细胞培养液混
合，得到三代免疫细胞的细胞粗提物；
15.步骤九、通过饱和硫酸铵沉淀法从三代免疫细胞中提取蛋白质，得到蛋白粗提物；
16.步骤十、将蛋白粗提物冻干，即可得到非特异性免疫细胞肿瘤疫苗的制备方法。
17.进一步地，步骤一所述具有抗肿瘤能力者的指标包括：身高、体重、血压、脉率、心肺功能、血常规、尿常规、血糖、肝肾功能、胸片、心电图、彩超、既往史、家族史、肿瘤易感基因检测和免疫功能检测。
18.进一步地，所述生理盐水与外周血的体积比为1：1。
19.采用上述结构本发明取得的有益效果如下：本发明提出的一种非特异性免疫细胞肿瘤疫苗的制备方法，以具有抗肿瘤能力者的外周血作为免疫细胞的提取基础，简易高效的提取了具有高免疫功能的免疫细胞，免疫细胞在多代培养中分化并分泌多种具有肿瘤免疫功能的细胞因子，从而得到具有非特异性免疫细胞肿瘤疫苗。
具体实施方式
20.下面将结合本发明的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
21.实施例1
22.一种非特异性免疫细胞肿瘤疫苗的制备方法，具体包括下列步骤：
23.步骤一、根据抗肿瘤能力指标从健康群体中筛选具有抗肿瘤能力者，步骤一所述具有抗肿瘤能力者的指标包括：身高、体重、血压、脉率、心肺功能、血常规、尿常规、血糖、肝肾功能、胸片、心电图、彩超、既往史、家族史、肿瘤易感基因检测和免疫功能检测；
24.步骤二、从所述具有抗肿瘤能力者采集外周血，并采用生理盐水对抗肿瘤能力者的外周血进行稀释，生理盐水与外周血的体积比为1：1，用淋巴细胞分离液分离外周血单核细胞，采用淋巴细胞培养液aim-v调节外周血单核细胞的密度成3
×
106～4
×
106/ml的细胞悬液；
25.步骤三、将细胞悬浮液置入37℃、5％co2的培养箱温育2小时，然后用移液管轻轻冲吸细胞之后置入离心机中，在离心速度为2000rpm的条件下离心，离心之后的上清液a移入培养瓶中，继续置入37℃、5％co2的培养箱温育24小时；
26.步骤四、从培育箱中温育24小时的上清液a中分离一代免疫细胞，并将一代免疫细胞进行破碎，离心之后收集上清液b，上清液b即为一代免疫细胞的粗提物；
27.步骤五、将一代免疫细胞的粗提物移入培养瓶中，并向培养瓶中加入cd3单克隆抗体，继续培养2天后得到二代免疫细胞，在显微镜下对二代免疫细胞计数；
28.步骤六、采用cik细胞培养液将二代免疫细胞的密度调整至3
×
105～4
×
105/ml，之后置入培养瓶中扩大培养，培养瓶中加入细胞裂解液，培养2天，即可得到三代免疫细胞；
29.步骤七、从三代免疫细胞培养物分离免疫细胞，留下无细胞培养液待用；
30.步骤八、破碎三代免疫细胞，离心后收集上清液c，将上清夜c与无细胞培养液混合，得到三代免疫细胞的细胞粗提物；
31.步骤九、通过饱和硫酸铵沉淀法从三代免疫细胞中提取蛋白质，得到蛋白粗提物；
32.步骤十、将蛋白粗提物冻干，即可得到非特异性免疫细胞肿瘤疫苗的制备方法。
33.实施例2
34.一种非特异性免疫细胞肿瘤疫苗的制备方法，具体包括下列步骤：
35.步骤一、根据抗肿瘤能力指标从健康群体中筛选具有抗肿瘤能力者，步骤一所述具有抗肿瘤能力者的指标包括：身高、体重、血压、脉率、心肺功能、血常规、尿常规、血糖、肝肾功能、胸片、心电图、彩超、既往史、家族史、肿瘤易感基因检测和免疫功能检测；
36.步骤二、从所述具有抗肿瘤能力者采集外周血，并采用生理盐水对抗肿瘤能力者的外周血进行稀释，生理盐水与外周血的体积比为1：1，用淋巴细胞分离液分离外周血单核细胞，采用淋巴细胞培养液aim-v调节外周血单核细胞的密度成4
×
106～5
×
106/ml的细胞悬液；
37.步骤三、将细胞悬浮液置入37℃、5％co2的培养箱温育2小时，然后用移液管轻轻冲吸细胞之后置入离心机中，在离心速度为2000rpm的条件下离心，离心之后的上清液a移入培养瓶中，继续置入37℃、5％co2的培养箱温育24小时；
38.步骤四、从培育箱中温育24小时的上清液a中分离一代免疫细胞，并将一代免疫细胞进行破碎，离心之后收集上清液b，上清液b即为一代免疫细胞的粗提物；
39.步骤五、将一代免疫细胞的粗提物移入培养瓶中，并向培养瓶中加入cd3单克隆抗体，继续培养3天后得到二代免疫细胞，在显微镜下对二代免疫细胞计数；
40.步骤六、采用cik细胞培养液将二代免疫细胞的密度调整至4
×
105～5
×
105/ml，之后置入培养瓶中扩大培养，培养瓶中加入细胞裂解液，培养3天，即可得到三代免疫细胞；
41.步骤七、从三代免疫细胞培养物分离免疫细胞，留下无细胞培养液待用；
42.步骤八、破碎三代免疫细胞，离心后收集上清液c，将上清夜c与无细胞培养液混合，得到三代免疫细胞的细胞粗提物；
43.步骤九、通过饱和硫酸铵沉淀法从三代免疫细胞中提取蛋白质，得到蛋白粗提物；
44.步骤十、将蛋白粗提物冻干，即可得到非特异性免疫细胞肿瘤疫苗的制备方法。
45.要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物料或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物料或者设备所固有的要素。
46.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。