一种具有抗皱紧致功效的脂质体及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及化妆品领域，尤其是涉及一种含有人源胶原蛋白，脱羧肌肽，皱角叉波菜，具有保湿、抗皱、紧致功效的脂质体及其制备和应用。


背景技术：

2.皮肤作为重要器官，由真皮层、增生层和角质层组成，覆盖整个身体表面，提供保护、感知、免疫、代谢及体温调节功能。像其他器官一样，皮肤受到复杂的生理老化过程的影响。内在的或随时间推移的老化是由遗传编码的衰老和内源性因素引起的生化改变的结果。衰老过程的特点是细胞和细胞外基质的再生速度减慢，真皮胶原和弹性纤维逐渐丧失，导致皮肤及表皮萎缩、干燥、皮肤弹性和紧实度降低，出现细纹和皱纹、色素沉着或色素沉着斑、老年斑等。另一方面，外在的老化是由于环境的影响，如污染、太阳光照射、疾病、生活方式等。这与长期暴露在这些影响下的区域的内在老化相叠加，如光老化。大多数消费者关注自身的皮肤老化现象，如皱纹、丧失紧致感等。皮肤干燥是一种非常常见的皮肤状况，其特点是皮肤最表层缺乏适量的水份，其发生可能取决于遗传、后天或环境因素，无论衰老。
3.目前针对抗皱形成原理和过程，已开发的相关活性成分主要包括：影响组织细胞生长代谢的成分，如细胞生长因子、果酸类成分、羊胎素等；促进皮肤保湿与修护皮肤屏障功能的活性成分，如神经酰胺、透明质酸等；抗氧化损伤的成分，如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化酶等。但是目前许多抗老成分不属于天然物质，为人工合成的成分，例如玻色因，原材料木糖醇来自于山毛榉树经两步化学反应后最终才得到玻色因，过程中产生的废料对于环境等具有一定的影响，不符合现代洁净美容的理念。
4.胶原蛋白是一种结构蛋白，主要存在于皮肤、肌腱以及骨骼中。胶原蛋白的缺少会导致胶原纤维发生联固化，使细胞间粘多糖减少，皮肤便会失去弹性和光泽，同时真皮的纤维断裂，脂肪萎缩，皮肤便会出现皱纹这种老化现象。现在，小分子胶原蛋白作为一种有效的化妆品原料，能够做到滋润肌肤，通过角质层与上皮细胞作用，补充皮肤所需氨基酸，赋予其平滑感。且胶原蛋白加入护肤类化妆品中，与其它原料配伍性佳，对受损肌肤有较好的修复作用。目前，胶原蛋白主要来自于动物组织，如牛骨、牛皮和猪皮等，但其品质、纯度和功能都具有不可预测性。而且动物源胶原蛋白可能带有传染性病原体和引发机体免疫反应。除此之外，来源于动物的胶原在提取过程中分子结构会遭到不同程度的破坏，均一性较差。而且由于胶原蛋白本身的透皮性和稳定性问题限制了其在化妆品领域中的应用。


技术实现要素：

5.本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种透皮性好、稳定性强的具有抗皱紧致功效的脂质体及其制备方法和应用。
6.本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：一种具有抗皱紧致功效的脂质体，包括以下重量百分含量的组分：0.1％～1％的重组人源化胶原蛋白，0.01％～0.3％的脱羧肌肽，0.01％～0.35％的皱波角叉菜提取物，1.2％～7.5％的卵磷脂，余量去离子水。
7.所述的重组人源化胶原蛋白为分子量大于10万道尔顿且水溶性强的iii型胶原蛋白。
8.所述的皱波角叉菜提取物和卵磷脂质量比为(0.001～0.3)：1。
9.所述的重组人源化胶原蛋白、脱羧肌肽与卵磷脂的质量比为(1～2)：1：(15～20)。
10.本发明还提供一种具有抗皱紧致功效的脂质体的制备方法，包括以下步骤：
11.(1)将皱波角叉菜提取物和卵磷脂溶解于乙醇中，震荡溶解，至溶液呈透明状，配得油相膜材溶液；
12.(2)将步骤(1)得到的油相膜材溶液于30～50℃恒温下减压除去乙醇，至反应器壁内侧形成一层透明薄膜，干燥10～20min，得到干燥物；
13.(3)将重组人源化胶原蛋白、脱羧肌肽溶解于磷酸缓冲液中，配得水相活性磷酸缓冲液；
14.(4)将步骤(3)得到的水相活性磷酸缓冲液加入步骤(2)得到的干燥物中，30～50℃下常压旋转震荡水合脱膜；
15.(5)脱膜完全后超声5-20min，过滤后得到粒径均匀的脂质体。
16.步骤(3)中磷酸缓冲液的ph＝6.8。
17.所述的水相活性磷酸缓冲液与油相膜材溶液的体积比为1：(2～5)。
18.步骤(5)得到的抗老功效脂质体的粒径为0.1-0.5μm。
19.本发明还提供一种具有抗皱紧致功效的脂质体的应用，将所述脂质体用于化妆品中。所述的化妆品包括精华液或面霜。
20.进一步地，精华液包括以下重量百分含量组分：脂质体及胆固醇1～5％，edta二钠0.01％～1％，卡波姆0.1％～0.5％，10％氢氧化钠水溶液0.5％～0.8％，羟苯甲脂1％～3％，苯氧乙醇0.1％～0.5％，羟苯乙酯0.05％～0.1％，水余量。
21.进一步地，精华液中胆固醇的质量与脂质体中卵磷脂质量比为1:4。
22.进一步地，精华液还包括甘油、吐温中的一种或多种。
23.进一步地，面霜包括以下重量百分含量组分：脂质体及胆固醇1～5％，edta二钠0.03％～1％，鲸蜡基羟乙基纤维素0.1％～0.5％，丁二醇1％～3％，乳化剂0.5％～2％(可选用甘油硬脂酸酯、山嵛醇、棕榈酸、硬脂酸、卵磷脂、月桂醇、肉豆蔻醇、鲸蜡醇中的一种或几种)，牛油果树果脂1％～2％，辛基十二醇硬脂酸酯2％～4％，10％氢氧化钠水溶液1％～2％，聚二甲基硅氧烷0.3％～1.5％，有机溶剂5％～10％(选用甘油、甘油丙烯酸酯/丙烯酸共聚物、丙二醇中的一种或几种)，醇0.5～1％(可选用苯氧乙醇、1,3-丙二醇、碳酸丙烯、辛酰羟肟酸、邻伞花烃-5-醇中的一种或几种)，水余量。
24.进一步地，面霜中胆固醇的质量与脂质体中卵磷脂质量比为1:4。
25.进一步地，面霜还包括甘油、吐温中的一种或多种。
26.随着时代发展，人们对于健康和排毒的痴迷正在推动无毒、无害、低致敏性和不含(有毒物)的“洁净美容”潮流，这一概念不仅提高了消费者对于化妆品成分标签的关注，也促使了研究人员在成分方面寻求创新。
27.简单的原料复配解决不了胶原蛋白的透皮问题，本发明选用重组人源化胶原蛋白、脱羧肌肽、皱波角叉菜提取物和卵磷脂作为核心有效成分，其中，
28.重组人源化胶原蛋白由重组技术制备的人胶原蛋白特定型别基因编码的全长或
部分氨基酸序列片段，其较动物化胶原蛋白具有高可靠性、高纯度、化学结构确定和低免疫源的特点。重组人源化胶原蛋白与人自身的胶原蛋白高度一致，具有很好的皮肤亲和性且有利于提高皮肤再生速度，恢复皮肤屏障功能。
29.脱羧肌肽是一种咪唑类二肽，相比肌肽能更持久的起效，能够捕捉羟基自由基、单质氧和过氧化氢自由基，具有抗氧化、抗糖化以及协同美白等作用，市场应用前景非常旷阔。
30.皱波角叉菜提取物为纯天然海洋产品，主要包含海藻中的多糖成分，独特肤感，具有促进表皮细胞生长、促进新陈代谢、预防皮肤衰老的作用。
31.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
32.本发明采用的重组人源化胶原蛋白与人自身胶原蛋白高度相似，具有典型的三螺旋结构，较常使用的动物源的胶原蛋白而言来源安全、无刺激性、无毒性，但由于胶原蛋白本身的透皮性和稳定性问题限制了其在化妆品领域中的应用。本发明将重组人源化胶原蛋白与脱羧肌肽、卵磷脂和皱角叉波菜提取物复配制备成脂质体，除了更好的发挥重组人源化胶原蛋白保湿渗透修复的功效外，还可以协同作用，逆转糖基化，深度锁水使角质层保持水润，紧致，从而实现高效抗老。
33.重组人源化胶原蛋白、脱羧肌肽、皱波角叉菜提取物和卵磷脂协同作用，构成脂质体，将脂质体应用于如面霜等化妆品，通过脂质体包裹，载体传输技术，可以帮助有效成分更好的进入肌肤内部。脂质体结构类似于生物膜，具有组织相容性、细胞亲和性、靶向性、缓释控释性等特点，脂质体的双层膜结构可有效的保护被载物，显著增加被载物的稳定性，同时具有更强的促渗作用，可以帮助有效成分更好的进入肌肤内部。
34.本发明的脂质体来源清楚，品质可靠，安全温和，对皮肤无刺激性。
35.本发明的脂质体较之其他成分修护皮肤屏障，淡化皱纹，抗衰老效果好。
36.人群测试结果表明本发明脂质体具有保湿、抗皱、紧致效果。
附图说明
37.图1为体外皮肤活检中iv型胶原的表达图像；
38.图2为体外皮肤活检中xvii型胶原的表达图像；
39.图3为体外皮肤活检中i型胶原的表达图像；
40.图4为体外皮肤活检中iii型胶原的表达图像；
41.图5为皮肤水合评价结果；
42.图6为tewl评价结果；
43.图7为鱼尾纹减少评价；
44.图8为皮肤紧实度改善评价；
45.图9为皮肤感官评价结果。
具体实施方式
46.下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
47.本发明采用的原料均为市售产品，例如
48.重组人源化胶原蛋白可选用成都远睿生物技术有限公司(fws0003c)、赛尔瑞成
(北京)生命科学技术有限公司(pf1103)等企业市售的iii型胶原蛋白；
49.脱羧肌肽可选用上海珈得尔化学技术有限公司(jd200619141622)、西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司(sml0329)等企业市售的脱羧肌肽；
50.皱波角叉菜提取物可选用北京灵宝科技有限公司(p0125952)、陕西健肽生物科技有限公司(zr-00448)等企业市售的皱波角叉菜提取物；
51.卵磷脂可选用广州市奥源贸易有限公司(adm3100)、revere(232-307-2)等企业市售的卵磷脂；
52.实施例1-3
53.一种具有抗皱紧致功效的脂质体，按表1的重量百分含量配比备料：
54.表1实施例1-3的原料组分配比
55.中文标准名实施例1实施例2实施例3去离子水余量余量余量重组人源化胶原蛋白0.1％0.5％1％脱羧肌肽0.01％0.1％0.3％皱波角叉菜提取物0.01％0.2％0.35％卵磷脂1.2％5％7.5％
56.上述各实施例脂质体的制备方法，包括以下步骤：
57.(1)将皱波角叉菜提取物和卵磷脂溶解于乙醇中，震荡溶解，至溶液呈透明状，配得油相膜材溶液；
58.(2)将步骤(1)中油相膜材溶液于35℃恒温下减压除去乙醇，至反应器壁内侧形成一层透明薄膜，干燥10min，得到干燥物；
59.(3)将重组人源化胶原蛋白、脱羧肌肽溶解于ph6.8的磷酸缓冲液中，配得水相活性磷酸缓冲液；
60.(4)将步骤(3)中的水相活性磷酸缓冲液加入步骤(2)得到的干燥物中，35℃下常压旋转震荡水合脱膜；
61.(5)脱膜完全后超声5-20min，过滤后得到粒径为0.1-0.5μm的抗老功效脂质体。
62.对所得脂质体性能进行检测：
63.体外皮肤免疫染色评价：评估真皮层中i型和iii型胶原的表达增加。
64.用直径6mm的打孔器(pfm医疗)从整形外科手术中获得皮肤活检，将其置于含dmem 1g/l葡萄糖(lonza)和ham's-f12(lonza)(1:1)的培养基培养，辅以10％的fbs(gibco)，2mm的l-谷氨酰胺(lonza)和100μg/ml的primocin*(invivogen)。
65.皮肤活检，一式两份，分别用pbs(lonza)(作为对照组)和1％的混合物(即将实施例2得到的脂质体溶解在水中得到质量百分比浓度为1％的水溶液，作为实验组)处理，每天两次，持续48小时。将20μl的水溶液(对照组和实验组)应用于活检的顶部。组织切片中的i型、iii型、iv型和xvii型胶原用特异性一抗处理。用荧光色素标记的二抗来识别一抗。在fluoromount-g*(electron microscopy sciences)上安装切片。借助nis-ar采集软件(尼康)，用eclipse ni-e显微镜和ds-fi3相机获取图像。用volocity*图像分析软件(improvision)分析照片，可选择真皮-表皮交界区。获得的结果是该选定区域的绿色像素强度的总和。
66.如图1-4所示，分别为体外皮肤活检中i型、iii型、iv型和xvii型胶原的表达(ns：不显著，***：高度显著，**：非常显著，*：经student’s t测验显著)
67.通过免疫染色(volocity*图像分析)对人体皮肤活检模型的i型和iii型胶原水平进行分析，用1％混合物(即上述实验组)/不用1％混合物(即上述对照组)处理，每天两次，持续48小时。如图3-4所示，经过活性处理的体外皮肤显示出更好的绿色免疫染色，这代表真皮层中i型和iii型胶原的表达增加。
68.应用实例1-3
69.将实施例2制得的脂质体用于制备精华液，具体如下：
70.按下表2的重量百分比备料：
71.表2应用实例1-3和对照例1的原料组分配比
[0072][0073][0074]
应用实例1-3所示精华液的制备工艺流程如下所示：
[0075]
(1)a相制备：加入一定量的去离子水至烧杯中，水浴加热至恒温90℃，依次加入edta二钠和卡波姆，搅拌至完全溶解。
[0076]
(2)d相制备：烧杯中依次加入脂质体和胆固醇(胆固醇的加入量与脂质体中卵磷脂重量比例为1：4)，搅拌至各组分分散均匀。
[0077]
(3)将d相缓慢倒入a相中，3000r/min混合均质3分钟。
[0078]
(4)二者混合均匀后，降温至45℃时，依次加入c相的羟苯甲酯、苯氧乙醇和羟苯乙酯以及b相的10％氢氧化钠水溶液，3000r/min均质3分钟使其分散完全，得到精华液。
[0079]
对照例1的精华液的制备工艺流程如下所示：
[0080]
(1)a相制备：加入一定量的去离子水至烧杯中，水浴加热至恒温90℃，依次加入edta二钠和卡波姆，搅拌至完全溶解。
[0081]
(2)混合均匀后，降温至45℃时，依次加入c相的羟苯甲酯、苯氧乙醇和羟苯乙酯以及b相的10％氢氧化钠水溶液，3000r/min均质3分钟使其分散完全，得到精华液。
[0082]
将所得精华液进行.skin hydration value皮肤水分值和tewl皮肤经皮失水性能检测如下：
[0083]
在24名亚洲受试者(包括男性和女性)身上进行了6小时的双盲对照研究，研究对象为应用实例1(即图5-6中5％混合物)和对照例1(即图5-6中安慰剂)的对比。受试者均为干性皮肤，前臂外侧的水份值低于40。测试区以随机方式使用测试产品(5％混合物即应用
实例1所得精华液和对照例1所得精华液即安慰剂)，用量为2mg/cm2。测试时间点为t0、t1、t6(小时)。皮肤水分值由corneometer cm825(courage+khazaka)测量，皮肤经皮失水(tewl)值由tewameter tm300(courage+khazaka)测量。根据数据是否呈正态分布，采用student氏t测验(单侧)或wilcoxon符号秩检验(单侧)。
[0084]
如图5所示，使用5％混合物1h时含水量为0.61，使用安慰剂1h时含水量为-1.85，皮肤含水量增加(0.61-(-1.85))/1.85*100％＝133％。使用5％混合物6h时含水量为2.5，使用安慰剂6h时含水量为1.49，皮肤含水量增加(2.8-1.49)/1.49*100％＝68％。可见，含5％混合物配方在使用后的1小时和6小时，皮肤含水量显著增加了133％和68％以上，具有高度的方向性意义。如图6所示，与安慰剂相比，含5％混合物配方降低了经表皮失水(tewl)，修复了皮肤屏障功能。
[0085]
应用实例4-6
[0086]
将实施例2制得的脂质体用于制备面霜，具体如下：
[0087]
按下表3的重量百分比备料：
[0088]
表3应用实例4-6和对照例2的原料组分配比
[0089][0090]
应用实例4-6的面霜的制备工艺流程如下所示：
[0091]
(1)a相制备：加入一定量的去离子水于烧杯，依次加入edta二钠、鲸蜡基羟乙基纤维素和丁二醇，搅拌至各组分完全溶解。
[0092]
(2)b相制备：取表3中b相各个组分置于75～80℃的水浴锅中慢速搅拌30min左右，直到b相全部溶解，得到b相。
[0093]
(3)d相制备：烧杯中依次加入各种原料，其中胆固醇的加入量与脂质体中卵磷脂重量比例为1：4，搅拌至各组分分散均匀。
[0094]
(4)将b相倒入混合料a相中，在75～80℃下快速搅拌25～30min，然后开始降温，至
40～45℃时加入c、d相。继续降温至30～35℃停止搅拌，得到面霜。
[0095]
对照例2的面霜的制备工艺流程如下所示：
[0096]
(1)a相制备：加入一定量的去离子水于烧杯，依次加入edta二钠、鲸蜡基羟乙基纤维素和丁二醇，搅拌至各组分完全溶解。
[0097]
(2)b相制备：取表3中b相各个组分置于75～80℃的水浴锅中慢速搅拌30min左右，直到b相全部溶解，得到b相。
[0098]
(3)d相制备：烧杯中依次加入d相各种原料，搅拌至各组分分散均匀。
[0099]
(4)将b相倒入混合料a相中，在75～80℃下快速搅拌25～30min，然后开始降温，至40～45℃时加入c、d相。继续降温至30～35℃停止搅拌，得到面霜。
[0100]
将应用实例4所得面霜进行皮肤皱纹减少和紧实度改善评价性能检测如下：
[0101]
30位35-59岁的亚洲男性和女性受试者进行了为期28天的随机、双盲和分脸测试。所有受试者皮肤都存在细纹、松弛，缺乏弹性现象。受试者自行在面部涂抹面霜，用量为2mg/cm2，每天三次，分别在早上、中午和晚上。并于实验室接受三次测试：在d0、d7和d28。用visia-cr测量皮肤皱纹。用cutometer(courage&khazaka)测量皮肤弹性和紧实度。通过mpa 580软件从测量曲线的不同部分计算出许多有趣的参数。根据数据是否为正态分布，进行student’s t测验(单侧)或wilcoxon符号秩检验(单侧)。
[0102]
如图7所示为鱼尾纹减少评价结果；图8为皮肤紧实度改善评价结果；图中安慰剂即为对照例2所得面霜，5％混合物即为应用实例4所得面霜，由图7可看出，使用5％混合物，在d7和d28时，鱼尾纹面积远远小于使用安慰剂。由图8可以看出，d7时5％混合物皮肤的粘性弹性q3值为0.0392，安慰剂q3值为0.0209，皮肤的粘性弹性增长(0.0392-0.0209)/0.0209*100％＝88％。d28时5％混合物q3值为0.0232，安慰剂q3值为0.0079，皮肤的粘性弹性增长(0.0232-0.0079)/0.0079*100％＝194％。从图中可以看出，皮肤紧实度改善的评价结果是正向的。例如，皮肤的粘性弹性q3在7天后增加了88％，28天后增加了194％，有统计学上的显著差异，这表明5％混合物配方可以改善皮肤的紧实度，如图8所示。
[0103]
将应用实例4进行皮肤感官评价如下：
[0104]
由20位感官评价专家在手背上进行了双盲随机对比试验。直径5cm的圆形区域为评价区。左右两边的样本量均为50ul。专家们参照标准量表，对每个阶段的皮肤感受进行评分。
[0105]
对配方的质地进行评价，包括涂抹过程中的延展性、水润感和清爽感(涂抹15圈)，涂抹后的丝滑感(0分钟)和涂抹后的光泽度(0、5分钟)。
[0106]
20名经过培训的小组成员对5％混合物即应用实例4所得面霜与安慰剂即为对照例2所得面霜的质地进行了评估，包括涂抹过程中的延展(spreadability)性、保湿感(hydration feel)和清爽感(fresh feel)(涂抹15圈)、涂抹后的丝滑感(slipperiness)(0分钟)以及涂抹后的光泽度(gloss)(0、5分钟)。如图9所示，其中，(ns：不显著，p》0.1，
△
：定向，0.05《p《0.1，*：显著，p《0.05，**：非常显著，p《0.01，***：高度显著，p《0.005，****：极其显著，p《0.001)。5％混合物配方涂抹过程中的延展性、保湿感和清爽感较好。与安慰剂相比，使用0和5分钟后的皮肤光泽度有所改善。易于涂抹和良好的丝滑感意味着消费者在使用产品时的阻力较小，从而减少使用含该混合物产品时的机械压力。