尿石素B酰胺类衍生物的应用

尿石素b酰胺类衍生物的应用
技术领域
1.本发明属于医药领域，具体为尿石素b酰胺衍生物在制备预防机体衰老药物中的应用。


背景技术：

2.阿尔茨海默症(ad)是被公认为最为常见的与认知衰退有关的神经性疾病，ad是一种神经退行性障碍，其中的痴呆程度会随着人体年龄的衰老程度逐渐恶化。
3.机体的衰老都与线粒体自噬功能障碍、基因组的不稳定性，端粒酶的缩短，蛋白质稳态平衡失调，细胞活力功能的退化有着必不可少的联系。由于ad形成的机制不明，由老年斑的沉积推到aβ(淀粉样蛋白β)，而淀粉样蛋白β的形成有众多可能形成的原因。目前在临床上针对预防衰老引起的阿尔茨海默症使用的试验药品如胆固醇抑制剂以及胆碱酯酶抑制剂等最多只能使得病情不再恶化，还没有可以完全治疗的药物和方法。由于ad的病因尚未明确，研究也缺少较好的动物模型。而线虫作为模式生物，在衰老方面有着其他实验生物都不具备的优点:秀丽隐杆线虫(caenorhabditis elegans，c.elegans)作为一种模式生物，在20℃营养丰富的条件下从卵发育为成虫仅需3天，其基因与人类的相关基因具有60％-80％的高度保守性，其实验结果对人类预防抗衰老的效果起到重要的提示作用；由于线虫的生长周期短，短期内可使用大量的样本量线虫用于实验，实验结果可信；线虫在神经退行性疾病的研究中，容易获得理想的疾病缺陷型体系模型，其身体透明，易于表型特征的观察和检测，具有完整的神经、运动和生殖系统，细胞间的相互协调作用使得线虫构成了前进、后退、群体趋向性等丰富的运动行为，使得在有关疾病的模型研究中很容易对线虫在遗传学和药理学上进行操作，为对于预防和探索神经退化性疾病的发病机制和治疗方法具有重要意义。
4.鞣花单宁(ellagitannin)是目前存在于某些水果、坚果以及植物中的多元酚类化合物，鞣花单宁属于可水解的单宁化合物类别，其经人体经肠道菌群代谢成更容易吸收的尿石素类物质，尿石素是由鞣花酸失去一个内酯环，并逐步脱去羟基的过程。鞣花酸失去内酯环首先得到尿石素m5，尿石素m5在不同位置脱去羟基后得到单羟基尿石素b。专利号cn 113387916公开了尿石素b以及酰胺化的衍生物的制备方法。如果发现一种新型的尿石素类抑制剂可以有效地来改善认知功能，或改善认知能力，甚至治疗认知障碍，那么它对抗衰老领域做出有价值的贡献。
5.尿石素b及酰胺类衍生物命名和化学结构如下：
6.7.8.9.

技术实现要素：

10.在上述背景下，本发明公开了尿石素b酰胺类衍生物的抗衰老应用，其目的在于提供尿石素b酰胺衍生物在抗衰老药物方面的新用途。
11.为了实现上述发明的目的，本发明采取了如下的技术方案。
12.尿石素b酰胺类衍生物的应用，所述的尿石素b酰胺类衍生物为如下两个化合物：
13.14.所述两种化合物用于制备抗衰老药物。
15.尿石素b的酰胺衍生物的应用，所述的两种化合物用于治疗或预防线粒体活性下降有关的神经退行性疾病的药物。
16.尿石素b的酰胺衍生物的应用，所述的两种化合物用于制备延长线虫寿命的药物。
17.进一步地，所述的线虫为秀丽隐杆线虫。
18.进一步地，所述两种化合物20μm时，抗衰老效果明显。
19.本发明的技术方案具有以下优点：
20.1、在较低的剂量和浓度下，能观察到尿石素b酰胺衍生物比尿石素b对秀丽隐杆线虫的寿命具有明显的延长作用，能够延缓秀丽隐杆线虫的衰老过程；该方法操作简单，效果优势。
21.2、秀丽隐杆线虫的运动行为和应激能力再次表明了尿石苏b酰胺衍生物具有明显的延长寿命的效果，进而延缓衰老，对深远的医学应用具有良好的应用价值和意义。
22.3、本发明为尿石素b及其酰胺衍生物在抗衰老药物中的应用提供了一定的理论依据，为今后药品的开发奠定了良好的基础。
附图说明
23.图1为不同浓度尿石素b作用下对线虫健康寿命的影响。其中，(a)为不同浓度的尿石素b线虫生存曲线(b)为不同浓度的尿石素b线虫平均寿命。
24.图2为20μm尿石素b及酰胺类衍生物作用下对线虫寿命的影响。其中(a)为20μm的尿石素b线虫生存曲线(b)为20μm n-己基-2-(6-氧-6h-苯[c]苯并吡喃-3-yl)氧)乙酰胺线虫生存曲线(c)为20μm正丁基-2-((6-氧代-6h-苯并[c]苯并吡喃-3-基)氧基)乙酰胺线虫生存曲线(d)为20μm 2-((6-氧代-6h-苯并[c]苯并吡喃-3-基)氧基)-n-((四氢呋喃-2-基)甲基)乙酰胺线虫生存曲线(e)为20μm 2-((6-氧代-6h-苯并[c]苯并吡喃-3-基)氧基)-n-(2-(噻吩-2-基)乙基)乙酰胺线虫生存曲线(f)为20μm n-(呋喃-2-基甲基)-2-(6-氧代-6h-苯并[c]苯并吡喃-3-基)氧基)乙酰胺线虫生存曲线(g)为20μm n-苄基-2-((6-氧代-6h-苯并[c]苯并吡喃-3-基)氧基)乙酰胺线虫生存曲线(h)为20μm n-(环己基甲基)-2-(6-氧代-6h-苯并[c]苯并吡喃-3-基)氧基)乙酰胺线虫生存曲线(i)为20μm n-((5-甲基呋喃-2-基)甲基)-2-(6-氧代-6h-苯并[c]苯并吡喃-3-基)氧基)乙酰胺线虫生存曲线(j)为20μm n-(3-氯-5-氟苄基)-2-(6-氧代-6h-苯并[c]苯并吡喃-3-基)氧基)乙酰胺线虫生存曲线(k)为20μm n-(2-(苄氧基)乙基)-2-(6-氧代-6h-苯并[c]苯并吡喃-3-基)氧基)乙酰胺线虫生存曲线(l)为20μm 2-((6-氧代-6h-苯并[c]苯并吡喃-3-基)氧基)-n-(吡嗪-2-基甲
基)乙酰胺线虫生存曲线(m)为20μm 2-((6-氧代-6h-苯并[c]苯并吡喃-3-基)氧基)-n-(2-(吡啶-2-基)乙基)乙酰胺线虫生存曲线(n)20μm 2-((6-氧代-6h-苯并[c]苯并吡喃-3-基)氧基)-n-(2-(哌啶-1-基)乙基)乙酰胺线虫生存曲线(o)为20μm尿石素b平均寿命(p)为20μm尿石素b和酰胺衍生物线虫平均寿命。
[0025]
图3为第4，8，12天20μm尿石素b及71g，71k酰胺衍生物对线虫运动行为的影响。其中(a)为第4天20μm尿石素b身体弯曲(b)为第4天20μm n-(环己基甲基)-2-(6-氧代-6h-苯并[c]苯并吡喃-3-基)氧基)乙酰胺和2-((6-氧代-6h-苯并[c]苯并吡喃-3-基)氧基)-n-(吡嗪-2-基甲基)乙酰胺身体弯曲(c)为第4天20μm尿石素b头部摆动(d)为第4天20μm n-(环己基甲基)-2-(6-氧代-6h-苯并[c]苯并吡喃-3-基)氧基)乙酰胺和2-((6-氧代-6h-苯并[c]苯并吡喃-3-基)氧基)-n-(吡嗪-2-基甲基)乙酰胺头部摆动(e)为第8天20μm尿石素b身体弯曲(f)为第8天20μm n-(环己基甲基)-2-(6-氧代-6h-苯并[c]苯并吡喃-3-基)氧基)乙酰胺和2-((6-氧代-6h-苯并[c]苯并吡喃-3-基)氧基)-n-(吡嗪-2-基甲基)乙酰胺身体弯曲(g)为第8天20μm尿石素b头部摆动(h)第八天20μm n-(环己基甲基)-2-(6-氧代-6h-苯并[c]苯并吡喃-3-基)氧基)乙酰胺和2-((6-氧代-6h-苯并[c]苯并吡喃-3-基)氧基)-n-(吡嗪-2-基甲基)乙酰胺头部摆动(i)为第12天20μm尿石素b身体弯曲(j)为第12天20μm n-(环己基甲基)-2-(6-氧代-6h-苯并[c]苯并吡喃-3-基)氧基)乙酰胺和2-((6-氧代-6h-苯并[c]苯并吡喃-3-基)氧基)-n-(吡嗪-2-基甲基)乙酰胺身体弯曲(k)为第12天20μm尿石素b头部摆动(l)为第十二天20μm n-(环己基甲基)-2-(6-氧代-6h-苯并[c]苯并吡喃-3-基)氧基)乙酰胺和2-((6-氧代-6h-苯并[c]苯并吡喃-3-基)氧基)-n-(吡嗪-2-基甲基)乙酰胺头部摆动。
[0026]
图4为20μm尿石素b及71g，71k酰胺衍生物对线虫氧化应激能力的影响。其中(a)为20μm尿石素b氧化应激生存曲线(b)为20μm n-(环己基甲基)-2-(6-氧代-6h-苯并[c]苯并吡喃-3-基)氧基)乙酰胺氧化应激生存曲线(c)为20μm 2-((6-氧代-6h-苯并[c]苯并吡喃-3-基)氧基)-n-(吡嗪-2-基甲基)乙酰胺氧化应激生存曲线(d)为20μm尿石素b氧化应激平均寿命(e)为20μm n-(环己基甲基)-2-(6-氧代-6h-苯并[c]苯并吡喃-3-基)氧基)乙酰胺和2-((6-氧代-6h-苯并[c]苯并吡喃-3-基)氧基)-n-(吡嗪-2-基甲基)乙酰胺氧化平均寿命。
[0027]
图5为20μm尿石素b及71g，71k酰胺衍生物对线虫重金属能力评估的影响。其中(a)为20μm尿石素b重金属生存曲线(b)为20μm n-(环己基甲基)-2-(6-氧代-6h-苯并[c]苯并吡喃-3-基)氧基)乙酰胺重金属生存曲线(c)为20μm 2-((6-氧代-6h-苯并[c]苯并吡喃-3-基)氧基)-n-(吡嗪-2-基甲基)乙酰胺重金属生存曲线(d)为20μm尿石素b平均寿命(e)为20μm n-(环己基甲基)-2-(6-氧代-6h-苯并[c]苯并吡喃-3-基)氧基)乙酰胺和2-((6-氧代-6h-苯并[c]苯并吡喃-3-基)氧基)-n-(吡嗪-2-基甲基)乙酰胺平均寿命。
[0028]
图6为20μm尿石素b及71g，71k酰胺衍生物对线虫学习记忆能力的影响。其中(a)为20μm尿石素b学习记忆(b)为20μm n-(环己基甲基)-2-(6-氧代-6h-苯并[c]苯并吡喃-3-基)氧基)乙酰胺和2-((6-氧代-6h-苯并[c]苯并吡喃-3-基)氧基)-n-(吡嗪-2-基甲基)乙酰胺学习记忆。
[0029]
图7为20μm尿石素b及71g，71k酰胺衍生物对大肠杆菌生长状态的影响。其中(a)为尿石素b对对大肠杆菌生长的影响(b)为n-(环己基甲基)-2-(6-氧代-6h-苯并[c]苯并吡
喃-3-基)氧基)乙酰胺对大肠杆菌生长的影响(c)为2-((6-氧代-6h-苯并[c]苯并吡喃-3-基)氧基)-n-(吡嗪-2-基甲基)乙酰胺对大肠杆菌生长状态的影响。
[0030]
图8为测试板示意图。
具体实施方式
[0031]
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
[0032]
1、实验材料与试剂
[0033]
试验中所属的秀丽隐杆线虫株系和大肠杆菌op50均购自于caenorha bd itis genetics center(cgc)；
[0034]
秀丽隐杆线虫株系：野生型n2
[0035]
尿石素b及其酰胺衍生物：合成于常州大学
[0036]
百草枯购自西格玛奥德里齐贸易有限公司，其他试剂均购自于上海生工有限公司
[0037]
ngm培养基：3g nacl,2.5g胰蛋白胨，17g琼脂，磷酸缓冲液25ml,蒸馏水975ml,灭菌121℃、20min，待温度降至50℃-70℃左右，过膜除菌后，加入5mol/l的胆固醇溶液1ml,1mol/l的无水mgso4溶液1ml，1mol/l cacl
2 1ml加入到培养基中，到入平板，待冷却凝固后倒置放于4℃冰箱中。
[0038]
100mmnacl:nacl 5.85g,蛋白胨2.5g,琼脂17g,蒸馏水1l。
[0039]
lb培养基配制：
[0040]
①
液体培养基：分别称取蛋白胨、酵母提取物和nacl 10g、5g和10g，加入蒸馏水定容至1l，121℃，20min灭菌后4℃冰箱备用。
[0041]
②
固体培养基：分别称取蛋白胨、酵母提取物、nacl和琼脂粉10g、5g、10g和17g，加入蒸馏水定容至1l，121℃，20min灭菌后倒平板，待凝固后4℃冰箱备用。
[0042]
m9缓冲液：na2hpo
4 6g，kh2po4 3g，nacl5g，mgso4.7h2o 0.25g，h2o 1l。
[0043]
1mol/l磷酸缓冲液：k2hpo
4 3.56g，kh2po4 10.83g，h2o 100ml。
[0044]
1mg/mlmgso4溶液：取mgso4粉末120.3g，加入蒸馏水，定容至1l，121℃，20min灭菌备用。
[0045]
1mg/mlcacl2溶液：取cacl2粉末110.9g，加入蒸馏水，定容至1l，121℃，20min灭菌备用。
[0046]
5mol/l胆固醇溶液：取0.25g胆固醇溶解于50ml无水乙醇中，使用针式滤器无菌过膜备用。
[0047]
50％甘油：100％甘油5ml于5ml蒸馏水中121℃、20min灭菌，待冷却后放于4℃冰箱中备用。
[0048]
线虫冻存液：nacl 0.3g,kh2po4 0.055g,kh2po
4 0.3g,甘油21.5ml,蒸馏水50ml，121℃，20min灭菌备用。
[0049]
2、方法
[0050]
实施例1:尿石素b酰胺衍生物延长秀丽隐杆线虫寿命
[0051]
试验药物：
[0052]
阴性对照配制0.1％dmso。
[0053]
阳性对照尿石素b及其酰胺衍生物，溶于0.1％dmso，配制成储备液。
[0054]
(1)寿命实验
[0055]
采用同步化的l4期线虫20℃进行恒温培养。溶剂对照组为0.1％dmso，阳性对照组为10-100μm尿石素b。从转移时刻起即可计数，转入当天记为寿命实验第0天。每日记录线虫的存活、死亡和丢失数目，得到各组平均寿命，并对数据进行生存分析。
[0056]
(2)尿石素b与其酰胺衍生物寿命实验
[0057]
尿石素b作为对照，与其酰胺类衍生物在最佳浓度下进行对比，每日记录线虫的存活、死亡和丢失数目，得到各组平均寿命，并对数据进行生存分析。
[0058]
结果分析
[0059]
结果如图1是0.1μm-100μm尿石素b对线虫寿命的影响。以0.1μm、1μm、10μm、20μm、50μm、100μm作为不同浓度的给药组，同时以0.1％dmso为对照组，进行寿命试验。结果显示20μm的尿石素b延长了野生型线虫平均寿命，使得生存曲线右移。其中从图1可知20μm的n2线虫平均寿命达17.42％,图2中71g，71k酰胺衍生物与尿石素b相比，高于阴性对照9.06％和9.96％，且从图中可以看出71g，71k酰胺衍生物比尿石素b长了线虫的寿命时间，本实例说明尿石素b可以延长秀丽隐杆线虫的寿命，在20μm的剂量下，尿石素b抗衰老效果显著的提高了线虫的寿命，但是提高程度低于71g，71k酰胺衍生物。
[0060]
实施例2：尿石素b及酰胺衍生物提高了线虫运动能力
[0061]
试验药物：阴性对照配制0.1％dmso。
[0062]
阳性对照尿石素b及其酰胺衍生物，溶于0.1％dmso，配制成储备液。
[0063]
实验方法
[0064]
运动能力测定
[0065]
采用同步化培养至l4期的线虫给药干预第四天，第八天和第十二天。用m9缓冲液取10条线虫放置在空白的ngm培养基上，待其恢复1min后，记录1min内头部摆动的次数和20s内身体弯曲次数。
[0066]
结果分析
[0067]
给药干预的第四天，第八天和第十二天的线虫20s内身体弯曲的次数和1min内头部摆动的次数如图3所示。20μm的尿石素b分别在第四天，第八天和第十二天线虫的身体弯曲次数和头部摆动次数较对照组有较好的提高，同时如图3所示71g，71k酰胺衍生物与尿石素b对比具有明显的提高效果。本实例说明71g，71k酰胺衍生物比尿石素b能够提高线虫的运动能力，使得其健康状况有所改善，侧面的反应了其具有抗衰老的效果。
[0068]
实施例3：尿石素b及酰胺衍生物提高了线虫的应激能力
[0069]
试验药物：阴性对照配制0.1％dmso。
[0070]
阳性对照尿石素b及其酰胺衍生物，溶于0.1％dmso，配制成储备液。
[0071]
实验方法
[0072]
百草枯氧化应激：采用同步化后培养基至l4期的线虫给药48h后，将其转移至160mm浓度百草枯的液体培养基中，每隔1h记录线虫的死亡数和存活数。
[0073]
结果分析
[0074]
给药干预48h的的线虫氧化应激结果如图4所示。结果显示，20μm的尿石素b给药组
线虫氧化应激较对照组提高了25.46％。71g，71k酰胺衍生物与尿石素b相比，分别高于阴性对照为25.92％，29.32％,同时从图中可看出71g，71k酰胺衍生物提高了线虫应激能力的生存时间，本实例结果说明71g，71k酰胺衍生物比尿石素b提高了线虫的应激能力，具有抗衰老作用。
[0075]
实例4：尿石素b及酰胺衍生物提高了线虫的抗重金属性
[0076]
试验药物：阴性对照配制0.1％dmso。
[0077]
阳性对照尿石素b及其酰胺衍生物，溶于0.1％dmso，配制成储备液。
[0078]
实验方法
[0079]
采用同步化l4期线虫给药48h，48h后加入终浓度为180μm的氯化铜溶液，此后每过一天记录一次线虫的存活数量，直至线虫全部死亡。
[0080]
实验结果
[0081]
给药48h后的线虫的抗重金属性如图5所示。结果显示20μm的尿石素b的平均寿命较对照组相比提高了9.43％，71g，71k酰胺衍生物与尿石素b相比，分别高于阴性对照11.54％，13.63％。本实例的结果说明71g，71k酰胺衍生物比尿石素b具有更好的抗重金属能力的效果。
[0082]
实施例5：尿石素b及酰胺类衍生物提高了线虫的学习能力
[0083]
试验药物：阴性对照配制0.1％dmso。
[0084]
阳性对照尿石素b及其酰胺衍生物，溶于0.1％dmso，配制成储备液。
[0085]
实验方法
[0086]
化学趋向性能力测定
[0087]
采用同步化的l4期线虫分别暴露于实验组和对照组72h，配制100mm nacl培养基高温高压灭菌，将线虫m9冲洗2-3次至新的培养基中饥饿培养4h。用软木钻孔器分别钻取空白培养基以及含有100mm nacl的培养基于测试板中过夜14h，形成趋化板，将待测的线虫转至测试板中，测试板如下图8所示：在距离平板两端0.5cm处用软木钻孔器钻取空白ngm和100mm nacl空白ngm分别作样品和对照的标记，使两点标记与圆心点成一条直线。在圆心两侧2cm的位置画两条直线。测试前加入0.5mol/l的nan3，将线虫转至起始点，1h后测定趋向指数(chemotaxis index)＝(n
a-nc)/n；na＝nacl组线虫数目，nc＝control组线虫数目,n＝线虫总数。
[0088]
结果分析
[0089]
尿石素b及71g，71k酰胺衍生物学习能力如图6所示。可见对照组的学习能力为0.052，20μm尿石素b学习能力为0.32，71g，71k酰胺类衍生物学习能力为0.35，0.41。结果表明，20μm尿石素b及其71g，71k酰胺衍生物可使成年线虫第四天的学习能力有较显著的提高。
[0090]
实例6：20μm尿石素酰胺类衍生物对大肠杆菌生长状态的影响
[0091]
试验药物：阴性对照配制0.1％dmso。
[0092]
阳性对照尿石素b及其酰胺衍生物，溶于0.1％dmso，配制成储备液。
[0093]
实验方法
[0094]
配制高压灭菌后的lb液体培养基，处理如下：1、空白组2、加入op50 3、加入甲氧基尿石素a及其6、7酰胺衍生物4、加入op50及甲氧基尿石素a及其6、7酰胺衍生物。以空白组为
对照，先测加入氧基尿石素a及其6、7酰胺衍生物组，而后将另外两组放到37℃摇床中，于390min内，每隔30min测其再od595处的吸光度并记录绘制大肠杆菌od值生长曲线。
[0095]
结果分析
[0096]
图7是20μm甲氧基尿石素a及其71g，71k酰胺衍生物对大肠杆菌生长状态的影响。如图7所示，加入20μm尿石素b及其71g，71k酰胺衍生物lb液体培养基中op50生长曲线与未加入给药组的lb液体培养基中op50生长曲线相似，本实例结果说明20μm的尿石素b及其71g，71k酰胺衍生物的寿命延长效应与其抗微生物的效果和食物的可用性无关。