丹参酚酸C(SAC)作为新型抗衰老药物原料在细胞衰老、肿瘤治疗与延长寿命中的应用

本发明涉及生物医药领域。具体地说，本发明涉及丹参酚酸c(sac)作为新型抗衰老药物原料在细胞衰老、肿瘤治疗与延长寿命中的应用。

背景技术：

1、细胞衰老是指真核细胞一种相对稳定且通常不可逆的细胞周期停滞的状态，在这种状态下增殖细胞会对促生长刺激产生耐受，通常由dna损伤等胁迫性信号所引起。复制性衰老是指正常细胞在大约30-50次分裂(即“hayflick 极限”)后会停止连续分裂。复制性衰老本质上由端粒渐进缩短所诱导。在每一轮的dna复制中，端粒都会逐渐缩短，最终达到一个临界长度，阻止进一步复制，从而停止细胞分裂。较短的无帽端粒会引起dna损伤应答，从而直接触发衰老。

2、现在普遍认为，除了具有干细胞样特性的细胞类型外，只有转化的恶性细胞会无限复制，而非转化细胞则不会。衰老细胞与静息细胞和终末分化细胞均不同，其中静息细胞能够重新进入细胞周期。衰老细胞的特征是形态学异常、代谢活性变化、染色质重构、基因表达改变、脂褐素增加、颗粒性明显、空泡化严重以及出现一种称为衰老相关分泌表型(sasp)的促炎症表型。由于核纤层lamin b1表达丧失，可观察到核膜完整性破坏。衰老细胞积累功能失调的线粒体，并表现出活性氧种属(ros)水平升高。还可观察到溶酶体内含物增加和溶酶体活性改变，表现为ph为6.0时β-半乳糖苷酶染色阳性率上升，使其成为广被采用的细胞衰老标志物。衰老的生物学作用比较复杂，衰老细胞的保护作用和有害作用均已有描述，主要取决于病理生理学环境。例如，尽管衰老可能作为避免受损细胞恶性转化的机制进化而来，但衰老的发生可能会导致许多年龄相关病变，包括癌症、心脑血管疾病、骨质疏松、关节炎、代谢性疾病、神经退行性症状等一系列临床问题。

3、细胞衰老表现为核膜内折，染色质固缩，细胞体积增大，激活下游包括p53、p16ink4a/rb、pi3k/akt、foxo转录因子和线粒体sirt1等在内的多条信号通路。除了进入永久性增殖停滞，衰老细胞常关系到许多病理学特征，包括局部炎症。细胞衰老发生于受损细胞，并防止其在生物体内增殖。在各种外界刺激和内部因素影响下，细胞损伤可以导致明显的细胞衰老迹象。当损伤累积达到一定的限度，组织中呈现各种肉眼可辨的组织退行变化和生理上的衰老表型。

4、尤其值得注意的是，衰老细胞中炎症性细胞因子的表达水平显著升高，这一现象被称为衰老相关分泌表型(senescence-associated secretory phenotype, sasp)。sasp这一概念是由coppe等人于2008年首次提出。他们发现衰老细胞能通过分泌胞外基质蛋白、炎症相关因子及癌细胞生长因子促进邻近癌前细胞发生癌变或恶性程度上升，并称这些蛋白为sasp因子。

5、衰老细胞主要通过3个途径参与机体的各种生理和病理过程：(1)衰老细胞基因表达和形态改变逐步累积可影响相应组织的功能；(2)衰老细胞限制干细胞和未分化祖细胞的再生潜能，导致细胞再生能力下降；(3)衰老细胞不仅表现为生长周期停滞，还通过自分泌和旁分泌途径释放大量的细胞因子、趋化因子、生长因子和蛋白酶等，影响邻近细胞和组织的微环境，导致和加速衰老及相关疾病，近年大量研究表明在这一过程中sasp起到核心的病理作用。此外，衰老细胞分泌的这些因子还会影响周围的正常细胞，而抑制sasp则能够延缓机体衰老。典型的sasp因子包括肿瘤坏死因子-α(tnf-α)、白细胞介素6(il-6)、白细胞介素8(il-8)、白细胞介素1a(il-1a)、基质金属蛋白酶(mmp)、粒细胞- 巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)和纤溶酶原激活物抑制因子-1(pai1)等，这些因子促进免疫系统激活，导致组织微环境中衰老细胞等异常因素被机体清除，发挥肿瘤抑制功能。然而，十分矛盾的是，sasp尚可通过特定分泌因子(如 vegf,angptl4)促进血管生成、细胞外基质重塑或上皮-间质转化(emt)的因子来促进肿瘤发展。此外，衰老诱导的慢性炎症可引起系统性免疫抑制，这种慢性炎症还可促进衰老相关的组织损伤和变性、器官功能失调和癌症等多种衰老相关疾病的发生和发展。

6、dna损伤、端粒功能障碍、癌基因激活、氧化应激等刺激均可诱导细胞出现sasp，其机制与转录级联、自分泌环路和持续dna损伤反应密切相关。但是，过表达或者抑制衰老经典通路p53和p16ink4a/rb不能影响sasp的表达，表明尽管衰老细胞的周期停滞和sasp经常协同发生，两者的调控通路并不完全重叠。据报道，dna损伤反应通过激活毛细血管扩张共济失调突变基因、奈梅亨断裂综合征蛋白1和检测点激酶2增加sasp因子il-6和il-8的分泌。 dna损伤反应(ddr)在细胞受损后立即被激活，衰老细胞出现成熟sasp则需要约1周甚至更长的时间，并且短暂的dna损伤反应并不能诱导细胞衰老，也不能诱导sasp，表明除了dna损伤反应外还存在其它机制共同诱导sasp。

7、表观遗传学近年在sasp研究领域取得不少进展。sirtuins是一种代谢相关、 nadh依赖的去乙酰化酶，在不同模型中已发现sirt1有寿命延长的效应。衰老细胞中sirt1通过脱乙酰化il-6和il-8启动子区组蛋白h3k9和h4k16实现对sasp因子的表达抑制，当敲除sirt1后，细胞衰老期间这些区域乙酰化水平高于对照组细胞。micrornas是一类高度保守的单链非编码rna，长度大约为20～26个核苷酸，在真核细胞中调节基因的表达。研究结果表明，mir-146、 mir-34、mir-21和mir-183等可以调节衰老细胞sasp，并能够有效地抑制炎性细胞因子的过度生成。mir-146a/b可以降低人脐静脉内皮细胞中il-1受体相关激酶的产生；相反抑制mir-146a/b可以提高il-1受体相关激酶的活性，激活转录因子nf-κb，诱导il-6和il-8产生。

8、表观遗传改变通过影响dna损伤修复、端粒长度和代谢途径或激活衰老相关基因和mirnas的表达而影响衰老。多种证据表明染色质状态的改变与细胞衰老的控制密切相关。细胞可以感觉到不同的衰老刺激，这些刺激会激活信号通路，驱动染色质状态的改变。然而，衰老信号引起这种改变的途径仍然很大程度上是未知的。因此，从表观遗传角度揭示细胞衰老及其特定表型发生发展的调控机制，从进而揭示具有靶向价值的关键分子及其信号通路，是将来衰老生物学和老年医学的一个新兴方向，亟需深入开展相关探索，为临床医学提供重要科学依据和潜在的干预措施。

9、随着全球人口老龄化的日益加剧，人们对“主动健康、延缓衰老”的兴趣与日俱增，主要是基于一系列靶向衰老的基本机制可以延缓多种衰老相关慢性或非传染性疾病的发生或加剧的科学证据。因此，细胞衰老作为预防或治疗多种衰老相关疾病和提高健康寿命的潜在靶点已获得诸多关注。

10、延缓衰老的药物主要是通过短暂性阻断生存途径(衰老细胞抗凋亡途径 scaps)选择性清除衰老细胞，该生存途径可保护衰老细胞免受环境中凋亡诱导信号的调控。临床前研究表明有一类药物，即senolytics有望将来应用于延缓、预防或治疗多种衰老相关的疾病。

11、尽管越来越多的实验支持靶向细胞衰老可以同时治疗多种衰老相关疾病，但还有待严谨的人体临床试验以帮助人们更好地评估延缓衰老药物的益处和风险。尽管国际已知的多种sasp抑制剂均可显著减弱sasp，但本质上不会杀死衰老细胞。为了在药理学上减轻衰老细胞的负担，科学家们正在开发“senolytics”(衰老细胞清除药物)这种性质的小分子、多肽和抗体来选择性地清除衰老细胞。研究者们自2015年发现senolytic药物以来，在鉴别其他小分子senolytic药物及其作用方面取得了相当大的进展。研究发现首个senolytic 药物的文章是基于衰老细胞抵抗凋亡的假说，尽管衰老细胞会产生促凋亡sasp因子来触发自身死亡。

12、事实上，有研究表明在衰老细胞中促凋亡途径确实上调。因此，衰老细胞依赖于衰老相关的抗凋亡途径(scaps)来减轻sasp对自身的伤害，这一假说得到了验证。scaps是通过生物信息学方法(基于辐射诱导衰老的人前脂肪细胞的表达谱)来鉴定的。有研究通过体外rna干扰实验发现衰老细胞对 scaps具有依赖性，并将scaps确认为衰老细胞的致命弱点。这一研究发现最终促成了scap网络中潜在的senolytic靶点的发现以及第一种senolytic药物的发现，其中senolytic药物包括达沙替尼(dasatinib)(一种fda批准的酪氨酸激酶抑制剂)和槲皮素(quercetin)(一种存在于许多水果和蔬菜中的黄烷醇)的组合(d+q)。此外，有研究将bcl-2家族中一种对抗凋亡的蛋白 (bcl-xl)鉴定为sasp组分。在这一发现之后，第三种senolytic药物navitoclax 也被鉴定出来，它是一种bcl-2家族抑制剂。研究人员目前已经鉴定出越来越多的senolytics，包括其它合成的小分子、从天然产物中提取的化合物以及靶向已知scaps肽的抑制剂。此外，scaps也作为潜在的senolytic靶点备受瞩目。

13、衰老细胞存活所需的scap在细胞类型之间有所不同。例如，衰老的人类原代脂肪祖细胞存活所需的scaps与衰老的人类胚胎静脉内皮细胞(huvecs) 中的scaps不同。这种差异意味着靶向单个scap的药物可能无法消除多种衰老细胞类型。而且大量研究表明大多数senolytics确实仅对有限的衰老细胞类型有效。例如，navitoclax能够靶向huvecs，但对衰老的人类脂肪祖细胞无效。有证据表明，即使在一种特定类型的细胞内，senolytics的功效也可能不同。例如，在人肺成纤维细胞中，navitoclax能靶向并杀死适应培养的imr-90肺成纤维细胞样细胞株中的衰老细胞，但对衰老的原代人肺成纤维细胞少有成效。因此，为确定senolytics的广谱作用，仍需要进行针对一系列细胞类型的广泛测试。

14、在特定条件下，senolytic药物的使用频率可能取决于衰老细胞的积累速度，而衰老细胞的积累速度可能会因细胞衰老发生的环境而异。例如，反复接触破坏dna的癌症疗法或持续的高脂肪饮食，可能会比自然衰老更迅速地导致衰老细胞的重新累积。间歇性使用senolytics可以降低患者产生不良反应的风险，并允许在健康期间使用senolytics。此外，间歇给药还可以减少senolytics产生的副作用并降低患者产生耐药性的可能性。与抗癌药物或抗生素的情况相反，因为衰老细胞不发生分裂，因此机体无法依赖细胞增殖产生senolytics抗性，从而无法获得有利的突变，这为将来临床中广泛使用senolytics创造了良好的基础。

技术实现思路

1、本发明的目的就是提供丹参酚酸c(sac)作为新型抗衰老药物原料在细胞衰老、肿瘤治疗与延长寿命中的应用。

2、本发明提供了一种在细胞衰老、肿瘤治疗与延长寿命中均发挥重要作用的新型抗衰老药物原料。

3、在本发明的第一方面，提供了丹参酚酸c的用途，用于制备制剂或药物组合物，所述制剂或药物组合物用于：

4、a)抑制衰老相关分泌表型(sasp)表达；

5、b)抗衰老或清除衰老细胞；

6、c)降低肿瘤对化疗药物的耐药性；和/或

7、d)延长寿命或晚年生存期。

8、在另一优选例中，所述衰老相关分泌表型为dna损伤导致的衰老相关分泌表型；优选地为化疗药物或电离辐射造成的dna损伤。

9、在另一优选例中，所述的用于抑制sasp表达的制剂或药物组合物中丹参酚酸c浓度为10-200μm，优选为20-100μm，更优选为40-60μm(例如40、45、 50、55或60μm)。

10、在另一优选例中，所述的抗衰老包括诱导衰老细胞恢复生长和/或增殖能力。

11、在另一优选例中，所述的清除衰老细胞包括诱导衰老细胞进入死亡程序。

12、在另一优选例中，所述的用于清除衰老细胞的制剂或药物组合物中丹参酚酸c浓度为＞100μm，优选为200-3000μm，更优选为200-2000μm(例如200、 300、400、500、600、7000、800、9000、1000、1100、1200、1300、1400、 1500、1600、1700、1800、1900、或2000μm)。

13、在另一优选例中，所述丹参酚酸c通过诱导肿瘤微环境中衰老细胞进入死亡程序降低肿瘤对化疗药物的耐药，优选通过caspase-3/7介导诱导肿瘤微环境中衰老细胞进入死亡程序。

14、在另一优选例中，所述的化疗药物为基因毒药物。

15、在另一优选例中，所述的化疗药物选自下组：米托蒽醌、博来霉素、阿霉素、或其组合。

16、在另一优选例中，所述的肿瘤选自下组：前列腺癌、肺癌、胃癌、肝癌、肾脏肿瘤、小肠癌、骨癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、宫颈癌、卵巢癌、淋巴癌、鼻咽癌、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、脑癌、子宫内膜癌、睾丸癌、甲状腺癌、或其组合。

17、在另一优选例中，所述的丹参酚酸c不影响或基本不影响增殖态细胞。

18、在本发明的第二方面，提供了一种药物组合物或药物组合，包括治疗有效量的：

19、c1)作为第一活性成分的丹参酚酸c、或其药学上可接受的盐；

20、c2)作为第二活性成分的化疗药物，

21、其中，所述化疗药物能够诱发肿瘤微环境中衰老细胞出现。

22、在另一优选例中，所述的化疗药物能够诱导肿瘤微环境中sasp表达；或能够诱导衰老标记p16ink4a上调。

23、在另一优选例中，所述的化疗药物选自下组：米托蒽醌、博来霉素、阿霉素、或其组合。

24、在另一优选例中，所述化疗药物为米托蒽醌，并且米托蒽醌与丹参酚酸c 的重量比为1:10-100；优选为1:25-75；更优选为1:40-60(例如1:45、1:50或 1:55，更优选为1:50)。

25、在另一优选例中，所述化疗药物为博来霉素，并且博来霉素的浓度为1-100 μg/ml；优选为20-70μg/ml；更优选为40-60μg/ml(例如45、50或55μg/ml，更优选为50μg/ml)。

26、在另一优选例中，所述化疗药物为阿霉素，并且阿霉素与丹参酚酸c的重量比为1:20-200；优选为1:50-150；更优选为1:80-120。

27、在另一优选例中，所述的药物组合物中丹参酚酸c浓度为10-200μm，优选为20-100μm，更优选为40-60μm(例如40、45、50、55或60μm)，其中丹参酚酸c用于抑制sasp表达。

28、在另一优选例中，所述的药物组合物中丹参酚酸c浓度为＞100μm，优选为200-3000μm，更优选为200-2000μm(例如200、300、400、500、600、7000、 800、9000、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、或2000μm)，其中丹参酚酸c用于诱导衰老细胞进入死亡程序。

29、在本发明的第三方面，提供了一种筛选能够与丹参酚酸c协同抗肿瘤的物质的方法，包括步骤：

30、(s1)提供一肿瘤组织，使用候选物质处理所述肿瘤组织；

31、(s2)检测经处理的肿瘤组织中细胞衰老情况，从而筛选能够与丹参酚酸 c协同抗肿瘤的物质。

32、在另一优选例中，所述的抗肿瘤包括：促进肿瘤消退，优选地包括清除肿瘤微环境中衰老细胞。

33、在另一优选例中，所述的检测细胞衰老情况包括：

34、(i)检测衰老细胞数量；

35、(ii)检测sasp因子表达；

36、(iii)检测衰老标记p16ink4a。

37、在另一优选例中，如检测到候选物质处理能够提高(如提高10％、20％、 30％、40％、50％以上或更高)肿瘤组织中衰老细胞数量、sasp因子表达、和/ 或衰老标记p16ink4a，则认为该物质是能够与丹参酚酸c协同抗肿瘤的物质。

38、在另一优选例中，所述的sasp因子包括il6、cxcl8、spink1、wnt16b、 gm-csf、mmp3、il1α，但不限于此。

39、在另一优选例中，所述的肿瘤组织含有肿瘤细胞和基质细胞。

40、在另一优选例中，所述的检测细胞衰老情况为检测基质细胞衰老情况。

41、在另一优选例中，所述的方法为体内筛选或体外筛选。

42、在另一优选例中，所述的抗肿瘤效果包括：肿瘤细胞杀伤率、肿瘤组织体积缩小率、荷瘤动物生存率，但不限于此。

43、在另一优选例中，所述方法还包括步骤：设置一对照组，所述对照组可以为无处理对照组。

44、在另一优选例中，所述的物质包括小分子化合物、生物大分子，但不限于此。

45、在另一优选例中，所述的候选物质为化疗药物。

46、在另一优选例中，所述的方法为非诊断非治疗方法。

47、在本发明的第四方面，提供了一种体外非治疗性地抑制细胞sasp表达、清除衰老细胞、和/或降低肿瘤细胞对化疗药物耐药性的方法，包括步骤：

48、将丹参酚酸c与所述的细胞接触，从而抑制其sasp表达、清除所述衰老细胞、和/或降低所述肿瘤细胞对化疗药物耐药性。

49、在另一优选例中，所述的肿瘤选自下组：前列腺癌、肺癌、胃癌、肝癌、肾脏肿瘤、小肠癌、骨癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、宫颈癌、卵巢癌、淋巴癌、鼻咽癌、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、脑癌、子宫内膜癌、睾丸癌、甲状腺癌、或其组合。

50、在本发明的第五方面，提供了一种在有需要的受试者中抑制sasp表达、抗衰老或清除衰老细胞、降低肿瘤对化疗药物的耐药性、或延长寿命或晚年生存期的方法，包括步骤：

51、给有需要的受试者施用丹参酚酸c，从而抑制sasp表达、抗衰老或清除衰老细胞、降低肿瘤对化疗药物的耐药性、或延长寿命或晚年生存期。

52、在本发明的第六方面，提供了一种在有需要的受试者中治疗肿瘤的方法，包括步骤：

53、给有需要的受试者施用治疗有效量的：化疗药物、以及丹参酚酸c。

54、在另一优选例中，所述的化疗药物为基因毒药物，优选地所述化疗药物能够提高肿瘤微环境中sasp表达。

55、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例) 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。