一种用于甲状腺未分化癌的药物组合物和应用的制作方法

1.本发明涉及甲状腺癌的药物领域，具体涉及一种用于甲状腺未分化癌的中西医结合的药物组合物。


背景技术：

2.甲状腺癌是内分泌系统最常见的恶性肿瘤。全球发病率以每年3.6%的增幅上升，成为增长速度最快的恶性肿瘤之一。2018年全国肿瘤登记年报显示，我国甲状腺癌发病率为13.17/10万，女性发病率为20.28/10万，在恶性肿瘤和女性恶性肿瘤中分别是第7位和第4位，是增长速度最快的恶性肿瘤之一。
3.在甲状腺癌中，甲状腺未分化癌（anaplastic thyroid carcinoma，atc）是一种恶性程度最高的甲状腺癌，其中位生存时间仅为4-10月，其5年生存率仅为7%，疾病特异性死亡率达100%，是所有实体肿瘤中预后最差的恶性肿瘤。尽管目前对于甲状腺未分化癌治疗的方法不断更新，包括手术治疗、化疗、放疗、靶向治疗以及免疫治疗等，都无法有效改善atc的预后，其总生存时间不到12个月。
4.索拉非尼（sorafenib, sor）是一种经典的braf抑制剂，也是多靶点激酶抑制剂，它可通过阻断由raf/mek/erk介导的细胞信号传导通路而直接抑制肿瘤细胞的增殖，还可通过抑制vegfr和血小板衍生生长因子(pdgf)受体而阻断肿瘤新生血管的形成,间接地抑制肿瘤细胞的生长。但是，在一项日本的临床试验发现，sor未能显著改善患者的客观缓解率和无进展生存期，其原因在于atc具有非常复杂的分子基础，单一的sor治疗可能容易出现耐药抵抗，这已成为影响sor治疗atc患者，持续延长生存时间的最大障碍。因此，如何逆转atc对sor的抵抗，增加对其的敏感性和反应率，已成为了临床atc治疗亟待解决的重要难题。
5.中医药作为我国得天独厚的重要资源，中西医药联合疗法也已越来越受到重视，在对重大疾病及并发症的防治中显示了独特的疗效，因此深入研究其作用机理具有极为重要的意义。我们从天然产物库中筛选出能够显著逆转sor耐药，同时联用能协同增敏的天然中药分子：棕矢车菊素。目前，在甲状腺未分化癌中，还未有棕矢车菊素和索拉非尼联合使用的报道。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种治疗甲状腺未分化癌的中西医结合的药物组合物，药物组合物包括棕矢车菊素和索拉菲尼，该药物组合物联用协同结果好，能显著促进甲状腺未分化癌细胞的死亡。
7.为了实现上述的发明目的，本发明采用了以下的技术方案：一种用于甲状腺未分化癌的药物组合物，所述的药物组合物包括棕矢车菊素和酪氨酸激酶抑制剂，酪氨酸激酶抑制剂是索拉菲尼。
8.作为优选，棕矢车菊素的浓度是20-160μm，索拉非尼的浓度是2-20μm。进一步的，
棕矢车菊素和索拉非尼的浓度比是20:1。
9.作为优选，甲状腺未分化癌细胞系包括8505c、cal62、khm-5m和c643。棕矢车菊素从艾叶中提取。
10.上述的药物组合物在制备预防和/或治疗甲状腺未分化癌药物中的应用。
11.采用了上述技术方案的用于甲状腺未分化癌的药物组合物，中药原料是棕矢车菊素，西药是酪氨酸激酶抑制剂索拉菲尼。该药物组合物联用协同结果好，能显著促进甲状腺未分化癌细胞的死亡，且副作用低。
附图说明
12.图1：甲状腺未分化癌细胞系（8505c、cal62、c643、khm-5m）在棕矢车菊素和索拉非尼中的ic50情况示意图；图2：compusyn药物联用证明jac和sor联用具有显著的协同作用示意图；图3：棕矢车菊素、索拉非尼组合使用和单用细胞凋亡率的对比示意图；图4：棕矢车菊素、索拉非尼组合使用和单用细胞克隆实验示意图；图5：棕矢车菊素、索拉非尼组合使用和单用肿瘤体积、重量的对比示意图；图6：棕矢车菊素、索拉非尼组合可以被z-devd、z-ietd逆转示意图；图7：蛋白印迹实验示意图。
具体实施方式
13.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清查、完整的描述，进而进一步解释发明。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例。给予本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
14.本发明的中药原料是棕矢车菊素，一般是由艾叶提取制备而成，具有瘫痪痈疽，瘰疬结核等疾的作用，本发明实验的棕矢车菊素和索拉菲尼均为市售产品，棕矢车菊素是t3824，索拉菲尼是t0093，均购自上海陶术生物科技有限公司。
15.实验方法：药物来源1.甲状腺未分化癌细胞系的获得和培养。
16.8505c从德国微生物菌种保藏中心（dsmz）获得， khm-5m、c643、cal62从中国细胞系资源库（中国上海）购买。所有的细胞系均在含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的rpmi-1640培养基中培养，在37%，含5%co2的培养箱中培养。
17.2.cck8细胞活力实验检测棕矢车菊素、索拉菲尼在甲状腺未分化癌细胞系中的ic50值。
18.甲状腺未分化癌细胞植入96孔板(每孔4000个细胞)，然后在处理前在37
°
c, 5% co2培养箱中培养24小时。然后，用不同浓度的棕矢车菊素(0、20、40、60、80、100、120、140、160和200μ m)、索拉非尼(0、1、2、4、6、8、10、15、20和30μ m)处理细胞24 h。另一端，以dmso (1 μ l/ml或以下)作为对照培养的载药溶剂。在测试点，每个孔中分别添加10
µ
l的cck-8和90
µ
l的含10% fbs的rpmi 1640培养基，然后在37
°
c、5% co2下培养近2 h，然后使用synergy lx multi-mode reader (biotek instruments, usa)在450nm波长下检测od(光密度)。
19.3.compusyn药物联用通过compusyn平台，设定不同比例的棕矢车菊素浓度（0，20，40，80，120及160μm）和索拉非尼浓度（0，2，4，6，10及20μm）组合，药物组合作用24h后 ，通过 cck8细胞活力检测实验考察各个药物组合对甲状腺未分化癌细胞的作用情况，通过该平台计算其不同组合下的药物协同指数。
20.4.甲状腺未分化癌细胞死亡率的测定细胞死亡采用annexin v-fitc和pi试剂盒(liankebio，中国)，按照制造商说明进行检测。将8505c (1.8
×
105细胞/孔)接种于6孔板，完全附着后用不同药物处理。37℃孵育24 h后，取附着细胞和漂浮细胞，用冰冷pbs冲洗2次，然后用1
×
结合缓冲液悬浮。用1
µ
l annexin v-fitc和2
µ
l pi标记细胞，室温暗培养5min。用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，用flowjo测定细胞死亡率。
21.5.甲状腺未分化癌细胞集落形成的检测将8505c细胞(20000细胞/孔)分别接种于6孔板中，37℃培养1周，分别用nc组，棕矢车菊素80μ m组，索拉非尼4μ m组以及棕矢车菊素80μm +索拉非尼4μ m联用组处理。存活的菌落用乙醇固定，0.1%结晶紫染色后分析。
22.6.体内裸鼠移植瘤实验雌性裸鼠(balb/c, 16-20 g, 3-4周龄)购自中国上海史莱克生物技术公司，饲养于中国浙江省人民医院实验动物中心，昼夜循环12h，免费提供食物和水。小鼠皮下注射单个8505c细胞悬液(4
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106细胞/100
µ
l)。移植1周后，将小鼠随机分为不同组(n = 6/组)，分别以5% dmso + 40% peg300 + 10% tween80和45% ddh2o, 100μl/只小鼠，棕矢车菊素 (100 mg/kg)溶于5% dmso + 40% peg300 + 10% tween80和45% ddh2o, 索拉非尼 (10 mg/kg)溶于同一溶剂。每天腹腔注射，连续14天。每隔一天记录肿瘤体积和体重。异种移植瘤体积(mm3)计算公式为:0.5
ꢀ×
(最短直径)2
ꢀ×
(最长直径)。实验结束后，处死所有小鼠，对解剖后的异种移植组织称重。所有动物实验均按照浙江省人民医院动物伦理委员会(iacuc-a20220051)批准的实验规程进行。
23.7．蛋白印迹实验在药物处理后24h收集细胞，使用含pmsf的western和ip裂解缓冲液(p0013号，中国碧时生物技术研究所)冰溶10分钟。使用bca(双二酚酸)蛋白质测定试剂盒(美国赛默飞世尔科学公司)定量测定总蛋白浓度。蛋白样品用sds-page预制tris-gly凝胶(4-20%，# p0524m，中国beyotime生物技术研究所)分解，然后转移到pvdf膜上。将膜用含5%脱脂牛奶的1% tween-20的tbst阻断1小时。随后，将膜与相应的一抗在4℃下孵育一夜，然后用合适的二抗与hrp偶联在室温下孵育60分钟。用fdbio
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dura ecl试剂盒(#fd8020, fdbio science，中国)分析膜，并用chemidoc-mp成像仪(bio-rad，美国)成像。用imagej软件量化条带密度。
24.实验结果棕矢车菊素和索拉非尼对不同的甲状腺未分化癌的ic50情况。
25.如图1a所示，显示棕矢车菊素在甲状腺未分化癌细胞中的ic50分别是：8505c 94.9μm, cal62 198.5μm, c643 187.0μm,khm-5m 68.8μm,以上结果说明棕矢车菊素单独作用在甲状腺未分化癌中的抗癌作用较差，同时结果显示，随着棕矢车菊素的剂量逐渐增
加，其对甲状腺未分化癌细胞的作用逐渐趋于稳定，平均抑制在50%左右，不再随着剂量增加而逐渐增加抗癌效果。如图1b所示，显示索拉非尼在甲状腺未分化癌细胞中的ic50分别是：8505c 9.01μm, cal62 7.89μm, c643 10.65μm,khm-5m 6.48μm，以上结果说明索拉非尼单独作用时，在安全剂量内（≤4μm），其对甲状腺未分化癌的作用较差，但随着剂量增加，其对甲状腺未分化癌细胞的抗癌作用增加，但在高剂量下，相应副作用也会显著增加，这也限制其在临床中的使用。
26.compusyn药物联用证明jac和sor联用具有显著的协同作用。
27.通过compusyn平台，对甲状腺未分化癌细胞（8505c、cal62、khm-5m、c643）的棕矢车菊素和索拉非尼的药物协同作用进行考察，在甲状腺未分化癌中均有显著的作用。
28.如图2a所示，在甲状腺未分化癌细胞8505c中，当棕矢车菊素浓度在20-160μm范围内，索拉非尼浓度在2-20μm时，具有明显的协同作用。如图2b所示，在甲状腺未分化癌细胞cal62中，当棕矢车菊素浓度在40-160μm范围内，索拉非尼浓度在2-6μm和20μm时，具有明显的协同作用。如图2c所示，在甲状腺未分化癌细胞khm-5m中，当棕矢车菊素浓度在20-160μm范围内，索拉非尼浓度在2
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20μm时，具有明显的协同作用。如图2d所示，在甲状腺未分化癌细胞c643中，当棕矢车菊素浓度在20-160μm范围内，索拉非尼浓度在20μm时，具有明显的协同作用。
29.通过细胞流式检测棕矢车菊素和索拉非尼联用导致甲状腺未分化癌死亡的能力。
30.通过图2中的联用协同结果以及药物治疗的毒副作用，确定棕矢车菊素80μm和索拉非尼4μm的联用组合。在甲状腺未分化癌中8505c和cal62中，该联用组合显著促进甲状腺未分化癌细胞的死亡，而同时单用棕矢车菊素或索拉非尼，并未能导致甲状腺未分化癌细胞死亡。如图3a所示，在甲状腺未分化癌细胞8505c中，棕矢车菊素80μm和索拉非尼4μm联用，其细胞凋亡率57.1%，显著高于棕矢车菊素（14.4%）和索拉非尼（4.4%）单用组。如图3b所示，在甲状腺未分化癌细胞cal62中，棕矢车菊素80μm和索拉非尼4μm联用，其细胞凋亡率45.2%，显著高于棕矢车菊素（4.1%）和索拉非尼（4.2%）单用组。在甲状腺未分化癌细胞khm-5m中，棕矢车菊素80μm和索拉非尼4μm联用，其细胞凋亡率44.4%，显著高于棕矢车菊素（27.1%）和索拉非尼（4.9%）单用组。在甲状腺未分化癌细胞c643中，棕矢车菊素80μm和索拉非尼4μm联用，其细胞凋亡率24.3%，显著高于棕矢车菊素（11.5%）和索拉非尼（4.4%）单用组。
31.细胞克隆形成实验，如图4所示，也验证了棕矢车菊素和索拉菲尼联用时的效果显著由于单用效果。
32.动物实验中，我们设定了不同浓度的棕矢车菊素和索拉菲尼组，以及两者联用组，在小鼠中对甲状腺未分化癌移植瘤的治疗作用。相较单用组，棕矢车菊素和索拉非尼联用组具有显著的抑制甲状腺未分化癌移植瘤的作用，虽然单纯用药组也有一定的抑制效果，但是其抑制移植瘤的效果显著劣于联用组。如图5所示，在甲状腺未分化癌裸鼠移植瘤中，棕矢车菊素和索拉非尼联用组的肿瘤体积、重量显著小于单用组，说明联用对肿瘤的抑制具有显著的协同作用。
33.如图6所示，棕矢车菊素和索拉非尼联用时，可以被caspase 3抑制剂（z-devd）和caspase 8抑制剂（z-ievd）明显逆转，说明在甲状腺未分化癌中，棕矢车菊素和索拉非尼联用主要经由caspase 3和caspase 8介导。
34.如图7所示，蛋白印迹实验再次证明棕矢车菊素和索拉菲尼联用，其导致caspase 3、caspase 8 和parp切割明显增加，相较单用组，进一步说明棕矢车菊素和索拉菲尼联用具有明显的协同增强作用，具有非常强的杀死甲状腺未分化癌细胞的作用。