1.本发明属于医用金属表面生物活化改性技术领域，涉及一种钛基医用种植体表面生物活性涂层的制备技术，具体涉及一种钛基种植体表面梯度载钴胞状纳米纤维涂层的制备方法。
背景技术：
2.临床迫切需要具有抗菌活性、血管生成活性和成骨活性的多功能钛基骨植入物，可通过加入适当的无机生物活性元素来实现。本研究开发了钴掺杂钛表面的纳米纤维涂层，具有分层的微/纳米结构。涂层对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的定植和生长均有显著抑制作用，无细胞毒性。此外，涂层可刺激小鼠骨髓干细胞关键血管生成因子的表达，显著增强msc成骨分化。具有抗菌、血管生成和成骨活性的多功能载钴纳米纤维涂层是一种很有前途的骨科和牙科钛种植涂层，可提高临床性能。钛(ti)由于其优良的生物相容性和高的耐腐蚀性，被广泛应用于生产关节假体、骨折固定装置和牙科种植体等骨植入装置。然而，钛本身没有抗菌活性，细菌可以在其上附着并定植形成生物膜，这些生物膜坚韧且对抗菌治疗具有高度耐药性，通常会导致持续感染和植入失败。通过杀死最初附着的细菌，使种植体具有抗菌性，从而能够阻止生物膜在其上形成，被认为是对抗种植体相关感染的有效措施。
3.钛种植体需要增加的另一个方面是骨整合。骨种植体长期正常功能的基础是与骨/种植体表面密切接触的刚性骨整合。虽然钛基骨植入在健康患者中的成功率高达95%，但它们仍然表现出缺乏生物活性，这可能会导致寿命受损和植入失败，特别是当遇到一些复杂的情况，不利于骨整合的建立，如骨质疏松症。一般认为间充质干细胞(mesenchymal stem cells, mscs)在种植体/骨的整合中起关键作用。大部分定植于种植体表面形成骨的成骨细胞起源于mscs。为了实现良好的骨整合，关键是种植体能够优先促进间充质干细胞向成骨细胞分化。此外，理想的骨整合过程还需要良好的新生血管形成，这不仅为新骨形成提供营养供应，而且有助于骨髓间充质干细胞在种植体表面的远处归巢成骨。事实上，良好的血管化也有利于预防感染。
4.常见的表面改性方法有溶胶-凝胶、阳极氧化、微弧氧化、气相沉积、离子注入以及激光或等离子体熔覆等技术。每种改性技术有各自的特点，但对于复杂形貌钛种植体表面而言，比如在边缘处或孔洞内均难以成膜。
技术实现要素：
5.本发明要解决的技术问题是提供一种梯度载钴纳米纤维涂层的制备方法，该方法首先采用水热工艺使钛表面原位生长出多孔胞状na2ti4o9纳米纤维涂层，然后在特定的水热环境下对复相层进行二次水热处理。
6.为解决上述技术问题，本发明包括以下步骤：1）钛基纳米纤维涂层的水热制备
将经前处理的纯钛样品浸泡在一种碱性混合溶液中，在240℃～250℃的条件下进行水热处理5～7小时，纯钛表面即原位生长出多孔胞状纳米纤维涂层；2）梯度载钴纳米纤维涂层的水热制备将浓度为1mm~1m的cocl2•
6h2o溶液注入水热反应釜中，溶液填充度为30~40%，并将一次水热试样再次置于水热反应釜中，在100~200℃的条件下进行二次水热处理2~6小时，得到钴元素原子百分含量为4.52~8.28%的梯度载钴纳米纤维涂层。
7.所述步骤1）中碱性混合溶液由naoh溶液和过氧化氢按照体积比1：4配制。所述naoh溶液的摩尔浓度为3～5m，过氧化氢的质量分数为30%。
8.所述步骤1）具体为：将经前处理的纯钛样品浸泡在一种碱性混合溶液中进行一次水热处理，溶液填充度为35%，钛基体表面即可原位生长出由成簇的长纤维聚集环绕而成的均匀的多孔胞状纳米纤维，孔内相互连通，形成多层次的三维结构，微米级的多孔状结构植入到人体组织内将有利于营养物质的吸收和输送，并且环状的多孔壁为细胞粘附提供了足够的黏着斑接触面积，有利于细胞粘附。
9.所述步骤2）具体为：将cocl2•
2h2o溶液注入水热反应釜中，溶液填充度为30～40%，并将一次水热试样置于水热反应釜中，进行二次水热处理，得到均匀铺满钛基体表面的胞状载钴纳米纤维，纤维形貌较步骤1）没有明显改变，但成分发生了改变，涂层表面的干细胞比钛基体表面的体型大、伪足多、铺展得平，显著促进细胞的粘附和生长，该涂层钴元素原子百分含量为4.52~8.28%，具有梯度载钴量，可适应不同抗菌要求的环境。
10.本发明具有以下有益效果本发明解决了梯度载钴纳米纤维涂层的制备难题，通过简单易行的二步水热法实现了钛种植体表面纳米纤维活性涂层的构建，浸入溶液中的各个表面，其涂层的构建是均匀一致的，无死角和遮蔽部位。
11.本发明制备的纳米纤维涂层，涂层与基体之间无不连续界面，具有很高的结合强度。
12.高比表面积的纳米纤维结构增强了表面润湿性，参阅图6-8，促进了表面羟基化，由成簇的长纤维聚集环绕而成的均匀的多孔胞状纳米纤维，孔内相互连通，形成多层次的三维结构，微米级的多孔状结构植入到人体组织内将有利于营养物质的吸收和输送，并且环状的多孔壁为细胞粘附提供了足够的黏着斑接触面积，有利于细胞粘附，细胞实验可见，小鼠间充质干细胞在载钴纳米纤维涂层上培养48小时后，相较与钛基体（参见图10），细胞边缘有大量的细丝状伪足出现（参阅图11），明显提高钛基体的生物活性。
13.本发明制备的载钴na2ti4o9纳米纤维涂层显著提高了钛基植入体在生理盐水中的耐腐蚀性能，相对于钛基体和na2ti4o9纳米纤维涂层载钴na2ti4o9纳米纤维涂层的腐蚀电位正移，腐蚀电流密度降低，其电化学腐蚀tafel参阅图5，可保证植入体在体内的长期稳定性。
14.本发明制备的载钴na2ti4o9纳米纤维涂层具有很强的接触杀菌能力，参阅图7；在生理盐水中能持久而均衡地释放活性钴离子co
2+
，参阅图9，使涂层具有持续均衡的抗菌活性；同时，所制备的载钴纳米纤维涂层具有4.52~8.28% 的梯度钴原子百分含量，可适应不同抗菌要求的环境。
15.本发明配制的水热溶液成分简单，易于控制，不含易分解成分，且工艺稳定；采用
简单易行的复合二步水热法，在纯钛表面制备载钴na2ti4o9纳米纤维抗菌活性涂层。本发明工艺简单，生产成本低。
附图说明
16.下面结合附图对本发明的具体实施方式做进一步详细描述：图1本发明载钴na2ti4o9纳米纤维涂层（实施例1）的表面形貌sem照片和能谱eds数值；图2本发明载钴na2ti4o9纳米纤维涂层（实施例1）的截面形貌sem照片；图3本发明载钴na2ti4o9纳米纤维涂层（实施例1）表面光电子能谱xps全谱图；图4本发明载钴na2ti4o9纳米纤维涂层（实施例1）表面钴元素的xps高分辨谱图。
17.图5本发明载钴na2ti4o9纳米纤维涂层（实施例1）电化学腐蚀tafel图；图6钛基体接触角图；图7本发明na2ti4o9纳米纤维涂层（实施例1）的接触角图；图8本发明载钴na2ti4o9纳米纤维涂层（实施例1）的接触角图；图9本发明载钴na2ti4o9纳米纤维涂层（实施例1）在10ml生理盐水中的离子析出icp谱图；图10与小鼠间充质干细胞共培养 48 小时后，钛基体表面细胞生长sem形貌照片；图11与小鼠间充质干细胞共培养 48 小时后，本发明载钴na2ti4o9纳米纤维涂层（实施例1）表面细胞生长sem形貌照片；图12与金黄色葡萄球菌共培养24小时后，钛基体表面粘附金黄色葡萄球菌涂布细菌培养板图。
18.图13与金黄色葡萄球菌共培养24小时后，本发明na2ti4o9纳米纤维涂层表面粘附金黄色葡萄球菌涂布细菌培养板图。
19.图14与金黄色葡萄球菌共培养24小时后，本发明载钴na2ti4o9纳米纤维涂层（实施例1）表面粘附金黄色葡萄球菌涂布细菌培养板图。
具体实施方式
20.为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
21.应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
22.实施例1经前处理的钛片正面朝上置于高压反应釜底部，将5m的naoh溶液和过氧化氢按1：
4的体积比混合注入釜中，溶液填充度为35%，在240℃进行7小时的第一步水热处理，得到由成簇的长纤维聚集环绕而成的均匀多孔胞状三维结构；将浓度为100mm的cocl2•
6h2o溶液注入水热反应釜中，溶液填充度为40%，并将一次水热试样再次置于水热反应釜中，在200℃的条件下进行二次水热处理4小时，纳米纤维形貌较第一步水热处理没有明显改变，但成分发生了改变，其表面微观形貌sem和eds参阅图1，截面微观形貌sem参阅图2，钴元素原子百分比为7.957%，使用光电子能谱测试涂层的元素价态，钴以二价离子状态存在， xps全谱图参阅图3，钴元素高分辨谱图参阅图4；用自动划痕涂层测试仪测定了涂层与钛基体的结合强度，该涂层剥落处对应的临界载荷为42.05 n。使用电化学工作站测试涂层的耐蚀性，在生理盐水中的腐蚀电压为0.074v，较钛基体（-0.465 v）和na2ti4o9纳米纤维仿生涂层（-0.269 v）均显著正移，腐蚀电流密度为1.408
×
10-9 ma cm-2
，较钛基体（3.477
×
10-6 ma cm-2
）和na2ti4o9纳米纤维仿生涂层（7.072
×
10-8 ma cm-2
）均显著降低，耐生物腐蚀性高，涂层的电化学腐蚀tafel图参阅图5；使用接触角测量仪测试涂层的亲水性，接触角为9.4
°
，较钛基体（57.3
°
）明显降低，涂层亲水性好，参阅图6、 图7和图8。试样在10ml生理盐水中浸泡2d、4d、7d、14d、21d后，使用电感耦合等离子-原子发射光谱测试涂层的离子析出，结果显示涂层中的co
2+
可均衡持续释放，21天析出量为1.85925ppm，在10ml生理盐水中离子析出状况参阅图9。与细胞共培养 48 小时后，涂层(图11)表面相对于钛基体(图10)表面可显著促进小鼠间充质干细胞的黏附和生长，涂层与钛基体表面细胞生长sem形貌照片参阅图10、图11；以金黄色葡萄球菌（s. aureus） 为革兰氏阳性菌模型，在与载钴涂层共培养 24 小时后，涂层表面黏附的金黄色葡萄球菌数量显著降低，接触杀菌率达99%以上，金葡菌涂布细菌培养板状况参阅图12、 图13和图14。
23.实施例2经前处理的钛片正面朝上置于高压反应釜底部，将4m的naoh溶液和过氧化氢按1：4的体积比混合注入釜中，溶液填充度为35%，在245℃进行6小时的第一步水热处理，得到多孔胞状纳米纤维涂层；将浓度为1m的cocl2•
6h2o溶液注入水热反应釜中，溶液填充度为35%，并将一步水热得到的多孔胞状纳米纤维涂层浸泡入溶液中，在150℃的条件下对其进行4小时第二步水热处理，纳米纤维形貌没有明显改变，成分发生了改变，钴元素原子百分比为8.28%。使用接触角测量仪测试涂层的亲水性，接触角为9.47
°
，较钛基体（57.3
°
）明显降低，涂层亲水性好。
24.实施例3经前处理的钛片正面朝上置于高压反应釜底部，将3m的naoh溶液和过氧化氢按1：4的体积比混合注入釜中，占空比35%，在250℃进行5小时的第一步水热处理，得到多孔胞状纳米纤维涂层；将浓度为100mm的cocl2•
6h2o溶液注入水热反应釜中，溶液填充度为37%，并将一步水热得到的多孔胞状纳米纤维涂层浸泡入溶液中，在200℃的条件下对其进行2小时第二步水热处理，纳米纤维形貌没有明显改变，成分发生了改变，钴元素原子百分比为7.78%。使用接触角测量仪测试涂层的亲水性，接触角为8.82
°
，较钛基体（57.3
°
）明显降低，涂层亲水性好。
25.实施例4将浓度为1m的cocl2•
6h2o溶液注入水热反应釜中，溶液填充度为40%，并将实施例1一步水热样品浸泡入溶液中，在150℃的条件下对其进行6小时第二步水热处理，纳米纤维
形貌没有明显改变，成分发生了改变，钴元素原子百分比为7.46%。使用接触角测量仪测试涂层的亲水性，接触角为8.3
°
，较钛基体（57.3
°
）明显降低，涂层亲水性好。
26.实施例5将浓度为10mm的cocl2•
6h2o溶液注入水热反应釜中，溶液填充度为40%，并将实施例1一步水热样品浸泡入溶液中，在150℃的条件下对其进行2小时第二步水热处理，纳米纤维形貌没有明显改变，成分发生了改变，钴元素原子百分比为7.293%。使用接触角测量仪测试涂层的亲水性，接触角为 8.27
°
，较钛基体（57.3
°
）明显降低，涂层亲水性好。
27.实施例6将浓度为100mm的cocl2•
6h2o溶液注入水热反应釜中，溶液填充度为40%，并将实施例1一步水热样品浸泡入溶液中，在150℃的条件下对其进行6小时第二步水热处理，纳米纤维形貌没有明显改变，成分发生了改变，钴元素原子百分比为7.243%。使用接触角测量仪测试涂层的亲水性，接触角为8.19
°
，较钛基体（57.3
°
）明显降低，涂层亲水性好。
28.实施例7将浓度为1m的cocl2•
6h2o溶液注入水热反应釜中，溶液填充度为40%，并将实施例1一步水热样品浸泡入溶液中，在150℃的条件下对其进行2小时第二步水热处理，纳米纤维形貌没有明显改变，成分发生了改变，钴元素原子百分比为7.193%。使用接触角测量仪测试涂层的亲水性，接触角为7.78
°
，较钛基体（57.3
°
）明显降低，涂层亲水性好。
29.实施例8将浓度为100mm的cocl2•
6h2o溶液注入水热反应釜中，溶液填充度为40%，并将实施例1一步水热样品浸泡入溶液中，在100℃的条件下对其进行6小时第二步水热处理，纳米纤维形貌没有明显改变，成分发生了改变，钴元素原子百分比为7.06%。使用接触角测量仪测试涂层的亲水性，接触角为7.22
°
，较钛基体（57.3
°
）明显降低，涂层亲水性好。
30.实施例9将浓度为100mm的cocl2•
6h2o溶液注入水热反应釜中，溶液填充度为40%，并将实施例1一步水热样品浸泡入溶液中，在150℃的条件下对其进行2小时第二步水热处理，纳米纤维形貌没有明显改变，成分也发生了改变，钴元素原子百分比为7.053%，使用接触角测量仪测试涂层的亲水性，接触角为7.11
°
，较钛基体（57.3
°
）明显降低，涂层亲水性好。
31.实施例10将浓度为1m的cocl2•
6h2o溶液注入水热反应釜中，溶液填充度为40%，并将实施例1一步水热样品浸泡入溶液中，在100℃的条件下对其进行6小时第二步水热处理，纳米纤维形貌没有明显改变，成分发生了改变，钴元素原子百分比为6.97%，使用接触角测量仪测试涂层的亲水性，接触角为 7.0
°
，较钛基体（57.3
°
）明显降低，涂层亲水性好。
32.实施例11将浓度为1mm的cocl2•
6h2o溶液注入水热反应釜中，溶液填充度为40%，并将实施例1一步水热样品浸泡入溶液中，在100℃的条件下对其进行4小时第二步水热处理，纳米纤维形貌没有明显改变，成分发生了改变，钴元素原子百分比为5.9%，使用接触角测量仪测试涂层的亲水性，接触角为 6.75
°
，较钛基体（57.3
°
）明显降低，涂层亲水性好。
33.实施例12将浓度为0.1mm的cocl2•
6h2o溶液注入水热反应釜中，溶液填充度为40%，并将实施
例1一步水热样品浸泡入溶液中，在100℃的条件下对其进行4小时第二步水热处理，纳米纤维形貌没有明显改变，成分发生了改变，钴元素原子百分比为4.523%，使用接触角测量仪测试涂层的亲水性，接触角为 6.41
°
，较钛基体（57.3
°
）明显降低，涂层亲水性好。
34.实施例可以例举许多，限于篇幅，这里不一一列出。
35.以上方法得到的双层结构涂层，其特征在于：内层（与基体毗邻）为致密结构；表层为载钴na2ti4o9纳米纤维生物活性抗菌涂层，呈多孔胞状，纤维直径约为60～70纳米。该双层结构涂层与基体之间无不连续界面，具有高的结合强度，亲水性好，耐生物腐蚀性强，促进细胞的黏附和生长，具有很强的接触杀菌能力。同时，本发明还构建了一种钴原子百分含量4.52~8.28% 的梯度载钴纳米纤维仿生涂层，可适应不同抗菌要求的环境。