焦棓酸在制备抗马链球菌兽疫亚种药物中的应用

1.本发明属于兽药技术领域，具体涉及焦棓酸在制备抗马链球菌兽疫亚种药物中的应用。


背景技术：

2.猪链球菌(ss)是一种重要的人兽共患病病原菌，根据荚膜多糖的差异可将猪链球菌分为33种血清型，可感染猪和人，导致败血症、脑膜炎、肺炎、关节炎甚至死亡。目前，控制细菌性传染病的重点以预防为主，兼以抗生素治疗。然而，随着抗生素的大量、不合理使用，导致细菌的耐药性非常严重。
3.临床实验数据显示，不同国家和地区分离的猪链球菌都出现了不同程度的耐药性。意大利学者cucco分离的猪链球菌中，61.5％的菌株对两种抗生素产生了耐药性，29.5％的菌株对三种抗生素产生了耐药性。加拿大学者arndt检测了379株猪链球菌的耐药情况，发现大部分菌株对四环素、泰妙菌素、壮观霉素均耐药。荷兰学者vanhout从临床分离到的1163株猪链球菌中，有78.4％对四环素耐药、48.1％对克林霉素耐药。我国学者对临床分离的34株猪链球菌进行耐药分析，发现91.18％的菌株呈多重耐药，82.3％～100.0％的菌株对磺胺类药物耐药、79.4％～94.1％的菌株对氨基糖苷类药物耐药、88.2％～97.1％的菌株对四环素类药物耐药、79.4％～85.3％林可胺类药物耐药、50％～88.2％的菌株对大环内酯类药物耐药。因此，寻找新的抗生素替代物、开发新型抗菌药物或发现逆转抗生素耐药的化合物是解决抗生素耐药问题的关键途径。
4.焦棓酸(分子量为126.11，分子式：c6h6o3)是天然的多酚类化合物，提取自黄栌的茎，具有抗感染、抗真菌等生物学功能，它还是一种还原剂，能够产生自由基，特别是超氧阴离子。目前据文献报道，焦棓酸对鲍曼不动杆菌、沙门氏菌、恶臭假单胞菌、创伤弧菌等具有抑菌作用，但是对尖孢镰刀菌、青霉菌、白色念珠菌等真菌无效。此外，大肠杆菌可以高效合成焦棓酸，浓度可达到1800
±
100mg/l(huo yx,ren h,yu h,et al.cipa-mediating enzyme self-assembly to enhance the biosynthesis of pyrogallol in escherichia coli.applmicrobiolbiotechnol.2018；102(23):10005-10015.)，据此推测，焦棓酸对大肠杆菌不敏感，也就是说焦棓酸对大肠杆菌没有抑制作用。
5.克林霉素是一种林可胺类抗生素，主要抗菌作用机制是与细菌核糖体50s亚基相结合，抑制肽链延长，从而抑制了细菌蛋白质的合成。克林霉素通常用于治疗以下细菌的感染，包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球状菌、链球菌(粪肠道球菌除外)、肺炎球菌、拟杆菌属等。


技术实现要素：

6.本发明要解决的技术问题是克服现有猪链球菌耐药性严重的问题，提供焦棓酸在制备抗马链球菌兽疫亚种药物中的应用。
7.本发明的另一个目的在于提供了一种抗马链球菌兽疫亚种的组合物，即焦棓酸组
合物，所述的焦棓酸组合物包括：焦棓酸、克林霉素。
8.本发明的最后一个问题在于提供焦棓酸组合物在制备治疗或预防马链球菌兽疫亚种病药物中的应用。本发明提供的组合物对马链球菌兽疫亚种有很好的抑菌和杀菌作用，在马链球菌兽疫亚种病的防治方面具有很好的应用前景。
9.为实现上述目的，本采取以下技术方案：
10.焦棓酸在制备抗马链球菌兽疫亚种(s.equi subsp.zooepidimicus)药物中的应用，包括以本发明的组合物为有效成分或有效成分之一，用于制备治疗或预防马链球菌兽疫亚种病的药物，用于抑制体外的马链球菌兽疫亚种的生长，或者直接灭杀马链球菌兽疫亚种。
11.一种焦棓酸组合物，所述的焦棓酸组合物包括：焦棓酸、克林霉素；所述的焦棓酸、克林霉素的质量比为1:0.0625-1，所述的焦棓酸结构式如下：
[0012][0013]
焦棓酸组合物在制备治疗或预防马链球菌兽疫亚种病药物中的应用，包括以本发明的组合物为有效成分或有效成分之一，用于制备治疗或预防马链球菌兽疫亚种病的药物，用于抑制体外的马链球菌兽疫亚种的生长，或者直接灭杀马链球菌兽疫亚种。
[0014]
以上所述的组合物，优选的，组合物中的组分对于马链球菌兽疫亚种最佳质量比为：焦棓酸：克林霉素＝1：0.25；分级抑菌浓度指数0.5，焦棓酸与克林霉素对马链球菌兽疫亚种具有协同抑菌作用。
[0015]
与现有技术相比，本发明具有以下优点和效果：
[0016]
本发明首次发现焦棓酸可以抗马链球菌兽疫亚种，同时本发明首次提供了焦棓酸与克林霉素具有协同抑菌的作用，并且该组合物可用于抗马链球菌兽疫亚种。本发明通过多种方法研究证实了焦棓酸与克林霉素组合物对马链球菌兽疫亚种有很好的抗菌效果，为研制抗马链球菌兽疫亚种病的新型药物奠定了理论基础，乃至为抗生素替代物发掘提供了候选物质，在猪链球菌病的防治方面具有很好的应用前景。
[0017]
克林霉素与焦棓酸联合用药后，分别降低了克林霉素的抑菌浓度和焦棓酸的抑菌浓度，联合用药的分级抑菌浓度指数(fici)指数为0.5，两者具有协同抑菌作用(协同抑菌作用，fici≤0.5；相加作用，0.5《fici≤1；无关作用，1《fici≤2；拮抗作用，fici》2)。因此，焦棓酸可以逆转马链球菌兽疫亚种对克林霉素的耐药性，克林霉素与焦棓酸组合物有望成为新型的防治马链球菌兽疫亚种病的生物活性分子，为耐药性马链球菌兽疫亚种的防治提供解决方案，在马链球菌兽疫亚种病的防治方面具有很好的应用前景，而且为焦棓酸组合物成为抗生素替代物的推广应用提供了理论基础。
附图说明
[0018]
图1为焦棓酸单体的化学结构。
具体实施方式
[0019]
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
[0020]
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。本发明实施例以马链球菌兽疫亚种atcc35246株为例进行说明，其他的马链球菌兽疫亚种本发明所述物质对其也具有抑制和杀灭作用。
[0021]
本发明以下实施例的统计学分析：所有试验至少3次独立重复。
[0022]
实施例1：
[0023]
焦棓酸对马链球菌兽疫亚种最小抑菌浓度和最小杀菌浓度测定：
[0024]
1、材料
[0025]
mueller-hinton(mh)肉汤(购自bd公司)，用于药物敏感实验，检测药物的抑菌效力。
[0026]
2、试验方法
[0027]
用无菌接种环挑取纯化的马链球菌兽疫亚种菌落，充分分散于mh液体培养基，配置成5
×
105cfu/ml的标准菌悬液；
[0028]
用mh液体培养基倍比稀释后不同浓度的焦棓酸溶液分别加到无菌的96孔聚苯乙烯板中，第1至第10孔加焦棓酸溶液，每孔50μl，第11孔加mh液体培养基50μl作为生长对照，第12孔只加mh液体培养基100μl作为阴性对照。
[0029]
向第1至第11孔中加50μl标准菌悬液，37度孵育16-20h，观察有无细菌生长，判断mic值。吸取每孔菌液，涂布mh平板中，没有菌落生长则为mbc值。
[0030]
3、结果
[0031]
由表1可知，当焦棓酸浓度为64μg/ml时，其对马链球菌兽疫亚种生长具有抑制作用，当焦棓酸浓度为64μg/ml时，其对马链球菌兽疫亚种具有杀菌作用。
[0032]
表1焦棓酸对马链球菌兽疫亚种的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度
[0033][0034]
实施例2：
[0035]
克林霉素对马链球菌兽疫亚种最小抑菌浓度和最小杀菌浓度测定：
[0036]
1、材料
[0037]
mueller-hinton(mh)肉汤(购自bd公司)，用于药物敏感实验，检测药物的抑菌效力。
[0038]
2、试验方法
[0039]
用无菌接种环挑取纯化的马链球菌兽疫亚种菌落，充分分散于mh液体培养基，配置成5
×
105cfu/ml的标准菌悬液；
[0040]
用mh液体培养基倍比稀释后不同浓度的克林霉素溶液分别加到无菌的96孔聚苯乙烯板中，第1至第10孔加克林霉素溶液，每孔50μl，第11孔加mh液体培养基50μl作为生长
对照，第12孔只加mh液体培养基100μl作为阴性对照。
[0041]
向第1至第11孔中加50μl标准菌悬液，37度孵育16-20h，观察有无细菌生长，判断mic值。吸取每孔菌液，涂布mh平板中，没有菌落生长则为mbc值。
[0042]
3、结果
[0043]
由表2可知，当克林霉素浓度为32μg/ml时，其对马链球菌兽疫亚种生长具有抑制作用；当克林霉素浓度为64μg/ml时，其对马链球菌兽疫亚种具有杀菌作用。
[0044]
表2克林霉素对马链球菌兽疫亚种的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度
[0045][0046]
实施例3：
[0047]
焦棓酸与克林霉素对马链球菌兽疫亚种协同抑菌作用：
[0048]
1、材料
[0049]
mueller-hinton(mh)肉汤(购自bd公司)，用于药物敏感实验，检测药物的抑菌效力。
[0050]
2、试验方法
[0051]
无菌接种环挑取纯化的猪链球菌p1/7、猪链球菌7型、猪链球菌9型、马链球菌兽疫亚种、猪链球菌sc19的菌落，过夜摇菌后转接，分别充分分散于mh液体培养基，配置成5
×
105cfu/ml的标准菌悬液；
[0052]
在无菌的96孔聚苯乙烯板每排第2到10孔每孔用排枪加入50μl mh液体培养基，在第1、2孔加入4倍mic浓度的焦棓酸溶液，用排枪吹打混匀后自第二孔吸出50μl加入第三孔，依次类推，吹打混匀倍比稀释，在11孔吸出50μl弃去。第12孔加mh液体培养基50μl作为生长对照，其中每列所含焦棓酸浓度一致。
[0053]
用mh液体培养基分别根据不同菌株对克林霉素的mic值，稀释不同浓度的克林霉素溶液于无菌4ml ep管中，最大浓度为4倍mic浓度。第2排浓度为第1排浓度的一半，依次类推，计算8排所加克林霉素的浓度并配置好相应溶液，随后将50μl溶液加入96孔聚苯乙烯板，每排抗生素浓度一致。
[0054]
此时96孔聚苯乙烯板中每孔均包含不同浓度的克林霉素与焦棓酸溶液，每排溶液克林霉素浓度相同，第1到第8排浓度呈倍比递减；每列溶液中所含的焦棓酸溶液浓度相同，第1列到第10列浓度呈倍比递减。
[0055]
向每排第1至第10孔与第12孔中加50μl标准菌悬液，加完后96孔每孔加入50μl或100μl mh培养基，使每孔溶液总体系为200μl。每排第11孔为阴性对照，仅有焦棓酸与克林霉素溶液；第12孔为生长对照，仅有标准菌液。
[0056]
将96孔聚苯乙烯板37度孵育16-20h，观察有无细菌生长，并根据抗生素与化合物最小联合抑菌浓度计算出其协同抑菌指数。
[0057]
3、结果
[0058]
由表3可知，当焦棓酸与克林霉素联用时，焦棓酸浓度为16μg/ml，克林霉素浓度为4μg/ml，其对马链球菌兽疫亚种的生长具有抑制作用，分级抑菌浓度指数为0.5，说明焦棓
酸与克林霉素具有协同抑菌作用。fici计算公式：fici＝a药联用时的mic/a药单用时的mic+b药联用时的mic/b药单用时的mic。而该组合物对其他的猪链球菌，并没有协同抑菌的作用。
[0059]
表3焦棓酸联合克林霉素对猪链球菌的最小抑菌浓度及分级抑菌浓度指数
[0060][0061]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。