背景技术：
1、乙型肝炎病毒是严格亲肝的含双链dna的病毒。虽然dna是遗传物质，其复制循环涉及反转录步骤以从前基因组rna复制为dna。乙型肝炎病毒被分类为肝脱氧核糖核酸病毒(hepadnaviruses)的一个成员并且属于肝脱氧核糖核酸病毒科。成人初次感染乙型肝炎病毒引起具有器官炎症、发热、黄疸和血液中肝转氨酶升高的症状的急性肝炎。这些不能克服病毒感染的病人在多年内经受慢性疾病过程，具有增加的发展成肝硬化或肝癌的风险。乙型肝炎病毒感染的母亲向新生婴儿的母婴传播也引起慢性肝炎。
2、在被肝细胞摄入之后，核衣壳被转移至核并且释放dna。此时，dna链合成完成并且修复缺口得到共价闭合环状(covalently closed circular)(ccc)的3.2kb的超螺旋dna。cccdna作为四个主要病毒mrna转录的模板，其为3.5、2.4、2.1和0.7kb长。所有的mrna是5’-加帽并且在3’-末端多腺苷酸化。在所有四个mrna的3’-末端存在重叠序列。
3、3.5kb mrna作为用于核心蛋白和聚合酶生产的模板。此外，相同的转录物作为前基因组复制中间体并且允许病毒聚合酶引发反转录为dna。需要核心蛋白用于核衣壳形成。另外，顺序加工活动(sequential processing activity)将一些核心蛋白转化为可分泌的e-抗原。在血液中富含e-抗原与乙型肝炎病毒在肝脏中的复制相关并且作为监测疾病过程的重要诊断标记。
4、2.4和2.1kb mrna携带用于表达病毒大、中和小型表面抗原的开放阅读框pre-s1、pre-s2和s。s-抗原与感染性、完整颗粒相关。另外，感染的患者的血液也含有单独来自s-抗原，不含基因组dna或聚合酶的非感染性颗粒。这些颗粒的功能还未完全知晓。完全和持续的在血液中检测不到s-抗原被认为是乙型肝炎病毒清除，由此成功治愈的可靠指标。
5、0.7kb mrna编码x蛋白。这个基因产物对于病毒基因的有效转录很重要并且也作为宿主细胞基因表达的反式激活蛋白。后者的活性似乎对于在肝癌发展中肝细胞转化很重要。
6、具有超过6个月的在血液中可检测的s-抗原、e-抗原或病毒dna的患者被认为是受到慢性感染。作为反转录酶活性抑制剂的核苷类似物是很多患者的典型的首选治疗选项。拉米夫定(lamivudine)、替诺福韦(tenofovir)或恩替卡韦(entecavir)抑制乙型肝炎病毒的复制，有时达到不可检测的水平。肝功能的改善和肝炎症的减少是最重要的益处。然而，只有很少的患者在治疗结束之后实现完全和持续的缓解。此外，乙型肝炎病毒在增加的治疗持续期间产生药物耐药性。对于同时感染了乙型肝炎病毒和人免疫缺陷病毒的患者而言这是特别困难的。两种病毒都易受核苷类似物药物的影响并且可能共同产生耐药性。
7、第二个治疗选项是给予α-干扰素。在此，患者在6个月期间接受高剂量的α-干扰素。亚洲基因型b有非常不良的反应率。已证明，与丁型肝炎病毒或人免疫缺陷病毒同时感染使得α-干扰素治疗完全无效。有严重肝损伤和严重纤维化症状的患者不能进行α-干扰素治疗。
8、尽管在乙型肝炎病毒治疗领域中有显著进步，仍然存在需要能够在慢性感染的患者中选择性和有效地沉默病毒的基因表达、阻断复制并且连续减少病毒负荷的药剂。
技术实现思路
1、本文所述的是一种能够选择性和有效地减少乙型肝炎病毒(hbv)的表达的hbv特异性rna干扰(rnai)引发分子(也称为rnai药剂、rnai引发剂、或引发剂)，以及其在介导rna干扰以抑制乙型肝炎病毒基因的表达、尤其是抑制与乙型肝炎病毒的复制或致病有关的基因的表达中的应用。各rnai引发剂至少包括一条正义链和一条反义链。正义链和反义链可以彼此部分互补、基本上互补或完全互补。本文所述的rnai引发剂的正义和反义链的长度分别可以为16～30个核苷酸。在一些实施方式中，正义和反义链的长度独立地为17～26个核苷酸。正义和反义链可以是相同长度也可以是不同长度。在递送至表达hbv的细胞后，本文所述的rnai引发剂在体内抑制一种或多种hbv基因的表达。可以在hbv rnai引发剂中使用的hbv rnai引发剂的正义链和反义链的例子列于表1a和1b。hbv rnai引发剂的双链体的例子列于表2。
2、hbv rnai引发剂包括含有第一序列的正义链(过客链)和含有第二序列的反义链(引导链)。在一些实施方式中，正义链包括与乙型肝炎病毒mrna的至少一部分具有至少90％的相同性的核心序列。反义链包括与编码所述乙型肝炎病毒基因的mrna的至少一部分基本上互补的核苷酸序列。在一些实施方式中，互补区域的长度少于30个核苷酸。在一些实施方式中，rnai引发剂双链体的长度在约16～30个核苷酸的范围内。在一些实施方式中，rnai引发剂双链体的长度在约15～25个核苷酸的范围内。在一些实施方式中，hbv rnai引发剂具有约18、19、20、21、22、23或24个核苷酸的双链体长度。例举的互补序列列于表1a和1b。
3、在一些实施方式中，hbv rnai引发剂还包括靶向基团。靶向基团可以连接于hbvrnai引发剂的正义链或反义链的3’或5’末端。在一些实施方式中，靶向基团连接于正义链的3’或5’末端。在一些实施方式中，靶向基团连接于正义链的5’末端。在一些实施方式中，靶向基团包括具有20个或更多的碳原子的疏水基团。在一些实施方式中，疏水基团包括胆固醇或胆固醇基。在一些实施方式中，靶向基团包括半乳糖三聚体。
4、在一些实施方式中，靶向基团通过接头连接于引发剂。合适的接头包括但不限于：-(ch2)n-，其中n为1～10(在一些实施方式中n＝6，即本文所用的c6)，以及-(o-ch2-ch2)n-或-(ch2-ch2-o)n-，其中n＝1～10(在一些实施方式中n＝3，即三乙二醇(teg))。具有或不具有靶向基团的接头可以结合于表1a和1b所示的正义链和/或反义链的5’或3’末端。
5、在一些实施方式中，我们描述了至少两种具有不同序列的hbv rnai引发剂的组合。在一些实施方式中，两种或更多不同的hbv rnai引发剂分别连接于靶向基团。在一些实施方式中，两种或更多不同的hbv rnai引发剂分别连接于胆固醇靶向基团。在一些实施方式中，两种或更多不同的hbv rnai引发剂分别连接于半乳糖三聚体靶向基团。在一些实施方式中，使用两种不同的引发剂时，第一引发剂连接于胆固醇，且第二引发剂连接于半乳糖三聚体。在一些实施方式中，使用两种或更多引发剂时，两种引发剂用相同或相似的接头连接于它们各自的靶向基团。在一些实施方式中，使用两种或更多引发剂时，两种引发剂用不同的接头连接于它们各自的靶向基团。在一些实施方式中，第一靶向基团通过c6接头连接于第一hbv rnai引发剂，且第二靶向基团通过teg接头连接于第二hbv rnai引发剂。在一些实施方式中，第一和第二靶向基团均包括胆固醇或胆固醇基，或者均由胆固醇或胆固醇基组成。在一些实施方式中，第一和第二靶向基团均包括半乳糖三聚体或半乳糖四聚体，或者均由半乳糖三聚体或半乳糖四聚体组成。使用不同的接头可以为引发剂提供更好的差异性和定量分析。
6、在一些实施方式中，描述了用于在体内向肝细胞递送hbv rnai引发剂的组合物，其包括：与靶向基团偶联的hbv rnai引发剂。在一些实施方式中，靶向基团是半乳糖三聚体或胆固醇。
7、在一些实施方式中，描述了用于在体内向肝细胞递送hbv rnai引发剂的组合物，其包括：a)靶向去唾液酸糖蛋白受体(asgpr)的可逆掩蔽的蜂毒肽类似物(mlp)，即mlp递送肽(或简称为递送肽)；以及b)与疏水基团偶联的hbv rnai引发剂，该疏水基团含有至少20个碳原子(rna偶联物)，例如但不限于胆固醇或胆固醇基。分别合成mlp递送肽和rnai引发剂偶联物，并且可贮备在分开的容器或单个容器中。在一些实施方式中，hbv rnai引发剂不与递送肽偶联。
8、在一些实施方式中，我们描述了用于抑制乙型肝炎病毒基因表达的组合物，其包括：a)mlp-(l-t)x，其中，-l-t具有以-co-c(ch3)＝c(t)-cooh或-co-c(t)＝c(ch3)-cooh表示的结构，式中，t包括对去唾液酸糖蛋白受体有亲和性的靶向配体，且x大于mlp的集合的伯胺数量的80％；b)第一hbv rnai引发剂，其包括反义链和正义链，其中，所述反义链包括表1a所列的任意反义序列中的2～15、2～19、1～17、1～21或1～26个核苷酸，且所述正义链包括表1b所列的任意相应正义序列，其通过teg基团与胆固醇基共价连接；以及c)第二hbvrnai引发剂，其包括反义链和正义链，其中，所述反义链包括表1a所列的任意反义序列中的2～15、2～19、1～17、1～21或1～26个核苷酸，且所述正义链包括表1b所列的任意相应正义序列，其通过c6基团与胆固醇基共价连接。在一些实施方式中，表1b所列的任意正义链核苷酸序列可以具有chol-teg或chol-c6的5’或3’修饰。
9、在一些实施方式中，将一种或多种所述hbv rnai引发剂和任选的mlp递送肽在药学上可接受的载体或稀释剂中给予哺乳动物。在一些实施方式中，所述哺乳动物是人。在一些实施方式中，rnai引发剂和递送肽在给予哺乳动物之前在溶液中组合。在一些实施方式中，将递送肽和rnai引发剂在分开的溶液中共同给予哺乳动物。在一些实施方式中，将递送肽和rnai引发剂依次给予哺乳动物。就依次给药而言，所述递送肽可在给予所述rnai引发剂之前给予。或者，对于依次给予，所述rnai引发剂可在给予所述递送肽之前给予。
10、使用乙型肝炎病毒rnai引发剂来提供与hbv感染相关的疾病/病症的治疗性和/或预防性的治疗方法。所述hbv rnai引发剂介导rna干扰以抑制乙型肝炎病毒的复制和/或致病所需的一种或多种基因的表达。具体来说，hbv rnai引发剂在细胞、组织或哺乳动物中抑制病毒聚合酶、核心蛋白、表面抗原、e-抗原和/或x蛋白。hbv rnai引发剂可以用于治疗乙型肝炎病毒感染。hbv rnai引发剂也可以用于治疗或预防与乙型肝炎病毒感染相关的慢性肝脏疾病/病症、炎症、纤维化症状和增殖性疾病如癌症。在一些实施方式中，序列的长度至少为13个毗连核苷酸。该方法包括将hbv rnai引发剂给予被hbv感染的人或动物。还描述了用于在体内向肝细胞递送hbv rnai引发剂的组合物。
11、在一些实施方式中，所述hbv rnai引发剂任选地与一种或多种其它的(即第二、第三等)治疗剂组合。第二治疗剂可以是另一种hbv rnai引发剂(如靶向hbv基因组中的不同序列的hbv rnai引发剂)。其它治疗剂也可以是小分子药物、抗体、抗体片段和/或疫苗。包含或不包含一种或多种其它治疗剂的hbv rnai引发剂可以与一种或多种赋形剂组合，以形成药物组合物。
12、包括一种或多种hbv rnai引发剂的药物组合物可以通过多种途径给药，取决于是需要局部治疗还是全身治疗。给药可以是但不限于静脉内给药、动脉内给药、皮下给药、腹膜内给药、经皮给药(如通过植入器械)和软组织内给药。
13、所述hbv rnai引发剂和/或组合物可以应用于hbv感染或者由hbv感染引起的疾病或症状的治疗性治疗方法。该方法包括将本文所述的hbv rnai引发剂给予对象、如人或动物对象。
14、除非另外定义，否则，本文中所使用的所有技术和科学术语都具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的同样含义。虽然在本发明的实施或测试中可以采用类似于或等同于本文所述的那些方法和材料，但是，下面描述了合适的方法和材料。本文中述及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都通过引用全文纳入本文。在抵触的情况下，以本说明书(包括定义在内)为准。此外，材料、方法和实施例都仅是说明性，并不旨在构成限制。
15、从以下详细描述结合附图，本发明的其它目的、特征和优点将会变得显而易见。