杜鹃素在制备抗脑缺血再灌注损伤药物中的应用

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1.本发明涉及医药技术领域及脑血管疾病治疗领域。具体是一种化合物杜鹃素在制备抗脑缺血再灌注损伤药物方面的应用。


背景技术：

2.缺血性脑卒中是导致死亡和长期残疾的主要原因，在世界范围内构成严重的社会经济负担。目前被广泛接受的治疗策略是尽快重建血流，包括机械取栓和静脉重组组织型纤溶酶原激活剂(rtpa)给药。但由于缺血再灌注损伤，仍有部分患者在血管及时再通后发生脑损伤。目前很多学者发现，神经元死亡、活性氧产生及神经炎症的发生是脑缺血再灌注损伤的重要原因。但目前并没有有效的兼顾这些方面的治疗脑缺血再灌注损伤药物。
3.杜鹃素(farrerol，far)是一种从满山红及其他杜鹃属植物中提取的天然黄酮类化合物，现已人工合成。far可以抑制nfκb途径、mapk途径的激活，从而抑制炎症反应的发生。还可以抑制nrf2的激活，减少ros的产生。鉴于其抗炎的作用，目前far主要用来进行关节炎、慢性支气管炎、抗菌、乳腺炎、阿尔兹海默症中炎症治疗方面的研究，临床应用主要局限在祛痰作用。目前，国内外现有技术中并没有关于far促进神经元存活的药理机制，更未披露far用于治疗脑缺血再灌注损伤。


技术实现要素：

4.本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺点，通过对杜鹃素药理作用的研究，寻求杜鹃素(far)在制备治疗脑缺血再灌注损伤药物中的作用。
5.为了实现上述目的，本发明提供一种杜鹃素在制备抗脑缺血再灌注损伤药物中的应用，杜鹃素能够促进缺血再灌注后神经元的存活并抑制炎症反应。
6.所示杜鹃素的化学结构式如下：
[0007][0008]
本发明使用短暂性大脑中动脉闭塞(tmcao)模型，离体糖氧剥夺再/灌注(ogd/r)损伤模型分别在小鼠和细胞中模拟缺血再灌注损伤，在造模成功后使用far处理，发现：
[0009]
(1)针对缺血再灌注小鼠，在恢复血流的同时给予40mg/kg剂量的far，能够有效减少小鼠脑梗死面积，改善卒中小鼠运动神经功能表现；可以有效抑制小胶质细胞的激活，减少炎性因子产生，减轻神经炎症反应；
[0010]
(2)针对缺血再灌注神经元，在恢复糖氧供给的同时给予20um浓度的far，可以明显提高神经元的存活数量；
[0011]
(3)针对缺血再灌注小胶质细胞系bv2细胞，far以20um浓度预处理1h后进行ogd处理，可以减少炎性因子的产生。
[0012]
本发明通过体内实验发现far能够显著减轻脑缺血再灌注损伤。杜鹃素能够促进缺血再灌注后神经元的存活并抑制炎症反应。通过体外实验发现，杜鹃素一方面通过抑制炎性信号的传导抑制脑卒中后的神经炎症；另一方面，杜鹃素抑制ros产生及促进环磷腺苷效应元件结合蛋白(creb)的激活作用，直接促进缺血再灌注后神经元的存活。
[0013]
本发明与现有技术相比，开发了far的一种新用途，far能够减轻脑缺血再灌注损伤，具有低毒、副作用小等特点，可以工业合成，价格低廉，为临床减轻脑缺血再灌注损伤提供新的手段与方法。
附图说明：
[0014]
图1为本发明涉及的实施例1使用激光多普勒血流仪进行血流监测的结果示意图，其中a为多普勒血流示意图，b为血流统计图。
[0015]
图2为本发明涉及的实施例1在体动物水平far治疗缺血再灌注实验结果示意图，其中a为小鼠脑梗死体积示意图；b为梗死体积统计图；c为小鼠神经功能评分结果。
[0016]
图3为本发明涉及的实施例2在体动物水平far对小鼠缺血性脑卒中过程中小胶质细胞激活情况的影响实验结果示意图，其中a为far对炎性因子的影响；b为far对小胶质细胞活化程度的影响；c为far对小胶质细胞分枝长度的影响；d为far对小胶质细胞分枝数量的影响。
[0017]
图4为本发明涉及的实施例3离体细胞水平far对ogd/r处理神经元存活的影响实验结果示意图，其中a为cck8检测结果；b为ldh释放检测结果。
[0018]
图5是本发明涉及的实施例4离体细胞水平far减少ogd/r后神经元ros的产生的结果，其中，a为神经元ros染色代表图，b为ros平均荧光强度统计图。
[0019]
图6是本发明涉及的实施例5离体细胞水平far促进ogd/r后神经元存活的机制的结果，其中，a为免疫印迹检测结果；b为creb的mrna转录水平；c为creb所调控基因mrna转录水平。
[0020]
图7是本发明涉及的实施例6离体细胞水平far减少ogd/r后小胶质细胞炎性因子产生的结果。
[0021]
图8是本发明涉及的实施例7离体细胞水平小胶质细胞条件培养基缓解神经元死亡的结果，其中a为实验设计流程图；b为cck8结果图。
具体实施方式：
[0022]
实施例1：
[0023]
本实施例为在体内情况下far对小鼠脑缺血再灌注损伤的治疗效果实验，具体为：
[0024]
实验材料：本实施例使用c57bl/6j小鼠，购买自济南朋悦实验动物繁育有限公司，许可证号：syxk(鲁)20190003；小鼠饲养于青岛大学生物医学中心实验动物平台，适应性饲养7天后开展实验。杜鹃素(far)购买自陶术生物(货号t6s0525)，以50mg/ml浓度溶于dmso冷冻于-80℃备用。
[0025]
实验方法：12只老鼠分为实验组(tmcao+far)和对照组(tmcao+vec)，使用线栓法制作短暂性大脑中动脉闭塞(tmcao)模型，缺血1.5h后拔出线栓进行恢复血流，恢复血流后即刻进行腹腔注射给药，给药剂量40mg/kg。实验组小鼠注射far(以体积比10％far+40％
peg300+5％tween 80+45％h2o配方配制)，对照组小鼠注射相同体积溶剂(以体积比10％dmso+40％peg300+5％tween 80+45％h2o配方配制)。
[0026]
另取6只老鼠作为假手术组(sham)，仅重复模型制作过程，但没有线栓的插入和拔出。
[0027]
各组在模型制作前、模型制作成功后、再灌注后分别使用激光多普勒进行血流监测，验证模型是否制作成功，结果如图1a所示。再灌注24h后，进行行为学评分，并杀灭老鼠取脑进行ttc染色评估far对梗死面积的影响，结果如图2所示。
[0028]
从图1可以看出，激光多普勒血流仪监测tmcao模型制作成功，且实验组与对照组血流无明显差异。从图2a、b可以看出，与对照组相比，实验组的脑梗死面积显著减少，说明far能明显减少小鼠缺血再灌注模型后脑梗死面积。从图2c可以看出，实验组的改良神经功能评分比对照组低，说明far能明显改善小鼠缺血再灌注模型后行为学表现。
[0029]
实施例2：
[0030]
本实施例为在体情况下far对小鼠缺血性脑卒中过程中小胶质细胞激活情况的影响实验。
[0031]
实验材料：同实施例1的实验材料。
[0032]
实验方法：分组及模型制作同实施例1中所述。在再灌注24h后，取脑检测tnfa、1l-1b、1l-6的mrna的表达水平，结果如图3a所示。取脑进行冰冻切片，使用小胶质细胞标记蛋白抗体(anti-iba-1)进行免疫荧光染色，检测小胶质细胞活化情况，如图3b所示。图3c、3d为小胶质细胞分枝终点和分枝长度的统计。
[0033]
从图3可以看出，相对于对照组和假手术组，实验组tmcao小鼠梗死区域炎性因子分泌减少(图3a)，梗死区域脑小胶质细胞活化程度降低(图3b)，tmcao小鼠梗死区域脑小胶质细胞分枝数量和长度增多(图3c-d)。实验结果表明，far能明显改善缺血性脑卒中小鼠脑小胶质细胞的激活，增加了小胶质细胞分枝数目及分枝长度。
[0034]
实施例3：
[0035]
本实施例为离体情况下，far对ogd/r处理神经元存活的影响实验。
[0036]
实验材料：far处理用的far为far/dmso溶液，即将far溶于二甲基亚砜(dmso)，far的浓度为20umol/l；原代皮层神经元提取自孕16天的胎鼠大脑皮层，提取后培养9天进行实验。
[0037]
实验方法：将原代皮层神经元分为4个组，第1组为dmso组，正常培养，给予dmso处理；第2组为far组，正常培养，给予far处理；第3组为ogd/r+dmso组，即进行糖氧剥夺/再灌注(ogd/r)处理，再灌注时给予dmso处理；第4组为ogd/r+far组，即进行ogd/r处理，再灌注时给予far处理。再灌注24h后进行cck8检测、ldh释放检测，结果如图4所示。所述ogd/r实施过程为：ogd过程：移除正常细胞培养基，加入无糖培养基，放入氧气含量0％的厌氧工作站培养1.5小时。再灌注过程：从厌氧工作站中取出细胞，移除无糖培养基，加入正常培养基。根据实验需要，在再灌注后不同时间收集细胞进行检测。
[0038]
从图4可以看出，cck8检测结果显示，与ogd/r+dmso组比较，ogd/r+far组的细胞活性高；ldh释放检测结果显示，与ogd/r+dmso组比较，ogd/r+far组的ldh释放量少。说明，far能够促进ogd/r后神经元的存活。
[0039]
实施例4：
[0040]
本实施例为离体情况下，far对ogd/r后ros产生的影响实验。
[0041]
实验材料：本实施例材料同实施例3。
[0042]
实验方法：将原代皮层神经元分为3个组，分别为dmso组，ogd/r+dmso组，ogd/r+far组；各组处理方法同实施例3。再灌注24h时进行ros染色检测和荧光强度统计，结果如图5所示。
[0043]
从图5可以看出，与ogd/r+dmso组比较，ogd/r+far组的ros少，说明far能够减少ogd/r后神经元ros的产生。
[0044]
实施例5：
[0045]
本实施例为far促进神经元存活的机制研究实验。
[0046]
实验材料：本实施例材料同实施例3。
[0047]
实验方法：本实施例分组及处理同实施例3。在再灌注6h收集细胞进行蛋白免疫印迹检测，结果如图6a所示；再灌注12h收集细胞进行实时荧光定量pcr检测，结果如图6b、6c所示。
[0048]
从图6a可以看出，与ogd/r+dmso组比较，ogd/r+far组的creb表达明显上升说明，far在ogd/r后能够上调creb的表达并促进creb磷酸化激活磷酸化。从图6b可以看出，与ogd/r+dmso组比较，ogd/r+far组的creb转录水平高，说明far在ogd/r后能够上调creb转录水平。从图6c可以看出，与ogd/r+dmso组比较，ogd/r+far组的bdnf和bcl-2的转录水平高，说明far在ogd/r后能够促进脑源性神经营养因子(bdnf)和b细胞淋巴瘤/白血病-2基因(bcl-2)的转录。
[0049]
实施例6：
[0050]
本实施例为far减轻小胶质细胞缺血再灌注后炎症反应研究。
[0051]
实验材料：far处理用的far为far/dmso溶液，即将far溶于dmso，far的浓度为20umol/l。使用小胶质细胞系bv2细胞用来进行炎症反应模型建立。
[0052]
实验方法：将小胶质细胞系bv2细胞分为4组，第1组为dmso组，正常培养，给予dmso处理；第2组为far组，正常培养，给予far处理；第3组为ogd/r+dmso组，即先用dmso对细胞进行预处理1h，然后进行糖氧剥夺/再灌注(ogd/r)处理，再灌注时给予dmso处理；第4组为ogd/r+far组，即先用far对细胞进行预处理1h，然后进行糖氧剥夺/再灌注(ogd/r)处理，再灌注时给予far处理。在第3、4组进行预处理的同时，第1、2组同样保持预处理，保持条件相同；再灌注12h后提取rna进行实时荧光定量pcr检测tnfa、1l-1b、1l-6的mrna的表达水平，结果如图7所示。
[0053]
从图7可以看出，ogd/r+far组的tnfa、1l-1b、1l-6的mrna的表达水平显著低于ogd/r+dmso组；说明far降低了细胞ogd/r处理后小胶质细胞炎性因子的产生。
[0054]
实施例7：
[0055]
本实施例为far减轻的炎症反应对神经元存活的影响实验。
[0056]
实验材料：far的使用、原代皮层神经元、bv2细胞准备如前所述。
[0057]
实验方法：实验流程如图8a所示，即将bv2细胞分为3组，分别为dmso组，ogd/r+dmso组和ogd/r+far组；各组处理方法同实施例6；再灌注12h时收集上清作为条件培养基，分别与神经元共培养24h，随后利用cck8检测神经元活性，结果如图8b所示。
[0058]
从图8b可以看出，与dmso组相比，ogd/r+dmso组用dmso处理的ogd/r模型bv2条件
培养基与神经元共培养，神经元存活率显著降低，而ogd/r+far组的神经元存活率比ogd/r+dmso组高，说明经far处理的ogd/r模型bv2细胞条件培养基能能减少皮层神经元的死亡。