一种人参愈伤组织提取物及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于植物组织提取技术领域，涉及一种人参愈伤组织提取物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.人参(panax ginseng)属于三七属、马齿苋科，人参的肉质根为强壮滋补药，适用于调整血压、恢复心脏功能、神经衰弱及身体虚弱等症，也有祛痰、健胃、利尿、兴奋等功效。人参的茎、叶、花，果以及加工副产品都是轻工业的原料，可加工出诸如含有人参成分的烟、酒、茶、晶、膏等商品，而其最主要的功效是卓越的药理作用，并因此在东亚地区被作为一种草药植物广泛使用。人参使用的历史已有2000多年，其在许多药典中扮演了重要的角色，它的生理活性功效主要有新陈代谢调节作用、血压调节作用、免疫功能调节作用、抗肿瘤、抗氧化以及抗衰老作用等。
3.有研究表明，人参提取物可以明显抑制脑和肝中过氧化脂质形成，减少大脑皮层和肝中脂褐素的含量，同时也能增加超氧化物歧化酶和过氧化氢酶在血液中的含量，具有抗氧化作用。此外，人参提取物中的部分单体如rg3、rg2、rb1、rb2、rd、rc、re、rg1等可不同程度地减少体内自由基含量，进而可延缓神经细胞衰老并降低老年发生的记忆损伤，且具有稳定膜结构和增加蛋白质合成作用，可以提高老年人记忆力能力。
4.专利cn 105769955 a公开了一种作为有效成分包含人参皂苷含量得到增进的人参提取物的组合物，通过在人参中添加水、有机溶剂或水和有机溶剂的混合溶剂之后，依次实施加压提取工序及减压提取工序，最终得到提取物，其具有抗炎活性、抗氧化活性、皮肤弹力增进、皱纹改善活性，皮脂分泌抑制活性，毛孔缩小活性或痤疮缓解及痤疮皮肤改善活性。专利申请cn 102512476 a公开了一种复方人参制剂的制备方法及其抗氧化活性，它通过将人参加入70％乙醇室温下浸提，再超声30min，温度为30℃，功率为80w，过滤，滤渣再分别用6倍量与4倍量70％的乙醇重复提取各一次，过滤，得滤液，将滤液合并，回收乙醇，得到人参提取物，将紫球藻干燥物与人参提取物混合均匀，得复方人参制剂，具有良好的抗氧化作用。
5.然而，人参在育种过程当中由于对温度、光度以及湿度等环境条件需要精确的调节，并且为了得到一定大小的人参，需要较长的时间周期。所以后期人们通过利用植物组织培养技术而进行人参培养，即采取少量的组织从而培养成大量的组织，并可以在短期内获得大量营养苗，不会被天气或季节等难控因素所限制，并且在培养过程当中，因保持无菌状态而不需要农药的处理，同时还可以稳定地保持母体组织的营养成分，符合环境保护的理念并具有减少劳动力等经济价值。
6.但是当前现有技术中很少记载人参愈伤组织相关的提取方法及其在抗氧化和抗炎上的应用。


技术实现要素：

7.为了解决上述技术问题，本发明提供了一种人参愈伤组织及其制备方法和应用，在建立有效的提取方法的同时，研究其抗氧化及抗炎的功效，开拓其在化妆品领域的应用。
8.本发明请求保护一种人参愈伤组织提取物，以人参愈伤组织细胞粉为原料，经含醇的提取溶剂预处理后进行酶解制备而成。
9.优选地，所述的醇包括1,3-丁二醇，其浓度为10％-70％。
10.进一步优选地，所述的1,3-丁二醇的浓度为30％。
11.优选地，所述的酶包括纤维素酶和果胶酶。
12.进一步优选地，所述的纤维素酶的添加量为0.5％-2.5％；所述的果胶酶的添加量为0.5％-2.5％；所述的纤维素酶和果胶酶添加的质量比为3-1：1。
13.再进一步优选地，所述的纤维素酶的添加量为1.0％；所述的果胶酶的添加量为1.0％；所述的纤维素酶和果胶酶添加的质量比为1：1。
14.优选地，所述的酶解条件为：温度为40-60℃；ph为4-5；时间为1h-3h。
15.进一步优选地，所述的酶解条件为：温度为50℃；ph为4.5；时间为2h。
16.本发明还提供了一种上述人参愈伤组织提取物的制备方法，包括以下步骤：
17.s1、取一定质量的人参愈伤组织细胞粉，添加含醇的提取溶剂预处理，得到预处理液；
18.s2、向预处理液中加入酶，进行酶解处理，得到酶解液；
19.s3、对酶解液进行热回流处理，冷却后精滤，得到人参愈伤组织提取物。
20.优选地，所述的人参愈伤组织细胞粉的质量为5g。
21.优选地，步骤s1所述的提取溶剂包括水和醇；所述的人参愈伤组织细胞粉与提取溶剂的料液比为1:30-60g/ml。
22.进一步优选地，步骤s1所述的人参愈伤组织细胞粉与提取溶剂的料液比为1:50g/ml。
23.优选地，步骤s3所述热回流的温度为80-120℃；所述热回流的时间为1-3h。
24.进一步优选地，步骤s3所述热回流的温度为100℃；所述热回流的时间为2.5h。
25.优选地，步骤s3所述的精滤条件为使用0.45μm的滤板进行精滤。
26.本发明还提供了一种上述人参愈伤组织提取物或上述的制备方法得到的人参愈伤组织提取物在制备抗氧化和/或抗炎化妆品中的应用。
27.本发明还提供了一种抗氧化的化妆品，包括上述的人参愈伤组织提取物或上述制备方法得到的人参愈伤组织提取物。
28.具体的，所述的抗氧化的化妆品能够清除dpph自由基。
29.本发明还提供了一种抗炎的化妆品，包括上述的人参愈伤组织提取物或上述制备方法得到的人参愈伤组织提取物。
30.具体的，所述的抗炎的化妆品能够抑制炎症因子tnf-a的分泌。
31.相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
32.1、本发明通过醇处理，再通过纤维素酶与果胶酶协同酶解作用，溶解人参中的纤维素和果胶质等物质，能够更高效更充分的提取有效成分，黄酮、多酚含量更高；
33.2、本发明验证提取到的人参愈伤组织提取物具有良好的dpph自由基清除效果，抗
氧化能力强；
34.3.本发明通过细胞实验，验证提取到的人参愈伤组织提取物具有良好的抗炎作用，能显著抑制炎症因子tnf-α的分泌；
附图说明
35.图1为实施例与对比例中黄酮与多酚含量的结果图；
36.图2为实施例与对比例中人参愈伤组织提取物对dpph自由基清除效果图。
具体实施方式
37.以下结合具体实施例对本发明上述的和另外的技术特征和优点作更详细的说明。
38.本发明实施例中所使用的各种化学试剂如无特殊说明均通过常规商业途径获得。
39.下述实施例中，纤维素酶购自biotopped，货号为c6270；果胶酶购自biotopped，货号为p6280；dpph自由基购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司，货号为d4313，人参皂苷rb1购自上海源叶生物技术有限公司，货号b21053。
40.实施例1人参愈伤组织提取物及其制备
41.称取5g人参愈伤组织细胞粉，加入250ml的30％1,3-丁二醇处理，醇处理后添加活性纤维素酶1.0％，添加果胶酶1.0％，在温度50℃，使用柠檬酸和naoh调整ph为4.5，酶解处理2h；之后100℃热回流提取2.5h，冷却后用0.45μm滤板精滤，收集滤液，得人参愈伤组织提取物。
42.实施例2
43.称取5g人参愈伤组织细胞粉，加入250ml的30％1,3-丁二醇处理，醇处理后添加纤维素酶2.5％，添加果胶酶0.5％，在温度50℃，使用柠檬酸和naoh调整ph为4.5，酶解处理2h；之后100℃热回流提取2.5h，冷却后用0.45μm滤板精滤，收集滤液，得人参愈伤组织提取物。
44.实施例3
45.称取5g人参愈伤组织细胞粉，加入250ml的30％1,3-丁二醇处理，醇处理后添加纤维素酶0.5％，添加果胶酶2.5％，在温度50℃，使用柠檬酸和naoh调整ph为4.5，酶解处理2h；之后100℃热回流提取2.5h，冷却后用0.45μm滤板精滤，收集滤液，得人参愈伤组织提取物。
46.实施例4
47.称取5g人参愈伤组织细胞粉，加入250ml的70％1,3-丁二醇处理，醇处理后添加纤维素酶1.0％，添加果胶酶1.0％，在温度40℃，使用柠檬酸和naoh调整ph为4，酶解处理1h；之后80℃热回流提取1h，冷却后用0.45μm滤板精滤，收集滤液，得人参愈伤组织提取物。
48.实施例5
49.称取5g人参愈伤组织细胞粉，加入250ml的10％1,3-丁二醇处理，醇处理后添加纤维素酶1.0％，添加果胶酶1.0％，在温度60℃，使用柠檬酸和naoh调整ph为5，酶解处理3h；之后120℃热回流提取3h，冷却后用0.45μm滤板精滤，收集滤液，得人参愈伤组织提取物。
50.对比例1
51.称取5g人参切片，加入250ml的30％1,3-丁二醇处理，醇处理后添加纤维素酶
1.0％，添加果胶酶1.0％，在温度50℃，使用柠檬酸和naoh调整ph为4.5，酶解处理2h；之后100℃热回流提取2.5h，冷却后用0.45μm滤板精滤，收集滤液，得人参提取物。
52.对比例2
53.称取5g人参愈伤组织细胞粉，加入250ml的30％1,3-丁二醇处理，醇处理后100℃热回流提取2.5h，得到提取液，添加活性纤维素酶1.0％，添加果胶酶1.0％，在温度50℃，使用柠檬酸和naoh调整ph为4.5，酶解处理2h后，用0.45μm滤板精滤，收集滤液，得人参愈伤组织提取物。
54.对比例3
55.称取5g人参愈伤组织细胞粉，加入175ml水，添加纤维素酶1.0％，添加果胶酶1.0％，在温度50℃，使用柠檬酸和naoh调整ph为4.5，酶解预处理2h；酶解后，加入75ml的1,3-丁二醇；100℃热回流提取2.5h，冷却后用0.45μm滤板精滤，收集滤液，得人参愈伤组织提取物。
56.对比例4
57.称取5g人参愈伤组织细胞粉，加入250ml的90％1,3-丁二醇处理，醇处理后添加纤维素酶0.4％，添加果胶酶3％，在温度50℃，使用柠檬酸和naoh调整ph为4.5，酶解处理2h；之后100℃热回流提取2.5h，冷却后用0.45μm滤板精滤，收集滤液，得人参愈伤组织提取物。
58.在一定浓度范围内，黄酮、多酚等活性成分含量越高，抗氧化及抗炎作用越好。在实施例与对比例中，实施例1-5的黄酮、多酚含量明显高于对比例1-4，具体结果如图1所示。
59.本发明公开一种上述制得的人参愈伤组织提取物的应用。
60.1、对dpph自由基清除实验
61.(1)dpph乙醇溶液的配置：
62.称取20mg dpph，加入无水乙醇溶解并定容于250ml容量瓶中，dpph浓度配制为2
×
10-4
mol/l；0-4℃下避光保存，现配现用，4h内有效。阳性对照选用维生素c，浓度为0.5mg/ml。
63.(2)待测液的配置：
64.将上述实施例1-5和对比例1-5的提取物与人参皂苷rb1分别用无水乙醇稀释为0.50％、1.0％、2.0％、5.0％浓度的待测溶液。
65.(3)实验步骤：
66.按表1加入各试剂。
67.1)取1ml的待测液与1ml的2
×
10-4
mol/l的dpph溶液混匀，编号管a；
68.2)取1ml的无水乙醇溶剂与1ml的2
×
10-4
mol/l的dpph溶液混匀，编号管b；
69.3)取1ml的溶剂与1ml的待测液混匀，编号管c；
70.4)避光反应30min后，在517nm下测管a、b、c的吸光度值。
71.5)根据dpph自由基抑制率的计算公式：dpph抑制率(％)＝(b+c-a)/b，计算dpph的抑制率。
72.表1试剂配比表
[0073][0074]
从图2可以看出，人参愈伤组织提取物具有抑制dpph自由基的作用，与人参皂苷rb1和对比例1-5相比，实施例1-5得到的人参愈伤组织提取物的抑制效果明显更高。
[0075]
2、对痤疮丙酸杆菌相关炎症细胞模型中炎症因子tnf-α的抑制活性实验
[0076]
将hacat细胞以2
×
105cells/ml的密度接种于96孔板中，每孔200μl。在37℃、5％co2条件下培养12h至贴壁后，吸出培养基，进行痤疮丙酸杆菌诱导加样，具体步骤如下：
[0077]
设置空白组、模型组及样品组；空白组接入200μl无血清培养基；模型组接入200μl无血清培养基培养4h后，加入浓度为2
×
108cfu/ml的痤疮丙酸杆菌刺激物20μl；样品组接入200μl样品培养基(用无血清培养基将提取物稀释为1.0％浓度)培养4h后，加入浓度为2
×
108cfu/ml痤疮丙酸杆菌刺激物20μl。
[0078]
将96孔板置于培养箱37，5％co2环境中培养24h，收集细胞上清液，进行tnf-a含量检测。
[0079]
表2人参愈伤组织提取物对tnf-a分泌的影响
[0080][0081]
模型组与空白组对比，p＜0.05(#)表示差异显著，p＜0.01(##)表示差异极显著。
[0082]
样品组与模型组比较，p《0.05(*)表示差异显著，p《0.01(**)表示差异极显著。
[0083]
从表2可以看出，采用痤疮丙酸杆菌诱导hacat细胞炎症因子高表达模型，通过检测tnf-a含量，相比人参皂苷rb1和对比例1-5，实施例1-5得到的人参愈伤组织提取物能够显著抑制炎症因子tnf-a的分泌，说明人参愈伤组织提取物具有抗炎功效。
[0084]
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。